专利名称：：限定的细胞培养表面及其使用方法
技术领域：
：本发明涉及用于培养细胞的限定的(defined)表面。特别是，本发明提供了对在限定的细胞培养表面培养胚胎干细胞和其他成体干细胞所需的材料和方法。
背景技术：
：人类胚胎干细胞(hES)通常需要基底和培养基以保持无限期自我更新和多能性的特点。最常见的培养hES细胞的基底是生长在组织培养(TC)聚苯乙烯表面或涂覆有细胞外基质(ECM)的TC培养容器，例如BDMatriger涂覆的TC培养容器上的不活跃的成纤维细胞饲养细胞的单层。对这两种基底的限定都不佳，并且存在高度的实验变异性。由于人胚胎干细胞(hES)被认为在促进发育生物学知识、药物发现方面具有显著有效的影响，并且在今后的临床应用中可能发挥重要作用，因此鉴定这些细胞在限定的表面上的培养条件是非常重要的。发明概述—方面，本发明提供了一种细胞培养基底，包括具有薄膜粘附于其上的细胞培养表面，其中所述薄膜包含一种或多种等离子聚合单体；以及在涂覆有薄膜的表面上的涂层，该涂层(coating)从包括一种或多种细胞外基质蛋白和水性溶剂的涂覆溶液(coatingsolution)中沉积形成，其中涂覆溶液中总细胞外基质蛋白的浓度为约lng/mL到约lmg/mL。在其他方面，本发明还提供了一种制备细胞培养基底的方法，包括提供细胞培养表面；将薄膜等离子聚合到该表面上以形成涂覆有薄膜的表面，其中等离子聚合利用一种或多种单体；以及引入涂覆溶液到薄膜涂覆的表面以形成细胞培养基底，该涂覆溶液包括一种或多种细胞外基质蛋白和水性溶剂，其中涂覆溶液中总细胞外基质蛋白的浓度为约Ing/mL至U约lmg/mL。在某些方面，本发明提供了一种培养干细胞的方法，包括提供细胞培养基底；将干细胞的悬浮液应用至细胞培养基底；在37t:，含5X二氧化碳的潮湿空气条件中孵育在所述细胞培养基底上的干细胞；以及允许干细胞粘附在所述细胞培养基底上，其中粘附的细胞主要保持在未分化状态。除非在介质中使用特定的分化因子诱导分化(例如实施例10)。更有利的一方面，本发明还可能提供了一种使干细胞具有良好的粘附特性、同时又有利于避免干细胞分化的细胞培养基底。附图简述图1:比较描述接种于各种基底上的结晶紫染色的人胚胎干细胞(hES)的细胞集落粘附情况涂覆有细胞外基质，更具体地说，MatrigelTM，一种复杂的细胞外基质蛋白混合物(图1A)的组织培养(TC)处理的聚苯乙烯培养板，涂覆有人纤维连接蛋白TC处理的聚苯乙烯培养板(图IB);和涂覆有人纤连蛋白(图1C)和生长介质的等离子聚合培养板。图2比较在选择的基底上的典型hES细胞的集落形态学传代18代之后的，涂覆有细胞外基质(如，Matrigel)的TC培养板(图2A)，和涂覆有人纤连蛋白的等离子聚合培养板(图2B)。图3未分化的hES细胞(H9系)的免疫细胞化学染色，其在核内表达0CT-3/4标志蛋白。细胞用生长介质培养，分别在涂覆有人纤连蛋白的等离子聚合培养板(图3B)和涂覆有细胞外基质(如，Matrigel)的TC培养板(阳性对照，图3A)上培养。图4生长在涂覆有人纤连蛋白的等离子聚合培养板和涂覆有细胞外基质(如，Matrigel)的TC培养板(阳性对照)上的未分化的hES细胞特异性标志蛋白的表达情况的定量荧光活化细胞分检器(FACS))分析。图5生长在涂覆有人纤连蛋白的等离子聚合培养板和涂覆有细胞外基质(如Matrigel)的TC培养板(阳性对照)上的hES细胞形成的胚状体中，种系特异性标志物基因的表达情况的定量实时聚合酶链式反应(QRT-PCR)分析。图6在hES细胞来源的分化的细胞中，种系特异性标志蛋白的表达情况的免疫细胞化学染色分析。图7集中于层中的hFN的图像表示及示意图。图7A对涂覆有不同浓度的人纤连蛋白的等离子聚合培养板和TC培养板上结合的纤连蛋白含量的比较，并通过抗人纤连蛋白ELISA检测。图7B在涂覆有人纤连蛋白的等离子聚合培养板上生长3天的hES细胞(H9系)的结晶紫染色。图8人间充质干细胞(MSC)在含血清的MSC介质中在组织培养培养板(图8A)上和在无血清的MSC介质中在涂覆有人纤连蛋白的等离子聚合培养板(图8B)上的粘附情况和生长情况的比较。图9人间充质干细胞(MSC)分化成脂肪细胞的分化潜能的比较。将传代5代后的MSCs接种于未涂覆的组织培养培养板上(图9A)或接种于涂覆有人纤连蛋白的等离子聚合培养板上，并用脂肪形成介质诱导(图9B)。铺在组织培养板上的细胞之前用含血清的介质进行培养。铺在涂覆有纤连蛋白的等离子聚合培养板上的细胞之前在同样表面用不含血清的MSC介质进行培养。图10hES细胞来源的神经元干细胞在组织培养板和等离子聚合培养板上的粘附情况和生长情况的比较。将细胞接种在未涂覆的组织培养培养板(图10a)，顺序涂覆有多聚鸟氨酸和层粘连蛋白的组织培养培养板(图10b)，未涂覆的等离子聚合培养板(图10c)和涂覆有人纤连蛋白的等离子聚合培养板(图10d)上。图11hES细胞来源的神经元干细胞在组织培养培养板、涂覆有或未涂覆各种ECM蛋白的等离子聚合培养板上的粘附情况和生长情况的比较。图12该图表描述了MTS测定法检测hES细胞来源的神经元干细胞的生存能力。发明详述本发明提供了一种限定的细胞培养基底，该基底能够在更长的时间培养中，使得处于未分化状态的干细胞繁殖，并且维持其自我更新与多能性的特点。本发明的限定的培养表面与标准的培养基底例如组织培养处理的基底相比，能够促进处于未分化状态的人胚胎干细胞以及间充质干细胞和神经元干细胞更有效的粘附与扩展。在一些具体实施方案中，从所述限定的细胞培养表面上繁殖hES细胞、人骨髓来源的间充质干细胞和hES细胞来源的神经元干细胞。在一些具体实施方式中，所述限定的细胞培养表面无异物。本发明提供了一种细胞培养表面。优选的，该细胞培养表面限定在培养皿上。细胞培养表面可以限定在细胞培养容器或其他结构中的介质上。