一种丽花石山苣苔的组织培养方法

1.本发明涉及农业生物技术中植物组织培养领域，具体涉及一种广西喀斯特特有的濒危极小种群植物-丽花石山苣苔的组织培养方法。


背景技术：

2.苦苣苔科石山苣苔属植物绝大部分都是适应于喀斯特岩溶地貌上的草本植物。丽花石山苣苔(petrocodon pulchriflorus y.b.lu&q.zhang)为多年生草本植物，具粗而短根状茎；叶为稍长圆形或心状卵圆形；聚伞花序，每花序具6至14花，花朵为鲜艳的紫红色，中间部分具有鲜亮的明黄色花眼；花序梗长达20厘米；株型紧凑，花色艳丽，叶片青翠，具有极高的科研价值和室内盆栽花卉开发潜力，应用前景广阔。
3.丽花石山苣苔目前已知仅一个种群，属于极小种群植物，且仅见分布于我国广西天等县的一座石灰岩山山脚陡崖阴处，是广西和我国的特有种。2017年该正式发表以来，由于其极高的观赏价值，被当地居民大量采集出售，目前野外种群不足50个成熟个体，目前根据国际自然保护同盟的iucn濒危等级评估体系被评“极危(critically endangered,cr)”。由于种源数量稀少，进一步限制了其在园林园艺实践中的有效应用。目前，丽花石山苣苔的种苗来源主要通过叶插进行繁育。由于该物种在自然条件下结实率极低，人工栽培条件下需要进行人工授粉获取种子，程序复杂且结实率仍然受到限。同时，播种虽然可在短时间内获得大量幼苗，然而经种子繁育的后代易发生性状分离，遗传性状不稳定，易丢失亲本的优良性状，并且长势不一，较难得到长势一致的群体后代；另外，这一物种的种子也不耐贮藏，一年后种子活力就下降50％，随着贮藏时间延长，种子萌发率越来越低。而叶插方式繁育需要大量的生长健康的叶片，成本高，耗时较长，且不同个体的叶插后代长势也很难保持一致，且存在周期长、成本高、效率低下、长势不一等问题，且对其的组织培养未见报道。因此，采用植物组织培养技术来缓解其种苗紧张压力、进行可持续开发利用是十分必要的。
4.由于丽花石山苣苔发表于2017年，关于其组织培养方面的研究，国内外目前尚无报道。叶片作为再生及遗传转化的外植体有其优势，取材方便、操作容易、来源广泛，有利于再生及遗传转化的重复进行等。因此，本发明以丽花石山苣苔无菌苗嫩叶为外植体，通过不定芽诱导、增殖、生根、炼苗移栽等过程成功获得了丽花石山苣苔离体再植株，建立其组织培养快速繁殖技术体系，对于进行这一物种的快速繁殖、大面积生产栽培和进行生态回归、促进丽花石山苣苔及其近缘物种的产业化发展具有重要意义。
5.目前石山苣苔属已经报道的组织培养和快速繁殖的未见报道，因此对特有分布于我国华南地区广西壮族自治区的石山苣苔属植物的相关研究有很强的理论价值和实践意义。


技术实现要素：

6.本发明所要解决的技术问题是提供一种丽花石山苣苔的组织培养方法。目的是为了在短期内提供大量的丽花石山苣苔种苗解决极度濒危现状以及高效开发利用这一野生
花卉资源，本发明以丽花石山苣苔叶柄为外植体，通过诱导不定芽培养、继代增殖培养、生根培养、炼苗移栽过程成功获得了离体再生植株，建立起了组织培养快速繁殖技术体系，对于进行丽花石山苣苔优良种质资源的保护、快速繁殖和大面积推广、促进丽花石山苣苔的解濒和产业化发展具有重要意义。
7.本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种丽花石山苣苔的组织培养方法，包括如下步骤：1)诱导不定芽培养，2)继代增殖培养，3)生根培养，4)炼苗移栽；
8.所述步骤1)的诱导不定芽培养基为：ms基础培养基、1～2mg/l tdz(脱叶灵，n-苯基-n'-(1,2,3-噻二唑-5-基)脲)、0.1～0.5mg/l kt(激动素)、0.05～0.2mg/l naa(萘乙酸)、15～30g/l蔗糖、3.5～6.0g/l琼脂，ph为5.4～5.8；
9.所述步骤2)继代增殖培养基为：ms基础培养基、0.1～1mg/l 6-ba(6-苄氨基腺嘌呤)、0.05～0.1mg/l naa、15～30g/l蔗糖、3.5～6g/l琼脂，ph为5.4～5.8；
