全身性过表达人源α-syn-nls转基因鼠的构建方法
技术领域：
：1.本发明属于生物
技术领域：
：，具体涉及一种人源α-syn-nls过表达的慢病毒载体及转基因鼠的构建方法。
背景技术：
：：2.帕金森病(parkinson’sdisease，pd)是一种年龄相关的慢性进行性神经系统疾病，其主要病理特征表现为中脑黑质纹状体多巴胺能神经元的变性或死亡及路易小体的形成，路易小体由α-突触核蛋白(snca,简称α-syn)为主的蛋白质异常聚集而形成。然而，α-syn蛋白在pd中的功能及致病机制尚未完全研究清楚。小鼠动物模型是研究α-syn蛋白质功能及pd发病机理的一个重要工具，尽管已经开发出许多模型，如α-syn蛋白的转基因动物模型，部分能表现出黑质及纹状体多巴胺能神经元减少或多巴胺水平降低以及行为障碍，但在大多数小鼠中都没有发现明显的黑质及纹状体变性，不能完美地再现pd的病理特征，给pd的研究带来了困扰，并且由于在生理条件下，α-syn蛋白主要分布于细胞质中，少量分布于细胞核内，而且由于α-syn蛋白与路易小体在细胞质共定位，所以先前大多数关于α-syn蛋白的研究主要集中在细胞质中，而忽略了细胞核中的α-syn蛋白。随着近年来pd患者脑组织中发现α-syn蛋白的核定位现象，人们逐渐意识到细胞核中α-syn蛋白的重要性，有研究结果表明在帕金森病(ad)和阿尔兹海默病(pd)患者大脑及氧化应激的细胞中，均发现α-syn蛋白趋向于向细胞核中聚集，且这些异常的核聚集与细胞毒性相关。因此对细胞核中α-syn蛋白的研究也越来越多。尽管我们前期研究中用过表达病毒载体paav-ires-hrgfp构建了α-syn-3*nls重组腺相关病毒载体，并且通过侧脑室注射该病毒获得全脑过表达核易位人源α-syn蛋白转基因鼠，这种转基因鼠的优点是因为局部注射到脑部位，脑部位可以快速表现出相关病理症状，缺点是不能全身性表达，表达持续时间也有待研究。针对α-syn异常聚集引起的胃肠反应或除脑部以外的神经系统的研究，paav-ires-hrgfp-syn-3*nls转基因小鼠存在缺陷的。3.慢病毒是逆转录病毒的一种，具有逆转录病毒的基本结构，但也有不同于逆转录病毒的组份和特性，作为基因治疗载体发展起来，最近已用于转基因动物制备。慢病毒像其它逆转录病毒一样，其基因组经逆转录后能整合在宿主dna上，由于病毒载体经改构后，不在宿主细胞增殖，不会导致寄主细胞的死亡，被它感染的或转化的动物细胞能够连续传代；这种载体的最大优势是能感染静止细胞、不产生嵌合体动物和稳定遗传。技术实现要素：4.本发明提供了一种全身性过表达人源α-syn-nls转基因鼠的构建方法，该方法首先通过pcr获取人源α-syn编码序列和sv40核易位信号序列，再通过bp反应获得含有目的序列的入门克隆载体，经bsai酶切后，通过lr反应将入门克隆载体构建成含有目的序列的重组表达载体α-syn-sv40nls，再经apali+nhei酶切后，以慢病毒lv过表达载体plv-egfp:t2a:puro-ef1a为骨架载体，将含有目的序列的重组表达载体α-syn-sv40nls构建入慢病毒载体中，进行病毒包装纯化得到过表达核输入α-syn的plv病毒(lv-egfp:t2a:puro-ef1a》hsnca/sv40nls)，采用受精卵原核注射方法注射该病毒，获得全身过表达核输入人源α-syn蛋白的转基因鼠，并且成功表现出与pd患者类似的运动功能障碍，这个模型有助于阐明长期的α-syn核定位与神经退行性疾病之间存在的密切联系，也有助于更好的了解α-syn核定位与神经系统疾病之外的全身性疾病及除脑部位之外的神经系统疾病之间的关系，从而有利于开展相关疾病的诊断和相关药物的研发工作。5.本发明具备的优点及效果如下：6.1、人源α-突触核蛋白在小鼠中并不会引起强烈的免疫排斥反应而被清除，可长期表达存在，并且其制作的模型更接近人类pd模型；7.2、慢病毒载体具有以下优点：a.慢毒载体是一种能非常高效的把外源基因稳定整合到哺乳动物细胞中的载体工具，位于两个ltr的dna片段和病毒基因组都会稳定整合到基因组中；b.慢毒载体不但感染分裂细胞，也感染静止细胞，被它感染的或转化的动物细胞的基因型可以发生改变并遗传到子代；8.