细胞培养表面的材料可以包括塑料(例如凍苯乙烯，丙烯腈丁二烯苯乙烯，和聚碳酸脂)；玻璃；微孔过滤器(例如，纤维素，尼龙，玻璃纤维，聚酯，和聚碳酸酯)；在批量或连续细胞培养或者基因工程中作为生物反应器的材料(例如生物反应器)，其中包括中空纤维管或微载体珠；聚四氟乙烯(特氟龙逸)，陶瓷和相关聚合材料。任何以上所列举的材料以及其他材料都适用于本发明。用于所述细胞培养表面的材料可能选自于纤维素、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚四氟乙烯、尼龙、玻璃、聚对苯二甲酸乙二醇酯，聚甲基戊烷，聚丙烯，聚乙烯及其组合。这些材料均为多孔的或非多孔的。为了说明本发明，细胞培养或培养容器都应纳入本文参考。可以理解，本发明可以应用于各种细胞培养表面，包括但不限于存在于细胞培养容器中的介质上限定的表面，如微珠，微孔过滤器或其他过滤或者结合介质。优选的，所述细胞培养表面是由聚苯乙烯形成的。可以预计任何用于粘附培养的培养容器都可以使用。本发明预计的优选的细胞培养容器配置包括多孔培养板(例如6孔、12孔和24孔培养板)，培养皿(例如有盖培养皿)，实验试管，培养瓶，滚瓶，试管或摇瓶，或其他类似物。所述细胞培养表面涂覆有等离子聚合薄膜。等离子体聚合物来源是一种或多种单体。可利用的聚合单体包括不饱和有机化合物，如烯胺、卣化烯烃、烯羧酸和羧酸酯、烯腈化合物、氧合的烯烃和烯碳氢化合物。某些具体实施方式中，烯烃可包括乙烯基和烯丙基形式。在另一些具体实施方式中，可以使用环化合物，如环己烷，环戊烷和环丙烷。本领域技术人员所公知的，各种等离子聚合技术可以用于将一种或多种单体置于细胞培养表面上。优选的，是在表面上放置带正电荷的聚合膜。本领域技术人员应当理解，等离子聚合表面也可能带负电荷，这取决于被使用的蛋白质。胺优选地用作聚合物的单体来源。在一些具体实施方式中，采用等离子体源来制做等离子体聚合单体以产生气体放电，从而提供能量以启动气态单体的聚合反应，并能够在培养容器表面上沉积形成聚合物薄膜。可以利用环状化合物，其可通过辉光放电的方法包含气体等离子体。这些环状化合物的衍生物，例如1，2-二胺环己烷，也在气体等离子体中通常是可聚合的。特别优选的是，等离子可聚合单体包含羟基，胺或羧酸基团。该聚合物膜可从由丙烯酸、甲基丙烯酸，醋酸和乙烯基乙酸的含羧酸的单体的组得到，所述单体包括但不限于含有可聚合羧酸的乙烯基单体。通常的胺单体包括多达20个碳原子(一般大多是2至8个碳)的完全饱和和不饱和胺化合物。烯键式不饱和化合物(尤其是伯，仲或叔胺)包括烯丙胺，而饱和单体，包括甲胺，丙胺，庚胺和二氨基丙烷。这些中，通过使用烯丙基胺和二胺可得到特别有利的结果。也可使用可聚合单体的混合物。另外，可聚合单体可与其他一般本身不视为可聚合的气体混合，例如氩气、氮气和氢气。本发明中一个方面，聚合物包括胺共聚物(聚合两种或两种以上的单体)。该共聚物是由有机胺与饱和(烷烃)或不饱和(烯烃，二烯或炔烃)碳氢化合物进行等离子聚合形成的。该碳氢化合物可多至20个碳(但更普遍的是4至8个碳)。烷烃的例子是丁烷、戊烷和己烷。烯烃的例子是丁烯和戊烯。二烯的例子是l-7辛二烯。共同单体也可包括芳香烃，如苯乙烯。等离子体聚合可以以任何胺碳氢化合物比例的两种组分的共聚物聚合进行。共等离子体聚合优选的胺碳氢化合物的比例界限为ioo(胺)o(碳氢化合物)至20(胺)80(碳氢化合物)，以及这之间的任何比例。其上具有等离子聚合薄膜涂层的细胞培养表面，涂覆组合物固定在具有涂覆组合物的涂覆有薄膜的表面上。该涂覆组合物包括一种或多种细胞外基质(ECM)蛋白和水性溶剂。本发明中，术语"细胞外基质"是本领域公知的。它的组分包括一种或多种以下蛋白纤连蛋白、层粘连蛋白、玻连蛋白、生腱蛋白、巢蛋白、血小板反应蛋白、弹性蛋白、明胶、胶原蛋白、肌原纤蛋白、分区蛋白、锚定蛋白、软骨粘连蛋白、链接蛋白、骨唾液蛋白、骨钙蛋白、骨桥蛋白、印inectin、透明质粘连蛋白、粗纤维调节素、表皮整连配体蛋白和缰蛋白。其他胞夕卜基质蛋白在Klei丽netal.，J.Biometer.Sci.PolymerEdn.，5:1-11，(1993)中描述，将其并入本文作为参考。此处术语"细胞外基质"还包括目前未知的但在未来可能被发现的细胞外基质，因为它作为细胞外基质的特征容易被本领域技术人员确定。在一些方面，在涂覆组合物中总蛋白的浓度可能是约lng/mL至约lmg/mL。在一些优选的实施方案中，在涂覆组合物中总蛋白的浓度约为1Pg/mL至约300iig/mL。在更优选的具体实施方案中，在涂覆组合物中总蛋白的浓度约为5iig/mL至约200iig/mL。用于涂层的细胞外基质(ECM)蛋白可能是自然来源的和从人类或动物组织中纯化的。备选地，ECM蛋白在性质上也可能是基因工程的重组蛋白或人工合成的蛋白。ECM蛋白可能是整个蛋白质或是肽段形式。在涂层中使用的细胞外基质蛋白涂层的例子包括层粘连蛋白、I型胶原、IV型胶原、纤连蛋白和玻连蛋白。在一些具体实施方案中，涂覆组合物无异物，因为蛋白均为人源的。这是特定的研究应用可能需要的。在一些具体实施方案中，涂覆组合物包括纤连蛋白或重组纤连蛋白的合成产生的肽片段。在进一步的具体实施方式中，涂覆组合物包含的混合物至少包括纤维连接蛋白和玻连蛋白。在其他一些具体实施方案中，涂覆组合物优选包括层粘连蛋白。用于制备涂覆组合物的水性溶剂可以是水或缓冲液，如磷酸盐缓冲液，特别是杜尔贝科磷酸盐缓冲液(DPBS)，或例如细胞介质。在一些具体实施方案中，DMEM，K0/DMEM，DMEM/F12，RPMI，或本领域中已知的其他细胞介质，适合用作水性溶剂用于制备涂层。合适的水性溶剂稀释剂可以包含任何细胞培养基，其提供了符合胚胎细胞培养的条件，并且优选地将细胞保持在自我更新和未分化的状态，直到其在体外定向到特定的细胞类型的作用。这些介质可通过商业途径购买，例如，来自StemCellTechnologies,Inc.(Vancouver,BC，Canada)，InvitrogenCorporation(Carlsbad,CA)或Sigma-Aldrich(St.Louis，M0)。