10.所述步骤3)生根培养基为：1/2ms基础培养基、0.05～0.2mg/l iba(吲哚-3-丁酸)、1.0～2.0mg/l ggr(双吉尔-ggr，购自北京艾比蒂研究开发中心)、15～30g/l蔗糖、3.5～6g/l琼脂，ph为5.4～5.8。
11.本发明的有益效果是：利用植物组织培养技术进行丽花石山苣苔的组织培养，建立了丽花石山苣苔的组织培养快繁体系和方法，具有简单、易行、经济的特点；通过本发明培育成的丽花石山苣苔组培苗移栽成活率达到98％以上，可以为其规模化种植提供优质种苗保障。
12.在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
13.进一步，所述步骤1)的诱导不定芽培养基为：ms基础培养基、1.2～1.8mg/l tdz、0.2～0.4mg/l kt、0.1～0.15mg/l naa、20～25g/l蔗糖、4～5g/l琼脂，ph为5.4～5.8；
14.所述步骤2)继代增殖培养基为：ms基础培养基、0.2～0.8mg/l 6-ba、0.07～0.08mg/l naa、20～25g/l蔗糖、4～5g/l琼脂，ph为5.4～5.8；
15.所述步骤3)生根培养基为：1/2ms基础培养基、0.1～0.15mg/l iba、1.2～1.8mg/l ggr、20～25g/l蔗糖、4～5g/l琼脂，ph为5.4～5.8。
16.进一步，所述步骤1)的诱导不定芽培养基为：ms基础培养基、1mg/l tdz、0.3mg/l kt、0.1mg/l naa、25g/l蔗糖、5g/l琼脂，ph为5.5；
17.所述步骤2)继代增殖培养基为：ms基础培养基、1mg/l 6-ba、0.05mg/l naa、25g/l蔗糖、4g/l琼脂，ph为5.5；
18.所述步骤3)生根培养基为：1/2ms基础培养基、0.1mg/l iba、1.0mg/l ggr、15g/l蔗糖、5g/l琼脂，ph为5.5。
19.进一步，所述步骤1)的诱导不定芽培养基为：ms基础培养基、2mg/l tdz、0.1mg/l kt、0.05mg/l naa、30g/l蔗糖、4.0g/l琼脂，ph为5.5；
20.所述步骤2)继代增殖培养基为：ms基础培养基、1mg/l 6-ba、0.05mg/l naa、25g/l蔗糖、4.5g/l琼脂，ph为5.8；
21.所述步骤3)生根培养基为：1/2ms基础培养基、0.05mg/l iba、2mg/l ggr、18g/l蔗糖、5g/l琼脂，ph为5.8。
22.进一步，所述步骤1)的诱导不定芽培养基为：ms基础培养基、1.5mg/l tdz、.5mg/l kt、0.2mg/l naa、30g/l蔗糖、4g/l琼脂，ph为5.8；
23.所述步骤2)继代增殖培养基为：ms基础培养基、0.5mg/l 6-ba、0.1mg/l naa、25g/l蔗糖、5g/l琼脂，ph为5.8；
24.所述步骤3)生根培养基为：1/2ms基础培养基、0.1mg/l iba、1.0mg/l ggr、20g/l蔗糖、6g/l琼脂，ph为5.8。
25.进一步，所述步骤1)诱导不定芽培养具体为：选取继代无菌苗的叶柄为外植体，用解剖刀在叶柄上轻轻划几刀增加伤口，接种到诱导不定芽培养基上，于25～28℃条件下全暗培养4天，再转移至光照强度为1500～2000lx，培养温度为25～28℃的条件下，光照12小时，直至诱导形成不定芽为止。
26.进一步，带伤口的叶柄外植体横向放置在ms诱导培养基表面上进行诱导；诱导培养基的组分为ms基础培养基、1.2～1.8mg/l tdz、0.2～0.4mg/l2,4-d、0.1～0.15mg/l naa、20～25g/l蔗糖、4～5g/l琼脂，ph为5.4～5.78。
27.进一步，所述继代增殖培养具体为：将步骤1)诱导形成的不定芽从基部切下，接种到继代增殖培养基上进行继代培养，接种后置于光照强度为2500lx，培养温度为25～28℃的条件，每天光照12～15小时，继代培养长至2～4cm的不定芽。
28.进一步，所述生根培养具体为：将步骤2)继代培养长至2～4cm的不定芽分切并接种到生根培养基上进行诱导生根，接种后先在25～28℃条件下弱光培养3天，然后置于光照强度为2500lx，培养温度为25～28℃的条件下，每天光照12～15小时，培养至生根，得到生根试管苗。
