1.本发明属于植物组织培养领域，具有涉及一种高抗病性赤芍的组织培养方法。
背景技术：
2.芍药为毛茛科芍药属多年生草本植物，是我国著名的观赏和药用植物，其根入药，分“赤芍”、“白芍”两种，前者善清热凉血、散瘀止痛、清泄肝火；后者善养血调经、柔肝止痛。芍药的传统繁殖方法是分株法和播种法，但是传统方法具有周期长、效率低、繁殖系数低的缺点，不能很好地保持母本的优良性状，严重影响了芍药的规模化生产。
3.植物组织培养是植物快速繁殖的一种最为有效的方法，与传统繁殖方法相比，组织培养既能保持原有品种和优良性状，扩大其繁殖系数，缩短育种周期，又不受季节的影响可以周年运转，大幅度地提高了繁殖的效率，便于进行大规模生产。然而，目前芍药的组织培养过程中依然存在组培苗生根困难、易受细菌或真菌污染、褐化严重、继代培养后抗性缺失、难以与母本品质一致等问题，导致人工繁殖得到的芍药苗的抗病性差、容易感染、成活率低，严重制约了芍药组织培养的发展。
4.因此，研究一种新的赤芍组织培养的方法，克服现有技术存在的生根难、污染、褐化、继代培养后抗性缺失、难以与母本品质一致等问题成为目前迫切需要解决的技术难题。
技术实现要素：
5.为了克服现有技术存在的不足，本发明提供一种高抗病性赤芍的组织培养方法，通过对赤芍组织培养工艺的调整，解决了生根难、污染、褐化、继代培养后抗性缺失、难以与母本品质一致等问题，为之后的赤芍愈伤组织分化与植株的驯化奠定良好基础，且操作简单、成本低廉，有着良好的市场前景，能为芍药的育种和生长提供良好的帮助。
6.为了实现上述目的，本发明采用如下的技术方法，一种高抗病性赤芍的组织培养方法，包括以下步骤：
7.(1)获取外植体
8.选取芍药的带芽茎段，用无菌水冲洗1-2遍，再用75wt％的乙醇浸泡10-20s，取出后再用0.5wt％的升汞溶液浸泡5-10min，取出后将带芽茎段切割为2-3cm长的小段；
9.(2)制备愈伤组织
10.将步骤(1)得到的小段置于萌发培养基中进行愈伤组织的诱导萌发，所述萌芽培养基以1/2ms培养基为基础培养基，另添加终浓度为500-600mg/l的cacl2、0.8-1.5mg/l的6-ba、0.3-0.5mg/l的naa，0.2-0.5mg/l的ga3、0.8-1.5g/l的pvp、10-15g/l的琼脂和30-40g/l的葡萄糖；首先暗培养7-10d，温度为25
±
2℃，然后进行光照培养23-28d，所述光照培养条件是光照时间13-14h/d，光照强度1400-1500lux；
11.(3)感染处理
12.将步骤(2)中诱导得到的愈伤组织从外植体上切下置于感染培养基中进行感染处理，所述感染培养基以1/2ms培养基为基础培养基，另添加终浓度为500-600mg/l的cacl2、
0.8-1.5mg/l的6-ba、0.3-0.5mg/l的naa，0.2-0.5mg/l的ga3、0.8-1.5g/l的pvp、10-15g/l的琼脂和30-40g/l的葡萄糖；
13.首先，向步骤(2)制备得到的愈伤组织喷洒处理菌液，第一次喷洒2-4ml，间隔12小时后再次喷洒5-8ml，然而，控制温度为25
±
2℃，进行光照培养12-15d，所述光照培养条件是光照时间13-14h/d，光照强度1800-2000lux；
14.(4)诱导不定芽
15.将步骤(3)中得到的愈伤组织切块置于分化培养基进行不定芽的分化，所述分化培养基以1/2ms培养基为基础培养基，另添加终浓度为600-700mg/l的cacl2、4-8mg/l的6-ba、0.4-0.8mg/l的naa，0.4-0.6mg/l的ga3、8-15g/l的琼脂和30-40g/l的蔗糖；进行光照培养25-30d，所述光照培养条件是光照时间10-14h/d，光照强度1300-1500lux；
16.(5)增殖培养