涂覆组合物优选包括单一类型的细胞外基质蛋白。在一些优选的具体实施方案中，涂覆组合物包括纤连蛋白，特别适用于培养干细胞。例如，合适的涂覆组合物可通过稀释人纤连蛋白制备，例如由Becton，Dickinson&Co.ofFranklinLakes,NJ(BD)(Cat#354008)出售的人类纤连蛋白，溶于杜尔贝科磷酸盐缓冲液(DPBS)，使得蛋白浓度为5ug/mL至约200ug/mL。在其他一些具体实施方案中，涂覆组合物优选包括层粘连蛋白。例如，合适的涂覆组合物可由用杜尔贝科磷酸盐缓冲液(DPBS)稀释的层粘连蛋白(Sigma-Aldrich(St.Louis,MO);cat亂6274和L2020)制备，其中蛋白浓度为5iig/ml至约200iig/ml。在一些具体实施方案中，涂覆组合物的pH值为约7.0至约8.5。可以使用任何能维持该组合物的pH在约7.0至8.5范围内的缓冲组分来维持该pH。在这个范围内的有效缓冲系统包括，但不仅限于二乙醇胺，三乙醇胺，(1，3-二(三[羟甲基]甲氨基)丙)；3-[N，N-二(2-羟乙基)氨基]-2-羟基丙磺酸DIPSO;(N_[2_羟乙基]哌嗪-N'-[4-丁烷磺酸]HEPBS);(N-(4-(2-羟乙基-l-哌嗪乙磺酸HEPES);3-(N-吗啉基)丁烷磺酸MOBS);(哌嗪-N，N'-二[2-羟基丙磺酸P0PS0);(N_三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸TAPS;3-(N-三[羟甲基]甲氨基)-2-羟基丙磺酸TAPSO);(N-三(羟甲基)甲基_2_氨基乙磺酸TES;(N-三(羟甲基)甲基甘氨酸甘氨酸；N_乙基吗啉，二甲基亮氨酰甘氨酸钠5:5-二乙基巴比妥和2氨基，2甲基-1:3丙二醇。用于制备本发明中的培养系统的涂覆组合物包括多种组分，这些组分可以影响涂层中的生长因子到达细胞的通畅性，和/或协助细胞粘附，和/或影响涂层中蛋白质的结构。这些组分可以包括，但不仅限于盐、稀释剂、硫酸乙酰肝素蛋白多糖。在基底上的涂层中还包括其他各种材料。这些材料包括，但不仅限于，细胞、抗体、酶、受体、生长因子、细胞外基质的其它成分、细胞因子、激素和药物。在一些具体实施方案中，细胞外基质蛋白可以结合到这些材料上。这些生物活性材料，如果存在，可以很容易地提供给培养的细胞，以调控或调节它们的性质或行为。本发明提供了制备稳定的、即用型的细胞培养系统的方法。这种方法包括将细胞外基质涂覆组合物应用到被等离子聚合膜涂覆的细胞培养表面，其中涂覆组合物中总蛋白浓度为约lng/mL至约lmg/mL。这种方法也包括将涂覆组合物中的蛋白固定在这类薄膜涂覆的容器上一段时间；以及从薄膜涂覆的平板上移除过量的涂覆组合物。涂覆组合物一般以以下用量应用大约0.5到2.OmL的涂覆组合物能够应用到6孔的多孔板的一个孔；大约0.25到1.OmL能够应用到12孔板或24孔的多孔的一个孔；大约50yL到100yL能够应用到96孔的多孔板的一个孔；大约0.5到2.0mL能够应用到一个35mm的平皿；大约0.5到4.0mL能够应用到一个60mm的平皿；大约2.0到12.OmL能够应用到直径100mm的平皿；大约0.5mL到4.OmL能够加入到一个T25的培养瓶(有25cm2细胞粘附表面积)；大约2.OmL到12.OmL能够加入到一个T75的培养瓶(有75cm2细胞粘附表面积)；大约5.OmL到25.OmL能够加入到一个T175的培养瓶(有175cm2细胞粘附面积)。应用之后，将涂覆组合物保持在涂覆有薄膜的表面上，以使组合物中的细胞外基质蛋白粘附到等离子聚合板上。该涂覆组合物可以被维持在一个非可控环境(例如室温)或者一个可控环境(例如加热或制冷条件下)。特别地，涂覆的等离子聚合板有利地在温度为约22t:到大约37t:之间孵育大约30分钟到约4小时，使蛋白能够粘附到基底表面。备选地，涂覆的等离子聚合培养板在使用前在4t:孵育过夜至2周。用于细胞培养之前，立即将过量的涂层组分要从涂覆的基底移除，以清除未粘附的蛋白和剩余溶液。本发明中的细胞培养系统适用于多种应用，包括培养胚胎干细胞(ES)、间充质和神经元干细胞。在优选的实施方案中，无异物的、限定的细胞培养基底能够在很长时间内，有效地维持未分化的ES细胞和成体干细胞的自我更新和多能性的特点。在一些具体实施方案中，ES细胞，特别是人胚胎干细胞(hES)，可用本发明的细胞培养容器培养。例如，人胚胎干细胞包括，但不限于，以下细胞系例如H1、H9以及H14。这些细胞系例如，可以从WiCell研究中心，Madison，WI得到。本发明的细胞培养表面可能用于培养干细胞。该方法包括培养胚胎干细胞和提供一种细胞培养系统，该系统包括一种具有等离子聚合表面的培养容器；和在其之上的涂覆组合物形成的涂层。该涂覆组合物包括细胞外基质蛋白和水性溶剂的混合物，涂覆组合物中总蛋白浓度为约lng/mL到约lmg/mL。该培养方法也包括加入胚胎干细胞的悬浮液到细胞培养系统中；和在5%C02的湿润空气以及37t:条件下孵育胚胎干细胞，以产生未分化的集落用于脂肪干细胞扩展。在进一步的实施例中，在细胞培养中应用培养基。该培养基可以包括基本介质和添加物以辅助干细胞粘附到细胞培养基底。在一些具体实施方案中，包括培养基如mTeSRTMl(StemCellTechnologiesInc.)。但是，这里注明，培养方法不限于这种培养基。在一些具体实施方案中，成体干细胞，可以是间充质干细胞，可以用本发明的方法培养。例如，间充质干细胞可以包括，但不限于，骨髓来源的细胞，例如Poietics⑧人间充质干细胞。这些细胞如从Lonza(Wakersville，MD)获得。在进一步的具体实施方案中，用于培养间充质干细胞的培养基是不含血清的介质，例如ST證R(^MSCSFM(InvitrogenCorporation,Carlsbad,CA)。但是，这里注明，培养方法不限于该培养基。在其他的具体实施方案中，来源于hES细胞的神经元干细胞，可以使用本发明的方法培养。