29.进一步，所述炼苗移栽具体为：将长至5～8cm的生根试管苗的培养瓶瓶盖打开并置于自然光照下炼苗3～5天后，将生根试管苗从培养瓶中取出，洗掉根部培养基，栽入由泥炭土基质中并定植于塑料盆中。
附图说明
30.图1为本发明诱导不定芽培养基上培养图，其中a至b图为外植体至诱导形成不定芽；
31.图2为本发明的转移到继代增殖培养基培养图；
32.图3为本发明的转移到生根培养基上长图。
具体实施方式
33.以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
34.实施例1
35.一种丽花石山苣苔的组织培养方法，详见图1至3，包括如下步骤：
36.(1)诱导不定芽：选取继代无菌苗的叶柄为外植体，用解剖刀在叶柄上轻轻划几刀增加伤口。接种到诱导培养基上，于25～28℃条件下全暗培养4天，再转移至光照强度为1500lx，每天光照时间12小时，培养温度为25℃的条件下培养，直至诱导形成不定芽，不定芽诱导率可达96.2％。所述的诱导不定芽培养基为：ms基础培养基、1.0mg/l tdz、0.3mg/l kt、0.1mg/l naa、25g/l蔗糖、5g/l琼脂，ph为5.5；
37.(2)继代增殖培养：将步骤(1)获得的不定芽从基部切下，接种到增殖培养基上进
行继代培养，接种后置于每天光照12小时，光照强度为2500lx，培养温度为25℃的条件下培养，20天转接一次，增殖系数为10.41。所述的继代增殖培养基为：ms基础培养基、1.0mg/l 6-ba、0.05mg/l naa、25g/l蔗糖、4.0g/l琼脂，ph为5.5；
38.(3)生根培养：将步骤(2)继代培养长至2～4cm的不定芽切下并接种到生根培养基上进行诱导生根，接种后先在25℃条件下全暗培养3天，然后置于每天光照12小时，光照强度为2500lx，培养温度为25℃的条件下培养7天即开始生根，生根率可达95.5％。所述的生根培养基为：1/2ms基础培养基、0.1mg/l iba、1.0mg/l ggr(注：双吉尔-ggr，购自北京艾比蒂研究开发中心)、15g/l蔗糖、5g/l琼脂，ph为5.5。
39.(4)炼苗移栽：将长至6～8cm的生根试管苗的培养瓶瓶盖打开并置于自然光照下炼苗5天后，将试管苗从培养瓶中取出，洗掉根部培养基，栽入泥炭土基质中并定植于塑料盆中，移栽成活率为92％。
40.实施例2
41.一种丽花石山苣苔的组织培养方法，详见图1至3，包括如下步骤：
42.(1)诱导不定芽：选取继代无菌苗的叶柄为外植体，用解剖刀在叶柄上轻轻划几刀增加伤口。接种到诱导培养基上,于26℃条件下全暗培养4天，再转移至光照强度为2000lx，光照时间13小时，培养温度为26℃的条件下培养，直至诱导形成不定芽，不定芽诱导率可达93.4％。所述的诱导不定芽培养基为：ms基础培养基、2.0mg/l tdz、0.1mg/l kt、0.05mg/l naa、30g/l蔗糖、4.0g/l琼脂，ph为5.5；
43.(2)继代增殖培养：将步骤(1)获得的不定芽从基部切下，接种到增殖培养基上进行继代培养，接种后置于每天光照14小时，光照强度为2000lx，培养温度为26℃的条件下培养，25天转接一次，增殖系数为9.8。所述的继代增殖培养基为：ms基础培养基、1mg/l 6-ba、0.05mg/l naa、25g/l蔗糖、4.5g/l琼脂，ph为5.8；
44.(3)生根培养：将步骤(2)继代培养长至2～4cm的不定芽切下并接种到生根培养基上进行诱导生根，接种后先在26℃条件下全暗培养2天，然后置于每天光照12小时，光照强度为2500lx，培养温度为26℃的条件下培养10天即开始生根，生根率可达93％。所述的生根培养基为：1/2ms基础培养基、0.05mg/l iba、2.0mg/l ggr(注：双吉尔-ggr，购自北京艾比蒂研究开发中心)、18g/l蔗糖、5.0g/l琼脂，ph为5.8。
45.(4)炼苗移栽：将长至5cm的生根试管苗的培养瓶瓶盖打开并置于自然光照下炼苗4天后，将试管苗从培养瓶中取出，洗掉根部培养基，栽入泥炭土基质中并定植于大田中，移栽成活率为95％。