17.将步骤(4)诱导得到的不定芽切割后置于增殖培养基中进行增殖继代培养25-30d，得到无根苗，所述增殖培养基以1/2ms培养基为基础培养基，另添加终浓度为500-600mg/l的cacl2、3-5mg/l的tdz、0.3-0.8mg/l的iba，0.1-0.2mg/l的ga3、0.5-1.5g/l的pvp、5-10g/l的琼脂和30-40g/l的蔗糖；进行光照培养，所述光照培养条件是光照时间10-14h/d，光照强度1800-2000lux；
18.(6)生根壮苗
19.将步骤(5)得到的无根苗置入生根培养基中进行培养，所述生根培养基以1/2ms培养基为基础培养基，另添加终浓度为600-800mg/l的cacl2、3-5mg/l的tdz、0.3-0.8mg/l的iba，0.1-0.2mg/l的ga3、0.5-1.5g/l的pvp、5-10g/l的琼脂和30-40g/l的蔗糖；
20.(7)炼苗
21.待不定根长满瓶底，植株整体生长稳健时，打开瓶口虚盖炼苗3-5d，待组培苗适应后，完全开瓶口3-5d，组培苗完全适应外部环境；将组培苗拔出，将根浸泡在生根制剂中浸泡20-30min；
22.(8)移栽
23.将步骤(7)的组培苗移栽入穴盘内，穴盘内填充基质体积比为进口泥炭:珍珠岩:蛭石:生物炭:细沙＝6:1:1:3:2，少量浇水，放置于大棚内进行生长，大棚内温度为20
±
2℃，湿度为85
±
5％。
24.优选地，所述步骤(1)中，在乙醇浸泡或升汞浸泡结束后，用无菌水清洗4-5次；
25.优选地，所述步骤(2)中，光照选用红光进行照射；
26.优选地，所述步骤(3)中，所述处理菌液含有黑腐病、黑斑病、叶斑病、褐斑病与枯萎病病菌其中的一种或多种；所述处理菌液的制备方法包括以下步骤：将感染病菌的芍药叶片剪碎置于容器中，加入叶片质量的1-2倍的2-3wt％葡萄糖溶液，升温至35℃浸泡30-45min，过滤除杂后向滤液中加入滤液质量20倍的水，然后加入叶片质量的1-2倍的艾叶提取液共同加热到50℃保温20min，过滤得到处理菌液；
27.优选地，所述步骤(3)中，光照选用红光进行照射；
28.优选地，所述步骤(4)中，光照选用红光进行照射；
29.优选地，所述步骤(5)中，光照选用红光进行照射；
30.优选地，所述步骤(6)中的生根培养基中添加生根培养基重量0.5-1％的活性炭；
31.优选地，所述步骤(7)中的生根制剂为微生物促生根剂。
32.与现有技术相比，本发明具有以下的有益效果：
33.(1)本发明通过对芍药外植体的表面消毒、愈伤组织的培养、以及对不同阶段培养基的组成进行优化调整，解决了生根难、污染、褐化、继代培养后抗性缺失、难以与母本品质一致等问题，为之后的赤芍愈伤组织分化与植株的驯化奠定良好基础，且操作简单、成本低廉，有着良好的市场前景，能为芍药的育种和生长提供良好的帮助。
34.(2)本发明在赤芍组织培养与快速繁殖的过程中，对生长素和细胞分裂素的种类和组成进行及时调整，提高了组织培养的效率，促进赤芍组培苗的生长，避免出现褐化和污染现象，以及加了pvp能够极大的改善赤芍组织培养过程中存在的褐化问题。
35.(3)本发明通过对愈伤组织喷洒处理菌液，避免处理菌液对带芽茎段的过度刺激，导致带芽茎段活性消失，且愈伤组织的细胞代谢速度快，对处理菌液的抗性大，不易受到菌液中致病细菌的感染死亡。
具体实施方式
36.为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为了进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。本发明所有原料，对其来源没有特别限制，在市场上购买的或按照本领域技术人员熟知的常规方法制备的即可。
37.实施例1
38.一种高抗病性赤芍的组织培养方法，包括以下步骤：
39.(1)获取外植体
40.选取芍药的带芽茎段，用无菌水冲洗2遍，再用75wt％的乙醇浸泡15s，取出后用无菌水清洗4遍，再用0.5wt％的升汞溶液浸泡10min，再用无菌水清洗5遍，取出后将带芽茎段切割为2cm长的小段；
41.(2)制备愈伤组织