在进一步的具体实施方案中，用于培养hES细胞来源的神经元干细胞的培养基是不含血清的介质，DMEM/F12+Glutamax，N2，B27，bFGF和青/链霉素。本发明的培养系统能够被用于检测各种抑制因子或剌激因子，以确定它们在细胞研究中的效力。剌激因子可以包括本领域公知的生长因子。例如，可以包括一种或多种血小板衍生生长因子(PDGF)，例如PDGF从、PDGFBB;胰岛素样生长因子(IGF)，例如IGF-I、IGF-II;成纤维细胞生长因子(FGF)，例如，酸性FGF、碱性FGF、P_内皮细胞生长因子、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF9;转化生长因子(TGF)，例如TGF-P1、TGFP1.2、TGF-P2、TGF-P3、TGF-P5;骨形态发生蛋白(BMP)，例如BMP1、BMP2、BMP3、BMP4;血管内皮细胞生长因子(VEGF)，例如，VEGF、胎盘生长因子；表皮生长因子(EGF)，例如，EGF、双调蛋白、P细胞素，肝素结合EGF;白介素，例如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-IO、IL-ll、IL_12、IL_13、IL-14;集落剌激因子(CSF)，例如CSF-G、CSF-GM、CSF-M;神经生长因子(NGF);干细胞因子；肝细胞生长因子；睫状神经营养因子。其他生长因子在Sporn禾口Roberts,PeptideGrowthFactorsandTheirReceptorsI，Springer-Verlag，NewYork(1990)中进行了描述，将其全部并入本文作为参考。术语"生长因子"旨在包括现在未知的但是在将来可能发现的生长因子，因为它们作为生长因子的特性本领域技术人员很容易能够鉴定。本发明的一些实施方案中，培养基可以添加血清，但优选是不含血清的。该培养基可能是之前通过暴露于成纤维细胞饲养层细胞而适应的培养基(例如饲养条件培养基)。用于培养人胚胎干细胞的合适的、确定不含血清的培养基，mTeSRTMl，能够从StemCe11Technologies,Inc.购得。用于培养骨髓来源的间充质干细胞的合适的、不含血清的培养基，STEMPRO，MSCSFM，能够从Invitrogen公司(Carlsbad,CA)得到。制备方法本发明提供了一种制备稳定的、即用型的细胞培养基底的方法。该方法包括将细胞外基质涂覆溶液应用到细胞培养容器的等离子聚合的涂覆有薄膜的表面，其中涂覆溶液中总蛋白浓度是约lng/ml至约lmg/ml。该方法还包括保持涂覆溶液位于涂覆有薄膜的表面上，以使得涂覆溶液中的蛋白固定在基底表面上；以及从基底移除过量涂覆溶液。本发明的某些方面，一种或多种涂覆溶液可以至添加至等离子聚合涂覆有薄膜的表面。在一些具体实施方案中，含有相同或不同ECM蛋白的涂覆溶液可以依次应用。在涂覆应用之间，可以使用可选的洗涤步骤。在一些具体实施方案中，该洗涤步骤可以包括用双蒸水、缓冲液(例如，PBS)或者培养基洗涤基底。在另一些具体实施方案中，该洗涤步骤可以包括用封闭液洗涤基底。涂覆溶液，包括细胞外基质组分，能够保持在至少薄膜涂覆的细胞培养表面的一个表面上，例如细胞培养容器(例如，烧瓶或者细胞培养板)，在使得细胞外基质蛋白充分粘附到涂覆的表面的一定温度和/或一定时间下。例如，薄膜涂覆的细胞培养容器可以保持在室温放置约1到约4个小时，以进行粘附。或者，该容器在4t:孵育一段时间(例如，4小时到2周)。涂覆的基底也可以在温度约为22t:至约37t:条件下孵育约30分钟到约4小时，以使蛋白粘附到基底表面。移除(例如，吸干)任何过量的涂覆溶液之后，并用水性溶剂(例如，水、缓冲溶液、(1(11120、培养介质)洗涤涂覆的基底，以清除未结合的蛋白。使用以上提到的封闭液，提高涂覆基底的稳定性。涂覆之后，可选进行无菌处理。在一个具体实施方案中，该装置用紫外(UV)灯进行无菌处理。—些方面，在将涂覆溶液应用到涂覆有薄膜的表面之后，立即冷冻细胞培养基底。冷冻的细胞培养基底可以在-2(TC储存多至3个月，使用前解冻。例如，作为ECM蛋白的层粘连蛋白可以作为一种涂覆溶液应用，就像上面提到的，能够同所得细胞培养表面一起冷冻和储存。以下的例子仅为说明目的，并非特意以任何方式对本发明的使用和具体实施方案进行限制。实施例实施例l在化学法限定的等离子聚合表面的ECM涂层化学法限定的等离子聚合的培养容器(12或6多孔培养板形式)被各种细胞外基质(ECM)蛋白涂覆。单一或组合的ECM蛋白，用杜尔贝科磷酸缓冲溶液(DPBS)或者DMEM/F12介质稀释后，加入(6孔培养板lmL/孔以及12或24孔培养板0.5mL/孔)，然后将培养板在37t:或室温涂覆2小时。在用于hES细胞培养实验之前，立即移除涂覆溶液。实验中用到以下ECM:ECM包括但不仅限于人纤连蛋白、人层粘连蛋白、人玻连蛋白、人胶原IV、BDMatrigelhESC-qualifiedMatrix,ProNectinFPlus;Sigma公司的一种纤连蛋白样工程蛋白聚合体；TakaraBioUSA公司的另外一种重组人纤连蛋白片段Retronectin。化学法限定的等离子聚合6孔培养板(BDPrimexl(包括胺和正电荷表面，Cat#359296))和BDPrimex2(包括羧基和负电荷表面，Cat#359297))由各种无动物成分ECM涂覆。化学法限定的等离子聚合24孔培养板(BDPureCoatamine,正电荷等离子聚合表面，Cat#354723或者356723)由各种人和动物来源的ECM涂覆。涂覆溶液通过用杜尔贝科磷酸缓冲溶液稀释单一或混合的ECM蛋白获得，蛋白质终浓度为5iig/mL至50iig/mL将涂覆溶液以lmL/孔的体积加入6孔培养板，或以0.5mL/孔的体积加入12孔培养板。涂覆溶液在等离子聚合培养板上进行孵育，至少室温2小时或者fC过夜。在培养板用于培养hES细胞实验之前，立即移除涂覆溶液。