因此，本发明所用载体lv-egfp:t2a:puro-ef1a》hsnca/sv40nls能稳定整合到小鼠基因组中并持续传代；9.3、包装的病毒只具有转染的能力，而无法在靶细胞中进行大量复制，因而具有很高的生物安全性；10.4、此模型建立的方法具有全身性、稳定性、长期性及高效性表达的特点，对研究基因、蛋白功能和机制具有系统性、完整性和代表性。附图说明11.图1为酶切鉴定最终构成的慢病毒载体，图中泳道55为apali+nhei(2066,3985,1246,2521)酶切正确，p55为未酶切的原质粒；12.图2为慢病毒人源α-syn-nls过表达载体结构示意图；13.图3为转基因小鼠westernblot检测结果；14.图4为转基因小鼠全身性免疫荧光图。具体实施方式15.下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容，实施例中使用的试剂和方法，如无特殊说明，均采用常规试剂和使用常规方法。16.实施例1：gateway技术构建载体(质粒)17.使用基于λ噬菌体位点专一重组系统的gateway技术构建载体(质粒)，gateway技术包含两步反应：bp反应，构建含有目的序列的入门克隆载体；lr反应，构建含有目的序列的重组表达载体。18.主要试剂：bpclonasetmiienzymemix(invitrogen)，lrclonasetmiiplusenzymemix(invitrogen)，primestartmhsdnapolymerase(takara)，sanprep柱式胶回收试剂盒(生工)，质粒小提试剂盒(tiangen)，taqdnapolymerase(fermentas)，dntpmix(fermentas)，generulertm100bpdnaladder(fermentas)，vbultrastable感受态细胞(vectorbuilder)，其他各种限制性内切酶(neb)。19.1、目的片段获取20.1.1引物设计：(bsai)21.引物-f：atcgggtctcgggctgccaccatggatgtattcatgaaaggactttcaaag22.引物-r：23.atcgggtctcggggttcatacctttctcttcttttttggggcttcaggttcgtagtcttgatac24.下划线是basi的识别位点，小写是保护碱基，下划斜体是酶切后会形成黏性末端；25.1.2pcr扩增26.人源α-syn编码序列的模板来源nm_001375286.1，如seqidno:1所示；sv40核易位信号序列为：ccaaaaaagaagagaaaggtatga；27.1.2.1pcr反应体系为：5×primerstartmbuffer10μl、dntpmixture(10μm)4μl、引物-f(10μm)1μl、引物-r(10μm)1μl、模板dna1μl、primerstartmhsdnapolymerase0.5μl，ddh2o加至50μl；28.1.2.2扩增程序如下：[0029][0030]1.2.36×loadingbuffer终止反应。[0031]1.2.4pcr产物1％琼脂糖凝胶电泳参照生工sanprep柱式胶回收试剂盒说明书进行，具体步骤为：[0032]a.用干净的手术刀片将含目的dna片段的琼脂糖凝胶块切下，放入1.5ml离心管中，称重；b.加入胶块重量3-6倍的bufferb2，50℃水浴5-10分钟溶胶。[0033]c.将融化好的溶液全部移入吸附柱，80000g离心30s，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中；[0034]d.向吸附柱中加入500μlwashsolution，9000g离心30s，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中；[0035]e.重复步骤(4)一次；[0036]f.将空吸附柱和收集管放入离心机，9000g离心1min；[0037]g.在吸附膜中央加入15-40μlelutionbuffer，室温静置1-2min，9000g离心1min，保存dna溶液。