42.将步骤(1)得到的小段置于萌发培养基中进行愈伤组织的诱导萌发，所述萌芽培养基以1/2ms培养基为基础培养基，另添加终浓度为600mg/l的cacl2、1.5mg/l的6-ba、0.5mg/l的naa，0.5mg/l的ga3、0.8g/l的pvp、15g/l的琼脂和40g/l的葡萄糖；首先暗培养10d，温度为25
±
2℃，然后进行光照培养28d，所述光照培养条件是光照时间14h/d，光照强度1400lux；
43.(3)感染处理
44.将步骤(2)中诱导得到的愈伤组织从外植体上切下置于感染培养基中进行感染处理，所述感染培养基以1/2ms培养基为基础培养基，另添加终浓度为500mg/l的cacl2、1.5mg/l的6-ba、0.3mg/l的naa，0.5mg/l的ga3、1.5g/l的pvp、10g/l的琼脂和40g/l的葡萄糖；
45.首先，向步骤(2)制备得到的愈伤组织喷洒处理菌液，第一次喷洒4ml，间隔12小时后再次喷洒8ml，然而，控制温度为25
±
2℃，进行光照培养15d，所述光照培养条件是光照时间14h/d，光照强度2000lux；
46.(4)诱导不定芽
47.将步骤(3)中得到的愈伤组织切块置于分化培养基进行不定芽的分化，所述分化培养基以1/2ms培养基为基础培养基，另添加终浓度为600mg/l的cacl2、8mg/l的6-ba、0.8mg/l的naa，0.6mg/l的ga3、15g/l的琼脂和30g/l的蔗糖；进行光照培养30d，所述光照培养条件是光照时间14h/d，光照强度1300lux；
48.(5)增殖培养
49.将步骤(4)诱导得到的不定芽切割后置于增殖培养基中进行增殖继代培养30d，得到无根苗，所述增殖培养基以1/2ms培养基为基础培养基，另添加终浓度为600mg/l的cacl2、5mg/l的tdz、0.8mg/l的iba，0.2mg/l的ga3、1.5g/l的pvp、8g/l的琼脂和35g/l的蔗糖；进行光照培养，所述光照培养条件是光照时间10h/d，光照强度2000lux；
50.(6)生根壮苗
51.将步骤(5)得到的无根苗置入生根培养基中进行培养，所述生根培养基以1/2ms培养基为基础培养基，另添加终浓度为800mg/l的cacl2、5mg/l的tdz、0.8mg/l的iba，0.1mg/l的ga3、1.2g/l的pvp、5g/l的琼脂和30g/l的蔗糖；
52.(7)炼苗
53.待不定根长满瓶底，植株整体生长稳健时，打开瓶口虚盖炼苗3d，待组培苗适应后，完全开瓶口5d，组培苗完全适应外部环境；将组培苗拔出，将根浸泡在生根制剂中浸泡30min；
54.(8)移栽
55.将步骤(7)的组培苗移栽入穴盘内，穴盘内填充基质体积比为进口泥炭:珍珠岩:蛭石:生物炭:细沙＝6:1:1:3:2，少量浇水，放置于大棚内进行生长，大棚内温度为20
±
2℃，湿度为85
±
5％。
56.所述步骤(2)中，光照选用红光进行照射；
57.所述步骤(3)中，所述处理菌液含有黑腐病病菌；所述处理菌液的制备方法包括以下步骤：将感染病菌的芍药叶片剪碎置于容器中，加入叶片质量的1倍的2wt％葡萄糖溶液，升温至35℃浸泡45min，过滤除杂后向滤液中加入滤液质量20倍的水，然后加入叶片质量的2倍的艾叶提取液共同加热到50℃保温20min，过滤得到处理菌液；
58.所述步骤(3)-(5)中，光照选用红光进行照射；所述步骤(6)中的生根培养基中添加生根培养基重量1％的活性炭；所述步骤(7)中的生根制剂为微生物促生根剂。
59.实施例2
60.一种高抗病性赤芍的组织培养方法，包括以下步骤：
61.(1)获取外植体
62.选取芍药的带芽茎段，用无菌水冲洗2遍，再用75wt％的乙醇浸泡10s，取出后用无菌水清洗5遍再用0.5wt％的升汞溶液浸泡10min，取出后用无菌水清洗4遍，将带芽茎段切割为3cm长的小段；
63.(2)制备愈伤组织