实施例2在ECM涂覆的等离子聚合表面卜.培养人杯胎干细朐hES细朐在ECM涂覆的等离子聚合表面卜.培养hES干细胞(Hl、H9或H14细胞系，来自WiCell研究所)最初从阳性对照培养板上(hES细胞生长在涂覆BDMatrigelhESC-qualifiedMatrix的6孔TC培养板上，生长在mTeSRTMl培养基上)铺至等离子聚合培养板上(有或无ECM涂覆)。在37°C，用分散酶(2mg/mL)处理阳性对照培养板上细胞5分钟，随后用DMEM/F12培养基迅速洗涤4次，然后用塑料吸管或吸头在少量体积的mTeSRTMl培养基中机械切割至小块。mTeSRTMl培养基中重悬的hES细胞团以l:3至1:6的分流比接种在检测表面上，在含5%C02的湿润空气，37t:的培养箱中培养。每天更换一次培养基，初始铺板后一般每4至6天解离一次。在等离子聚合BDPrimex1板上hESC的解离培养在涂覆有BD人纤连蛋白的BDPrimex1培养板上的hES细胞惯常用TryPLEselect(Invitrogen，用DMEM/F12以1:2(v:v)稀释)进行解离以传代培养和长期维持。简言之，移除用尽的培养基，细胞用匿EM/F12培养基洗涤一次，然后用稀释的TryPLEselect(lmL/孔)室温处理2分钟。然后迅速移除解离试剂，并用DMEM/F12培养基迅速洗涤细胞3次。随后将mTeSRTMl培养基(StemCellTechnologies,Inc.)加入到处理过的细胞中，用5mL塑料吸管或者吸头将集落机械切割至小块。细胞的分散和铺板按照上面部分描述的进行。hES细胞集落的粘附情况测l定比较在用不同ECM蛋白涂覆的等离子聚合表面上的hES细胞的粘附情况。在室温下，用4%的多聚甲醛固定hES细胞20分钟，然后用杜尔贝科磷酸缓冲溶液(DBPS)洗涤两次，每次5分钟。随后，细胞用结晶紫染色(以l:10用DPBS稀释)5分钟，接着用DPBS洗涤一次。将含有固定和用结晶紫染色的细胞的培养板用激光扫描仪扫描，并且显示每孔的粘附集落(图l)。图IA是(TC)-处理的聚苯乙烯培养板，其用BDMatrigelhESC-qualifiedmatrix涂覆，图IB是TC培养板，其用BD人纤连蛋白涂覆；以及图1C是BDPrimexl培养板，其用BD人纤连蛋白涂覆(Cat#359296)，并且用mTeSRTMl培养基培养(StemCellTechnologies,Inc.)。通常使用相差显微镜检测细胞集落的粘附和形态学。如图2A和图2B显示，hES细胞(H9系)在用BD人纤连蛋白涂覆的等离子聚合BDPrimex1培养板(Cat#359296)上培养18代(图2B)。在用纤连蛋白涂覆的BDPrimex1培养板上的细胞形态非常类似于培养在阳性对照基底，即用BDMatrigelTMhESC-qualifiedmatrix涂覆的TC培养板上的hES细胞集落(图2A)。当在这些培养基底上培养时，hES细胞都主要维持在未分化状态。輔魏将人胚胎干细胞(hES)(H9系)接种于用BDMatrigelTMhESC-qualifiedmatrix或人纤连蛋白涂覆的组织培养(TC)-处理的聚苯乙烯培养板上；并且接种在用人纤连蛋白涂覆的BDPrimex1上。细胞用mTeSRTMl培养基(StemCellTechnologies,Inc)培养4天，固定并用结晶紫染色。图l显示的是每个表面的相对细胞粘附情况。能够看出，在用人纤连蛋白涂覆的BDPrimex1上的集落粘附情况(图1C)与阳性对照基底(用BDMatrigerhESC-qualifiedmatrix涂覆的TC培养板，图1A)相当。但是，用人纤连蛋白涂覆的TC表面不支持可见的hES细胞集落粘附或在mTeSRTMl培养基生长(图IB)。在用或不用各种类型的人纤连蛋白涂层的BDPrimex1和TC培养板上的hES细胞集落粘附情况的结果如下所示表1<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>阳性对照=用pre-qualifiedBDMatrigelTM涂覆的TC表面基于集落粘附的大致的数目、集落中的细胞形态学(例如紧凑对单个细胞)、增殖率和自发分化程度，认为表面与上阳性对照相当。在用或不用各种ECM蛋白涂层的等离子聚合的BDPrimex1和Primex2培养板上的hES细胞集落粘附的结果如下所示表2<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>基于集落粘附的大致的数目、集落中的细胞形态学(例如紧凑对单个细胞)、增殖率和自发分化程度，认为表面与阳性对照相等。实施例3-来分化的hESC的鉴定形态学分析(图2)显示当用mTeSRTMl在用BD人纤连蛋白(图2B)涂覆的BDPrimex1培养板(Cat#359296)上培养时，hES细胞主要维持在未分化时期，并且与培养在阳性对照基底(用BDMatrigelhESC-qualifiedmatrix涂覆的TC培养板，图2A)上的细胞相当。用mTeSRTMl在BD人纤连蛋白(图3B)涂覆的BDPrimex1培养板上培养的细胞和在阳性对照基底(BDMatrigelhESC-qualifiedmatrix涂覆的TC培养板，图3A)上培养的细胞中未分化标志物0CT-3/4的表达是相当的。定量FACS分析(操作规程在下文实施例5中)显示在BD人纤连蛋白涂覆的BDPrimex1上的培养16代的hES细胞(H9系)的未分化hES细胞特异性标志物的表达(0CT-3/4和SSEA-4)与阳性对照细胞(培养在BDMatrigelhESC-qualifiedmatrix涂覆的TC上)相当。表达未分化标志物的细胞的相对百分比汇总在下表3中表313<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>輔你l4-诵遵総舰i秀别勺自^做使用在上文实施例2中描述的相同的方法，对hESC集落用任一TryPLEselect(Invitrogen)进行角牟离。