[0038]2、bp反应构建入门载体(pdown-hsnca/sv40nls)[0039]2.1bp反应，通过bp反应，构建入门克隆载体，反应体系如下：[0040][0041]2.2在25℃下bp反应3h，反应结束后加入蛋白酶k终止反应10min；[0042]2.3转化大肠杆菌感受态细胞：感受态细胞体积为100μl，将2μlbp反应产物加入到感受态细胞中，冰上孵育30min；[0043]2.442℃热激90s，冰上孵育2min，加入250μlsoc培养基，7℃、225rpm摇菌培养1h；[0044]2.5涂板：将100μl产物涂布到lb平板上，37℃孵育过夜；[0045]2.6挑取克隆菌落进行pcr鉴定，在lb平板上对待检测的菌落进行标记，菌落pcr反应体系为：[0046][0047][0048]反应程序为94℃，3min；94℃，30s；60℃，30s；72℃，1min/1-2kb；18-25个循环，72℃5-10min；[0049]2.71％琼脂糖凝胶进行电泳，确定阳性克隆菌落，阳性克隆摇菌培养进行质粒抽提，酶切及测序。[0050]3、lr反应构建最终载体plv[exp]-egfp:t2a:puro-ef1a》hsnca/sv40nls[0051]3.1lr反应，通过lr反应将目的序列重组到最终骨架载体，获得含有目的序列的重组表达载体，反应体系如下：[0052][0053]3.225℃，反应3h，反应结束后加入蛋白酶k终止反应10min。[0054]3.3转化大肠杆菌感受态细胞：感受态细胞体积为100μl，2μllr反应产物加入到感受态细胞中，冰上孵育30min；[0055]3.442℃热激90s，冰上孵育2min，加入250μlsoc培养基，37℃、225rpm下摇菌培养1h；[0056]3.5涂板：将100μl产物涂布到lb平板上，37℃孵育过夜；[0057]3.6挑取克隆菌落进行pcr鉴定，在lb平板上对待检测的菌落进行标记，菌落pcr反应体系为：[0058][0059][0060]反应程序：[0061]94℃3min[0062]94℃,30s；60℃,30s；72℃,1min/1-2kb；18-25个循环[0063]72℃5-10min。[0064]3.71％琼脂糖凝胶进行电泳，确定阳性克隆菌落。阳性克隆摇菌培养进行质粒抽提，酶切并送测序，酶切结果见图1。[0065]实施例2：慢病毒包装和收毒:[0066]实验相关仪器：洁净工作台sw-cj-2fd(苏净安泰)；研究级倒置显微镜ix73(olympus)；低速冷冻离心机(sorvall)；thermo超速冷冻离心机(optimaxpnbeckman)；二氧化碳孵箱(sterithermo)；[0067]试剂：lipofectamine(invitrogen)；opti-memi培养液(invitrogen)；蔗糖(sigma)；hek293细胞(atcc)。[0068]1、脂质体法转染hek293细胞及收毒[0069]1.1转染前一天接种hek293细胞到100mm培养皿内，加入含10％fbs的dmem培养基，在37℃、5％co2下培养24h，转染前细胞融合率约为80％～90％；[0070]1.2转染前1h换液，加入培养液继续培养；[0071]1.3分别混合a、b液，其中a液为1.5mlopti-mem与4μgdna，轻轻颠倒混匀；b液为1.5mlopti-mem与40μllipofectamine2000，轻轻颠倒混匀，室温静置孵育5min；将上述两管溶液混合轻轻颠倒混匀，室温静置，孵育20min；[0072]1.4将孵育后的转染复合物缓慢逐滴加到已换液的细胞内，轻微晃动混匀，在37℃、5％co2培养过夜，转染16h后换培养基为含10％fbs的dmem，继续再放入37℃、5％co2下培养；1.5转染48h后收集培养上清进行浓缩，4℃、2000g离心30min，离心上清0.45μm过滤去除细胞碎片；[0073]1.6滤液加入离心管，50000g离心2h收集慢病毒颗粒，弃上清；[0074]1.7每管沉淀用200μlhbss缓冲液重悬，分装后放入-80℃保存。最终构建好的慢病毒载体见图2。[0075]2、病毒纯化[0076]2.1将200μl病毒浓缩液加入至离心管，上层加入1.5ml的20％蔗糖溶液，平衡后50000g离心2h；[0077]2.2离心去上清，收集沉淀病毒颗粒，每管沉淀用200ulhbss缓冲液重悬，测定病毒滴度。