64.将步骤(1)得到的小段置于萌发培养基中进行愈伤组织的诱导萌发，所述萌芽培养基以1/2ms培养基为基础培养基，另添加终浓度为550mg/l的cacl2、0.9mg/l的6-ba、0.4mg/l的naa，0.2-0.5mg/l的ga3、0.8g/l的pvp、12g/l的琼脂和35g/l的葡萄糖；首先暗培养7d，温度为25
±
2℃，然后进行光照培养25d，所述光照培养条件是光照时间13h/d，光照强
度1500lux；
65.(3)感染处理
66.将步骤(2)中诱导得到的愈伤组织从外植体上切下置于感染培养基中进行感染处理，所述感染培养基以1/2ms培养基为基础培养基，另添加终浓度为600mg/l的cacl2、1.5mg/l的6-ba、0.3mg/l的naa，0.4mg/l的ga3、1.1g/l的pvp、12g/l的琼脂和38g/l的葡萄糖；
67.首先，向步骤(2)制备得到的愈伤组织喷洒处理菌液，第一次喷洒2ml，间隔12小时后再次喷洒8ml，然而，控制温度为25
±
2℃，进行光照培养15d，所述光照培养条件是光照时间14h/d，光照强度1800lux；
68.(4)诱导不定芽
69.将步骤(3)中得到的愈伤组织切块置于分化培养基进行不定芽的分化，所述分化培养基以1/2ms培养基为基础培养基，另添加终浓度为650mg/l的cacl2、8mg/l的6-ba、0.6mg/l的naa，0.5mg/l的ga3、10g/l的琼脂和340g/l的蔗糖；进行光照培养25d，所述光照培养条件是光照时间12h/d，光照强度1500lux；
70.(5)增殖培养
71.将步骤(4)诱导得到的不定芽切割后置于增殖培养基中进行增殖继代培养25d，得到无根苗，所述增殖培养基以1/2ms培养基为基础培养基，另添加终浓度为500mg/l的cacl2、3mg/l的tdz、0.6mg/l的iba，0.1mg/l的ga3、0.5g/l的pvp、10g/l的琼脂和40g/l的蔗糖；进行光照培养，所述光照培养条件是光照时间14h/d，光照强度2000lux；
72.(6)生根壮苗
73.将步骤(5)得到的无根苗置入生根培养基中进行培养，所述生根培养基以1/2ms培养基为基础培养基，另添加终浓度800mg/l的cacl2、5mg/l的tdz、0.8mg/l的iba，0.1mg/l的ga3、1.5g/l的pvp、5g/l的琼脂和40g/l的蔗糖；
74.(7)炼苗
75.待不定根长满瓶底，植株整体生长稳健时，打开瓶口虚盖炼苗4d，待组培苗适应后，完全开瓶口3d，组培苗完全适应外部环境；将组培苗拔出，将根浸泡在生根制剂中浸泡20min；
76.(8)移栽
77.将步骤(7)的组培苗移栽入穴盘内，穴盘内填充基质体积比为进口泥炭:珍珠岩:蛭石:生物炭:细沙＝6:1:1:3:2，少量浇水，放置于大棚内进行生长，大棚内温度为20
±
2℃，湿度为85
±
5％。
78.所述步骤(2)-(5)中，光照选用红光进行照射；
79.所述步骤(3)中，所述处理菌液含有褐斑病病菌；所述处理菌液的制备方法包括以下步骤：将感染病菌的芍药叶片剪碎置于容器中，加入叶片质量的2倍的3wt％葡萄糖溶液，升温至35℃浸泡30min，过滤除杂后向滤液中加入滤液质量20倍的水，然后加入叶片质量的2倍的艾叶提取液共同加热到50℃保温20min，过滤得到处理菌液；所述步骤(6)中的生根培养基中添加生根培养基重量1％的活性炭；所述步骤(7)中的生根制剂为微生物促生根剂。
80.实施例3
81.一种高抗病性赤芍的组织培养方法，包括以下步骤：
℃，湿度为85
±
5％。
99.所述步骤(2)-(5)中，光照选用红光进行照射；所述步骤(3)中，所述处理菌液含有叶斑病病菌；所述处理菌液的制备方法包括以下步骤：将感染病菌的芍药叶片剪碎置于容器中，加入，加入叶片质量的2倍的2wt％葡萄糖溶液，升温至35℃浸泡30min，过滤除杂后向滤液中加入滤液质量20倍的水，然后加入叶片质量的2倍的艾叶提取液共同加热到50℃保温20min，过滤得到处理菌液；所述步骤(6)中的生根培养基中添加生根培养基重量0.5％的活性炭；所述步骤(7)中的生根制剂为微生物促生根剂。
100.实施例4