将解离的细胞团铺板在加有分化培养基(补充20%胎牛血清(FBS)、10mM非必需氨基酸、lmML-谷氨酸、0.ImMbeta-巯基乙醇的匿EM/F12培养基)的皮化培养皿(未经组织培养处理)或者低粘附的6孔培养板中。培养在分化培养基中的细胞团在悬浮液中形成胚状体(EB)，并培养4-15天。随后，采用QRT-PCR(本领域所公知的操作规程)分析EB中胚层标志物基因的表达；也可以将EB重新铺板至明胶涂覆的TC培养板上，在补充20%FBS的匿EM培养基中进一步分化一段时间，并用免疫组化分析胚层特异性蛋白表达的出现。实施例5-hESC多能件的鉴定H9hES细胞(在BD人纤连蛋白涂覆的BDPrimex1培养板上培养13代后)分化成胚状体(EB)。用QRT-PCR检测EB中3个胚层标志物的表达情况(图5)。检测所有3个胚层的标志物FoxA2(内胚层表达的叉头盒A2)、HAND1(中胚层表达的心和神经嵴衍生物1)和微管蛋白TUBB3(外胚层中的微管蛋白beta3)。培养在BDMatrigelhESC-qualifiedMatrix涂覆的TC培养板上的细胞代表阳性对照。相对于培养在BD人纤连蛋白涂覆的BDPrimex1培养板上的未分化细胞(对照)的胚层标志物表达情况也被显示。可以看出，BD人纤连蛋白涂覆的BDPrimex1培养板上培养的细胞产生的EB中，所有3个胚层标志物的表达都有明显的提高，并且表达与阳性对照相当。以上的数据说明培养在具有纤连蛋白涂层的Primex1上的细胞保持了它们的多能性。图6显示的是在随着EB形成，自发分化后的胚层标志蛋白表达情况。将hES细胞(H9系)在BD人纤连蛋白涂覆的BDPrimex1培养板上培养3代。使细胞分化成EB10天并转移到明胶涂覆的TC培养板上，在补充了20%FBS的匿EM培养基中继续培养10天。用免疫组织化学法检测胚层标志物的表达。实施例6-免疫组织化学操作规程本实施例涉及检测未分化hES细胞中标志物的表达的免疫组织化学操作规程(数据在实施例3中概述，并在图3中显示)。操作规程用于6孔培养板中培养的细胞。同样的操作规程也可用于检测分化的hES细胞中胚层特异性蛋白的表达情况(数据在实施例4中概述，并在图6中显示)。为了后续的研究，在12孔培养板中培养细胞，并且每孔中使用随后操作规程中标明的一半的体积。用2mL的杜尔贝科磷酸缓冲液(DPBS)洗涤培养的hES细胞。随后，用lmL的4%的多聚甲醛在室温固定细胞20分钟。固定的细胞用2mL的DPBS洗涤两次，每次5分钟。随后，用lmL含O.1%牛血清蛋白(BSA)和10X正常山羊血清的DPBS封闭细胞。在封闭步1410X正常山羊血清的DPBS制备一抗工作液，来获得理想的抗体浓度。需要注意的是，在封闭液和一抗溶液中，正常血清可以替换成来源于其他物种的血清，这取决于二抗的宿主物种来源。封闭之后，将细胞与lmL/孔的稀释的抗体工作液在室温孵育2小时或者在2-8°C孵育过夜。随后，用2mL含1%BSA的DPBS洗涤细胞3次，每次5分钟。二抗用含1%BSA的DPBS按照1:2000稀释。可用的荧光二抗包括Alex488或594缀合的适当的二抗(Invitrogen-MolecularProbes)。将细胞与lmL/孔的稀释的二抗室温避光孵育60分钟。随后，用2mL含1%BSA的DPBS洗涤细胞3次，每次5分钟。之后，用2mL的DPBS覆盖细胞，观测，并用荧光显微镜拍照。实施例7-FACS分析操作规禾呈培养在6孔培养板中的人胚胎干细胞(hES)(H9系)的汇合培养物用杜尔贝科磷酸缓冲液(DPBS)短暂漂涤，并用lmL/孔的0.25X胰蛋白酶/EDTA(Invitrogen)在37。C处理2-3分钟，使细胞从培养表面解离。加入2mL/孔的含20X胎牛血清(FBS)的DMEM/F12培养基以灭活胰酶。然后用吸管上下吹吸轻柔地将细胞分散，1000rpm离心5分钟使其沉淀。对于细胞内抗原(例如0CT-3/4)，重悬细胞沉淀，并用1%多聚甲醛(lmL/管)在37t:固定IO分钟。将固定的细胞用3mL/孔的渗透/洗涤缓冲液(BDPharmingen)简单洗涤一次。通过离心使细胞沉淀；去上清，用3mL/孔的渗透/洗涤缓冲液重悬细胞沉淀，并在冰上孵育15分钟，以渗透化细胞。渗透化之后，再离心一次使细胞沉淀，并重悬在100iil渗透/洗涤缓冲液中，用合适的一抗探测(3X105细胞同500ng的一抗孵育)。孵育l小时之后，用3mL的渗透/洗涤缓冲液洗涤，并重量在100iiL同样的缓冲液中。加入二抗，细胞在室温避光孵育30分钟。孵育之后，按照之前的方法洗涤细胞，并重悬在200iiL含1iig/ml的碘化丙锭(Sigma)的渗透/洗涤缓冲液中，以鉴定活细胞。用FACS流式细胞仪(BD)进行荧光激活的细胞分类器(FACS)分析。每个样本总共分析30000个事件，并用CellQuest3.0软件(BD)分析数据。对于表面抗原(例如SSEA-4、TRA-l-60、TRA-l-81等)，进行相似的操作规程，其中有一些例外。解离之后，将细胞垂悬在O.5mL含25XFBS的DPBS中。省略固定步骤以检测表面抗原。所有的一抗孵育都在含25%FBS的DPBS中在冰上进行，每个反应使用200ng抗体，而二抗孵育是在同样的缓冲液中，在室温避光进行30分钟。所有其他的步骤类似于上述的细胞内抗原的操作规程。实施例8-纤连蛋白的ELISA测定通过人纤连蛋白的ELISA分析结果进一步确定ECM涂覆的BDPrimex培养板的性能。例如，纤连蛋白ELISA或者层粘连蛋白ELISA可以用于评价粘附在基底表面上的ECM蛋白的量。举例来说，一种用于评价涂覆的容器的性能的人纤连蛋白ELISA测定陈述如下。BDPrimex1培养板和涂覆了各种浓度的人纤连蛋白的TC培养板的纤连蛋白ELISA的数据图如图7所示。为了制备ELISA—抗工作液，将0.5ml的1:100(v/v)的兔抗人纤连蛋白储备液(Sigma;catalogno.F3648)加入到40ml含0.5%牛血清蛋白(BSA)的杜尔贝科磷酸缓冲液(DPBS)中。