46.实施例3
47.一种丽花石山苣苔的组织培养方法，详见图1至3，包括如下步骤：
48.(1)诱导不定芽：选取继代无菌苗的叶柄为外植体，用解剖刀在叶柄上轻轻划几刀增加伤口。接种到诱导培养基上，于26℃条件下全暗培养4天，再转移至光照强度为2500lx，光照时间15小时，培养温度为25℃的条件下培养，直至诱导形成不定芽，不定芽诱导率可达90.1％。所述的诱导不定芽培养基为：ms基础培养基、1.5mg/l tdz、0.5mg/l kt、0.2mg/l iba、30g/l蔗糖、4.0g/l琼脂，ph为5.8；
49.(2)继代增殖培养：将步骤(1)获得的不定芽从基部切下，接种到增殖培养基上进行继代培养，接种后置于每天光照12小时，光照强度为2500lx，培养温度为25℃的条件下培
养，20天转接一次，增殖系数为8.02。所述的继代增殖培养基为：ms基础培养基、0.5mg/l 6-ba、0.1mg/l naa、25g/l蔗糖、5g/l琼脂，ph为5.8；
50.(3)生根培养：将步骤(2)继代培养长至2～4cm的不定芽切下并接种到生根培养基上进行诱导生根，接种后先在25℃条件下全暗培养5天，然后置于每天光照14小时，光照强度为2500lx，培养温度为25℃的条件下培养10天即开始生根，生根率可达98％。所述的生根培养基为：1/2ms基础培养基、0.1mg/l iba、1.0mg/l ggr(注：双吉尔-ggr，购自北京艾比蒂研究开发中心)、20g/l蔗糖、6g/l琼脂，ph为5.8。
51.(4)炼苗移栽：将长至3～5cm的生根试管苗的培养瓶瓶盖打开并置于自然光照下炼苗4天后，将试管苗从培养瓶中取出，洗掉根部培养基，栽入泥炭土基质中并定植于大田中，移栽成活率为96％。
52.对照例1
53.与实施例1相比，除了诱导不定芽培养基、继代增殖培养基及生根培养基不同外，其余培养条件均与实施例1相同。
54.所述步骤1)的诱导不定芽培养基为：ms基础培养基、0.3mg/l kt、0.1mg/l naa、25g/l蔗糖、5g/l琼脂，ph为5.5；不定芽诱导率为17.2％
[0055][0056]
所述步骤2)的继代增殖培养基为：ms基础培养基、0.05mg/l naa、25g/l蔗糖、5.0g/l琼脂，ph为5.5；增殖系数为1.58。
[0057]
所述步骤3)的生根培养基为：1/2ms基础培养基、15g/l蔗糖、5g/l琼脂，ph为5.5。生根率为46.9％。
[0058]
对照例2
[0059]
与实施例2相比，除了诱导不定芽培养基、继代增殖培养基及生根培养基不同外，其余培养条件均与实施例2相同。
[0060]
所述步骤1)的诱导不定芽培养基为：ms基础培养基0.1mg/l kt、0.05mg/l naa、30g/l蔗糖、4.0g/l琼脂，ph为5.5；诱导效率为15.5％。
[0061]
所述步骤2)的继代增殖培养基为：ms基础培养基、0.05mg/l naa、50g/l蔗糖、4.5g/l琼脂，ph为5.8；增殖系数为2.6％。
[0062]
所述步骤3)的生根培养基为：1/2ms基础培养基、18g/l蔗糖、5.0g/l琼脂，ph为5.8,；生根率为45.2％。
[0063]
对照例3
[0064]
与实施例3相比，除了诱导不定芽培养基、继代增殖培养基及生根培养基不同外，其余培养条件均与实施例3相同。
[0065]
所述步骤1)的诱导不定芽培养基为：ms基础培养基0.5mg/l kt、0.2mg/l naa、30g/l蔗糖、4.0g/l琼脂，ph为5.8；不定芽诱导率为20.7％。
[0066]
所述步骤2)的继代增殖培养基为：ms基础培养基、0.1mg/l naa、25g/l蔗糖、5g/l琼脂，ph为5.8；增殖系数为2.7％。
[0067]
所述步骤3)的生根培养基为：1/2ms基础培养基20g/l蔗糖、4.5g/l琼脂，ph为5.8；生根率为53.9％。
[0068]
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例
性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。