101.一种高抗病性赤芍的组织培养方法，包括以下步骤：
102.(1)获取外植体
103.选取芍药的带芽茎段，用无菌水冲洗2遍，再用75wt％的乙醇浸泡20s，取出后用无菌水清洗4遍再用0.5wt％的升汞溶液浸泡10min，取出后用无菌水清洗5遍，将带芽茎段切割为3cm长的小段；
104.(2)制备愈伤组织
105.将步骤(1)得到的小段置于萌发培养基中进行愈伤组织的诱导萌发，所述萌芽培养基以1/2ms培养基为基础培养基，另添加终浓度为580mg/l的cacl2、1.2mg/l的6-ba、0.5mg/l的naa，0.4mg/l的ga3、1.2g/l的pvp、13g/l的琼脂和38g/l的葡萄糖；首先暗培养8d，温度为25
±
2℃，然后进行光照培养25d，所述光照培养条件是光照时间14h/d，光照强度1400lux；
106.(3)感染处理
107.将步骤(2)中诱导得到的愈伤组织从外植体上切下置于感染培养基中进行感染处理，所述感染培养基以1/2ms培养基为基础培养基，另添加终浓度为590mg/l的cacl2、1.3mg/l的6-ba、0.4mg/l的naa，0.2mg/l的ga3、1.3g/l的pvp、11g/l的琼脂和37g/l的葡萄糖；
108.首先，向步骤(2)制备得到的愈伤组织喷洒处理菌液，第一次喷洒4ml，间隔12小时后再次喷洒5ml，然而，控制温度为25
±
2℃，进行光照培养15d，所述光照培养条件是光照时间13h/d，光照强度2000lux；
109.(4)诱导不定芽
110.将步骤(3)中得到的愈伤组织切块置于分化培养基进行不定芽的分化，所述分化培养基以1/2ms培养基为基础培养基，另添加终浓度为680mg/l的cacl2、8mg/l的6-ba、0.8mg/l的naa，0.5mg/l的ga3、15g/l的琼脂和40g/l的蔗糖；进行光照培养26d，所述光照培养条件是光照时间14h/d，光照强度1400lux；
111.(5)增殖培养
112.将步骤(4)诱导得到的不定芽切割后置于增殖培养基中进行增殖继代培养28d，得到无根苗，所述增殖培养基以1/2ms培养基为基础培养基，另添加终浓度为600mg/l的cacl2、5mg/l的tdz、0.8mg/l的iba，0.2mg/l的ga3、1.5g/l的pvp、10g/l的琼脂和36g/l的蔗糖；进行光照培养，所述光照培养条件是光照时间13h/d，光照强度1900lux；
113.(6)生根壮苗
114.将步骤(5)得到的无根苗置入生根培养基中进行培养，所述生根培养基以1/2ms培
养基为基础培养基，另添加终浓度为700mg/l的cacl2、5mg/l的tdz、0.6mg/l的iba，0.2mg/l的ga3、1.5g/l的pvp、8g/l的琼脂和33g/l的蔗糖；
115.(7)炼苗
116.待不定根长满瓶底，植株整体生长稳健时，打开瓶口虚盖炼苗4d，待组培苗适应后，完全开瓶口5d，组培苗完全适应外部环境；将组培苗拔出，将根浸泡在生根制剂中浸泡26min；
117.(8)移栽
118.将步骤(7)的组培苗移栽入穴盘内，穴盘内填充基质体积比为进口泥炭:珍珠岩:蛭石:生物炭:细沙＝6:1:1:3:2，少量浇水，放置于大棚内进行生长，大棚内温度为20
±
2℃，湿度为85
±
5％。
119.所述步骤(2)-(5)中，光照选用红光进行照射；所述步骤(3)中，所述处理菌液含有枯萎病病菌；所述处理菌液的制备方法包括以下步骤：将感染病菌的芍药叶片剪碎置于容器中加入叶片质量的2倍的2-3wt％葡萄糖溶液，升温至35℃浸泡30min，过滤除杂后向滤液中加入滤液质量20倍的水，然后加入叶片质量的1倍的艾叶提取液共同加热到50℃保温20min，过滤得到处理菌液；所述步骤(6)中的生根培养基中添加生根培养基重量0.8％的活性炭；所述步骤(7)中的生根制剂为微生物促生根剂。
120.本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。