为了制备ELISA二抗工作液，将O.4ml的1:100(v/v)的羊抗兔IgG-HRP15储备液(BDPharmingen;catalogno.554021)加入到40ml含0.5%BSA的DPBS中。执行ELISA反应使用用根据本发明制备的ECM-涂覆的6孔BDPrimex1培养板(检测培养板)，BDMatrigelhESC-qualifiedMatrix涂覆的TC培养板(阳性对照)或Falcon6孔未涂覆培养板(catalogno.353046;阴性对照)。将这些培养板先用2mL/孔的洗涤缓冲液(含0.02%Tween-20的DPBS)洗涤3次。随后，加入lmL作为封闭液的含0.5%BSA的DPBS，并且将培养板在室温下孵育1小时。然后移除BSA溶液，用上述的洗涤缓冲液洗涤这些培养板。随后，按lmL/孔加入一抗工作液，将培养板在室温孵育2小时。在移出一抗溶液后，培养板再按照上述步骤再次洗涤。随后，按lmL/孔加入二抗工作液，将培养板在室温孵育1小时。在移除二抗溶液后，培养板按照上述步骤再次洗涤。然后，按lmL/孔加入辣根过氧化物酶(HRP)底物、TMB(KPL;catalogno.53-00-02)，使蓝色显色8分钟后。随后，加入lmL的终止液(KPL;catalogno.50-85-05)，使培养板轻柔地旋转以促进混合。然后，6孔培养板的每孔中取200iU—份转移到96孔培养板的孔中，并在室温用分光光度计(SpectraMaxPlus384，MolecularDevices)在450nm处检测吸光度。在加入终止液后5分钟内进行读板。计算检测培养板、阳性对照TC培养板每孔的平均吸光度。纤连蛋白ELISA测l定的结果等离子聚合BDPrimex1培养板与TC培养板相比，在纤连蛋白粘附的量上没有明显区别(图7A)。但是，BD人纤连蛋白涂覆的BDPrimex1培养板支持hES细胞的粘附和生长(图1C和7B)，而BD人纤连蛋白涂覆的TC表面却不是最佳的(图1B)。因此，通过ELISA数据检测的纤连蛋白浓度与hES细胞在BDPrimexl培养板上的粘附和生长之间没有明显的关联。人纤连蛋白的浓度在5到50iig/mL之间能够支持在Primexl上的hES细胞很好地粘附和生长(图7B)。但是，集落形态学的严格检查说明10-50g/mL对于这些细胞的长期培养是最好的范围。这些数据共同说明不是结合的纤连蛋白的量而是该ECM蛋白的构型提供给了等离子聚合BDPrimex1培养板利于hES细胞粘附和生长的优点。实施例9-在ECM涂覆的等离子聚合表g上不含血清的介质中，间充质干细胞(MSC)的粘附和牛长解冻骨髓来源的MSC(Lonza)，并平铺于加入含10%血清(MSCGM,Lonza)的MSC完全生长培养基的组织培养瓶中。在第5代时，用0.5X胰蛋白酶EDTA解离细胞，并铺板在加入含血清(Lonza)的MSC生长培养基的未涂覆的组织培养板上(阳性对照；图9A)或加有不含血清的STEMPR0⑧MSC培养基(Invitrogen)的纤连蛋白涂覆的BDprimex1培养板上(图9B)。培养5天之后，用显微镜目测细胞形态和生长。在不含血清培养基中，MSC的粘附和生长一般较差。在此实施例中，证实了在纤连蛋白涂覆的BDPrimex1培养板上的MSC的粘附情况阳性对照条件(细胞在含血清的介质中，在组织培养表面上培养)相当。实施例10在ECM涂覆的等离子聚合表面上MSC分化成为脂肪细胞脂肪生成培养操作规程脂肪生成诱导培养基和脂肪生成维持培养基从Lonza购买，脂肪生成的操作规程如下所述。将每孔2mL培养基中的200，000个间充质干细胞铺板至包含含血清的生长介质(MSCGM,Lonza)的6孔组织培养板或包含不含血清的MSC介质(STEMPR0MSCSFM;Invitrogen)的纤连蛋白涂覆的BDPrimex1培养板中。并在含5%C02的潮湿空气和37°C条件下，孵育细胞。每2到3天更换一次介质，直到培养物达到汇合(在7天)。达到100%汇合之后，进行诱导/维持的3次循环，以剌激脂肪生成分化。每个循环由如下步骤构成用脂肪生成诱导培养基饲喂MSC并培养3天(37°C，5%C0》，随后在脂肪生成维持培养基中培养13天。在完成3个完整的诱导/维持循环之后，在脂肪生成维持培养基中再培养MSC7天，每2-3天更换一次培养基。用显微镜确定诱导的细胞中脂质空泡的出现情况未目视观察脂肪细胞分化程度。MSC分化成脂肪细胞的结果在纤连蛋白涂覆的BDprimex1培养板上的脂肪生成的程度(图9B)同在阳性对照组织培养板上观测到的(图9A)相类似。该实施例说明在纤连蛋白涂覆的BDprimex1培养板上用不含血清的介质培养的MSC保留了它们分化成为脂肪细胞的能力，并且分化潜能与阳性对照所观测到的情况相当。实施例11NSC在ECM涂覆的等离子聚合表面卜.的牛长和粘附人胚胎干细胞来源的神经元干细胞(hNSC)在补充了2.5mML-谷胺酰胺、1%N2、2%B27、20ng/mLbFGF和1%青/链霉素的DMEM/F12介质(1:1)中在多聚鸟氨酸和其合层粘连蛋白顺序涂覆的组织培养瓶中培养。为了涂覆T-75组织培养瓶，加入5mL溶于蒸馏水中的多聚鸟氨酸(20yg/mL)，将培养瓶平置以保证涂覆溶液完全覆盖了底部表面。将培养瓶室温下孵育过夜。24小时后，移去多聚鸟氨酸溶液，用蒸馏水漂洗培养瓶一次，然后加入5mL溶于杜尔贝科磷酸缓冲盐溶液的层粘连蛋白(5iig/mL)。将培养瓶底部表面用层粘连蛋白涂覆，37t:孵育2小时。在用于铺板hNSC之前立即移去涂覆溶液。在本实施例中，检测了在ECM涂覆的等离子体表面上hNSC的粘附和生长状况。6孔组织培养板和BDPrimex1培养板用BD人纤连蛋白(25yg/mL)室温下涂覆2小时，或者使用多聚鸟氨酸(20i!g/mL)和层粘连蛋白(5iig/mL)的组合如上文描述的方法进行涂覆。