[0078]3、慢病毒滴度检测[0079]3.1滴度测定(荧光计数法)[0080]3.1.1接种hek293细胞到96孔板，每孔接种100μl细胞悬液(104cels/well)，含10％fbs的dmem培养基，5％co2、37℃培养过夜；[0081]3.1.2次日按有限稀释法用含10％fbs的dmem培养基对病毒原液进行梯度稀释，从10-1到10-10，吸掉细胞孔内的培养液，分别加入稀释度为10-4到-10病毒液，每稀释度加3孔，每孔100μl病毒稀释悬液；[0082]3.1.3转导16h后换培养基为含10％fbs的dmem，继续再放入37℃、5％co2下培养。[0083]3.1.4p24elisa法测病毒滴度(elisa法)[0084]通过抗p24包被的微量滴定孔捕获hiv-1p24抗原，并与生物素化的第二抗-p24抗体结合。随后，加入链霉抗生物素蛋白-hrp缀合物和底物在溶液中色。用分光光度法测量颜色强度以指示样品中p24的水平，再用p24标准曲线进行精确定量。最终病毒滴度为：1.18×109tu/m。[0085]实施例3：转基因小鼠构建[0086]主要试剂：m2溶液(美国millipore)；三气培养箱(美国forma)；解剖显微镜和倒置显微镜(日本nikon公司)；显微操作系统(德国eppendorf公司)；培养皿、巴斯德吸管(美国falcon公司)；移液管(德国eppendorf公司)；注射用尿促性腺素(pmsg)和注射用绒促性素(hcg)购自宁波三生制药；矿物油(美国sigma)。[0087]1、受体母鼠的准备[0088]选择4-6周龄、体重20-25g的icr小鼠作为受体鼠，移植前一天晚上与切除输精管的icr小鼠交配，次日挑选见精栓母鼠作为受体移植。[0089]2、小鼠促排卵[0090]选择4-10周龄c57bl/6j雌小鼠腹腔内注射5国际单位(iu)的孕马血清促性腺激素(pmsg)，约在48-54h后再将2.5-5.0iu的人绒毛膜促性腺激素(hcg)注射于同一小鼠腹腔内，之后与性成熟的8-12周龄雄性c57bl/6j小鼠合笼。[0091]3、受精卵的采集[0092]合笼次日挑选见精栓的小鼠收集受精卵。用透明质酸酶消化卵丘复合物，并用预热1-2小时的m2培养液漂洗2-3次，清除卵丘细胞后，用无菌移液管将受精卵置于m2培养液中，上层覆盖矿物油(sigma，货号：m8410-1l)，放于37℃、5％co2孵箱培养。[0093]4、显微注射[0094]受精卵在孵育过程中注意观察原核的形成，一般受精卵培养2-4小时后，就有明显的原核出现，此时立即实施显微注射，慢病毒载体注射的浓度大约在1n-5ng/ml(1×10-5μl)，注射完之后的受精卵移入另一个新鲜的m2培养液中培养1-2小时。[0095]5、输卵管移植[0096]5.1移植[0097]用口径为150-160μm玻璃毛细管，长度约为7-10cm，先吸取约0.05cm长的m2液，然后再吸0.05cm的空气段，再吸约0.05cm长的m2液，再吸0.05cm的空气柱，完成2个液柱和2个气柱后，最后吸取受精卵15个，再吸0.05cm的空气柱，最后一段为0.05cm长的m2液，即整个移植液体柱顺序为：m2液柱-空气柱-m2液体柱-空气柱-胚胎液柱-空气柱-m2液体柱；5.2将假孕雌鼠用1.25％阿佛丁，按0.2ml/10g剂量肌肉注射麻醉后置于37℃恒温垫上，用碘酒棉擦拭小鼠背部，再用70％酒精擦拭，在离中线左侧约0.5厘米、背驼峰与后腿髋关节之间作竖行小切口(0.3-0.5cm)。用眼科镊钝性分离组织，轻轻移出脂肪垫、卵巢及输卵管。用小弹簧夹固定住脂肪垫。移动恒温垫使小鼠位于解剖显微镜下，适当调节显微镜及小鼠位置使其输卵管膨壶部清晰可见。用眼科小剪刀于漏斗部透明囊膜处剪开一小口约0.02cm，将上面准备好的移植管轻轻从此口插入到输卵管中约0.1-0.2cm深度，轻轻将受精卵吹进入漏斗部，见到漏斗部有3个气泡即可缓慢收回移植管，之后取掉弹簧夹用钝口镊子把脂肪垫和输卵管恢复原位，缝合创口，缝合完毕后创面涂抹红霉素眼膏；同样的步骤移植小鼠右侧输卵管。[0098]移植完毕小鼠在恒温垫上苏醒后转移至原来的笼子饲养。[0099]6、转基因小鼠的鉴定[0100]子鼠出生后7天可以取小鼠尾尖提取蛋白进行westernblot检测α-syn-nls的阳性表达情况，结果见图3；将出生的子代小鼠置于荧光显微镜的载物台上观察并拍照，结果见图4，由图可见小鼠产生全身性免疫荧光。因此，通过前两个试验表明转基因小鼠构建成功。当前第1页12当前第1页12