组织培养板和BDPureCoatAmine培养板(24孔)用多聚鸟氨酸(20yg/mL)、层粘连蛋白(5iig/mL)或者多聚鸟氨酸(20i!g/mL)及层粘连蛋白(5yg/mL)的组合按照上文描述的方法涂覆。图10说明了hNSC在纤连蛋白涂覆的BDprimex1上的粘附和生长(图10d)与多聚鸟氨酸和层粘连蛋白的组合涂覆的组织培养表面(阳性对照，图10b)相等。然而，hNSC在未涂覆的组织培养表面或BDPrimex1上的生长和粘附非常低(图10a和10c分别显示)。图11说明hNSC在层粘连蛋白(5i！g/mL)涂覆或多聚鸟氨酸和层粘连蛋白的组合涂覆的BDPureCoatAmine上的粘附和生长好于相同的ECM涂覆的组织培养表面。实施例12用MTS测定法确定NSC的生存能力—种基于四唑的测定法用于定量分析细胞的生存能力。简言之，移除介质废液之后，用含MTS试剂(Promega)的介质代替，在37°C孵育2小时。MTS是一种四唑化合物，其能够被代谢活跃的活细胞还原成为一种可溶解产物，甲臜，显紫色。然后，用Tecan⑧Safire2TM微板读取仪在490nm处漂取甲臜的吸光度。将hNSC以20，000细胞/孔的密度接种在孔未被或被多聚鸟氨酸、层粘连蛋白或多聚鸟氨酸、层粘连蛋白的组合涂覆的24孔BDPureCoatAmine培养板中。3天后，轻柔地吸出用尽的培养基，替换为不含bFGF的400i！L新鲜生长培养基。每孔中，加入80i！L的MTS试剂，细胞在37。C孵育1.5小时。在490nm处读取吸光度。本实验的结果支持在实施例8中描述的目测结果(图12)。当用单独层粘连蛋白涂覆或者多聚鸟氨酸和层粘连蛋白的组合涂覆时，hNSC在BDPureCoatAmine表面上的生存能力高于组织培养表面大约20到30%。该实施例证实hNSC可以在用单一一种ECM(层粘连蛋白)涂覆的BDPureCoatAmine表面上粘附、生长和维持生存，并且优于用两种ECM(多聚鸟氨酸和层粘连蛋白；阳性对照)涂覆的组织培养培养板上的这些细胞的生长。18权利要求一种细胞培养基底，包含具有薄膜粘附于其上的细胞培养表面，其中所述薄膜包含一种或多种等离子聚合单体；以及在所述涂覆有薄膜的表面上的涂层，所述涂层从包含一种或多种细胞外基质蛋白和水性溶剂的涂覆溶液中沉积形成，其中涂覆溶液中总细胞外基质蛋白浓度为约1ng/mL到约1mg/mL。2.权利要求1所述的细胞培养基底，其中所述一种或多种单体选自丙烯酸、甲基丙烯酸、醋酸、乙烯基醋酸以及它们的组合。3.权利要求1所述的细胞培养基底，其中所述一种或多种单体选自烯丙胺、甲胺、丙胺、庚胺和丙二胺。4.权利要求1所述的细胞培养基底，其中所述单体选自烷烃、烯烃、二烯、苯乙烯以及它们的组合。5.权利要求1所述的细胞培养基底，其中所述一种或多种单体选自胺、碳氢化合物以及它们的组合，其中胺与碳氢化合物的比例在约ioo:o到约20:so之间。6.权利要求1所述的细胞培养基底，其中涂覆组合物中总蛋白的浓度为约1yg/mL到约300iig/mL。7.权利要求1所述的细胞培养基底，其中涂覆组合物中总蛋白的浓度为约5iig/mL到约200iig/mL。8.权利要求1所述的细胞培养基底，其中涂覆组合物包含细胞外基质蛋白，所述细胞外基质蛋白选自天然的、重组的、合成的细胞外基质蛋白及它们的组合。9.权利要求1所述的细胞培养基底，其中涂覆组合物包含完整的细胞外基质蛋白或细胞外基质蛋白的片段。10.权利要求1所述的细胞培养基底，其中涂覆细合物进一步包含选自巢蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)、生长因子以及它们的组合的组分。11.权利要求1所述的细胞培养基底，其中水性溶剂选自缓冲液、细胞培养介质以及它们的组合。12.—种制备细胞培养基底的方法，包含提供细胞培养表面；将薄膜等离子聚合到所述表面上以形成涂覆有薄膜的表面，其中所述等离子聚合利用一种或多种单体；以及引入涂覆溶液到所述涂覆有薄膜的表面以形成细胞培养基底，所述涂覆溶液包含一种或多种细胞外基质蛋白和水性溶剂，其中涂覆溶液中总细胞外基质蛋白的浓度为约lng/mL至,lmg/mL。13.权利要求12所述的方法，进一步包含孵育所述细胞培养基底，其中将所述一种或多种细胞外基质蛋白固定在所述涂覆有薄膜的表面上。14.权利要求12所述的方法，进一步包含冷冻所述细胞培养基底一段时间，然后孵育所述细胞培养基底，其中将所述的一种或多种胞外基质蛋白固定在所述涂覆有薄膜的表面上。15.—种培养干细胞的方法，包括提供权利要求1所述的细胞培养基底；将干细胞悬浮液应用到所述细胞培养基底上；在37t:，含5%C02的潮湿空气中孵育在所述细胞培养基底上的所述干细胞悬浮液；以及使所述干细胞粘附在细胞的所述细胞培养基底上，其中粘附的细胞主要保持在未分化状态。16.权利要求15所述的方法，进一步包含在应用所述真核干细胞悬浮液之前引入细胞培养基到所述细胞培养基底。17.权利要求15所述的方法，其中所述细胞培养基包含生长培养介质。18.权利要求15所述的细胞培养基底，其中所述干细胞为真核干细胞。19.权利要求15所述的细胞培养基底，其中所述干细胞为胚胎干细胞。20.权利要求15所述的细胞培养基底，其中所述干细胞为人胚胎干细胞。21.权利要求15所述的细胞培养基底，其中所述干细胞为人间充质干细胞。22.权利要求15所述的细胞培养基底，其中所述干细胞为人神经元干细胞。全文摘要一方面，本发明提供了一种细胞培养基底，包括一种具有薄膜粘附于其上的细胞培养表面，其中薄膜包含一种或多种的等离子聚合单体；以及在涂覆有薄膜的表面上的涂层，该涂层从包含一种或多种细胞外基质蛋白和水性溶剂的涂覆溶液中沉积形成，其中，涂覆溶液中总细胞外基质蛋白的浓度为约1ng/mL到约1mg/mL。文档编号C12M3/00GK101705186SQ20091020573公开日2010年5月12日申请日期2009年7月27日优先权日2008年7月25日发明者D·萨克斯纳,E·阿布拉哈姆,S·X·钱,S·圣雅尔申请人:贝克顿·迪金森公司