一种基于利用花瓣组织培养的菊花诱变育种方法

本发明涉及植物组织培养，涉及花瓣组织培养，尤其涉及一种基于利用花瓣组织培养的菊花诱变育种方法。

背景技术：

1、菊花(chrysanthemum morifolilium(ramat.)kitamura)是菊科菊属多年生花卉，原产于中国，在中国已有两千多年的栽培历史，是中国十大传统名花之一，也是世界重要的四大鲜切花之一。菊花不仅品种繁多、色彩艳丽、姿态万千，而且具有不畏风寒，傲霜怒放的品格，被誉为“花中君子”，自古受到人们喜爱，是集文化和经济价值于一体的重要观赏植物。菊花用途广泛，除可作为园林观赏植物外，还可以作药用和茶用。随着国民经济的发展和人们生活水平的提高，对菊花新品种优良性状的要求越来越高，目前菊花已成为国内外花市的一个消费热点。

2、菊花在我国通常采用常规的杂交育种方法来育种，虽然创造了不少优良品种，但实际的工作难度很大，培育周期长；也有采用分株、扦插等无性繁殖方法进行菊花繁殖，但是前述方法容易受到环境影响，易发生病毒感染、繁殖周期较长；植物组织培养技术萌芽于20世纪初，植物组织培养技术发明以来已经取得了很大的进展，自上世纪60年代以来植物组织培养已经从实验室研究阶段发展成为一种大规模成批量的工厂化生产方法。植物组织培养即植物无菌培养技术，是利用植物细胞的全能性将植物体离体的器官(如根、茎、叶、茎尖、花、果实等)、组织(如形成层、表皮、皮层、胚乳等)或细胞(如大孢子、小孢子、体细胞等)以及原生质体在无菌条件、适宜的培养基及光照、温度等人工条件下诱导出愈伤组织、不定芽、不定根，并形成完整的植株或产生具有经济价值的其它产品的技术。植物细胞的全能性是一种潜在的能力，指植物体上每个具有完整细胞核的植物细胞都具有该植物体的全部遗传信息以及产生完整植株的能力，无论是性细胞还是体细胞，在特定的条件下能够表达出来并产生完整植株。植物组织培养的过程为外植体在人工条件下产生脱分化形成愈伤组织，愈伤组织在特定条件下经诱导而再分化形成不定芽、不定根或胚状体，最后形成完整植株。植物组织培养技术不仅是植物快繁的重要手段，同时也是基因工程研究和育种的重要方法。植物再生方式指植物在组织培养过程中再分化的类型，也是组培中间繁殖体的类型，其与繁殖数量和繁殖速度有关；植物再生方式的类型有：(1)切段及丛生芽增殖，该方式移栽成活率高，遗传性状稳定，不易变异，繁殖数量多；(2)原球茎发生方式，该方式为兰花组培快速繁殖的主要途径，繁殖数量大，遗传性状稳定，不易变异；(3)不定芽发生方式，该方式遗传性状不稳定，易变异，适合培育新品种；(4)胚状体发生方式，其繁殖量大，但遗传性状不稳定，易变异，适合培养新品种。

3、目前在已经报道的菊花的组织培养体系中，茎尖、茎段、叶片和叶柄等通常用作外植体，以花瓣作为外植体的研究和应用相对较少，尚缺少高效的再生体系。用花瓣培养与茎尖培养不同，花瓣培养产生完整的植株需要脱分化为愈伤组织，再由愈伤组织分化为胚状体或不定芽，这一过程的遗传不稳定，容易发生变异，变异可能性的大小与品种有关，由于菊花品种繁多，不同品种的基因型存在较大差异，再生体系没有通用性。因此，针对不同菊花品种的特性，研究不同类型外植体的最适再生培养基，建立特定的高效稳定的再生体系是非常重要的。此外，与菊花的茎尖、茎段、叶片等其他外植体相比，以花瓣作为外植体进行组织培养时易发生体细胞无性系变异，且花瓣的病毒量少，取材方便，容易消毒，可以快速、简便地获得变异植株，采用花瓣组织培养得到的菊花植株，其花器官(瓣型、花色、花型等)会发生变异，通过愈伤组织的不定芽或胚状体途径获得菊花新品种或无病毒苗是获取菊花新品种的重要途径，因此，组织培养与体细胞无性系变异技术相结合为菊花诱变育种提供了新的思路和途径，建立以菊花花瓣为外植体的快速诱变育种技术体系，可为菊花新品种选育提供新方法与优质资源。

4、此外，一方面由于对本领域技术人员的理解存在差异；另一方面由于申请人做出本发明时研究了大量文献和专利，但篇幅所限并未详细罗列所有的细节与内容，然而这绝非本发明不具备这些现有技术的特征，相反本发明已经具备现有技术的所有特征，而且申请人保留在背景技术中增加相关现有技术之权利。

技术实现思路

1、在园艺市场中，红色系切花菊品种因较其他色系更加稀少而具更高的观赏价值和商业潜力，但因品种较少而更加珍贵，随着市场需求的急剧增加，分株、扦插等传统的繁殖方式已经不能满足市场的发展需求，而组织培养具有繁殖速度快、增殖效率高的特点，能够实现菊花的规模化生产，具有较高的经济效益和社会效益。目前菊花在组织培养技术中关于茎尖、茎段、叶片、花蕾等的植株再生均有研究，以花瓣作为外植体的研究和应用相对较少，尚缺少高效的再生体系。植物组织培养能够保持原母本的遗传特征，但研究表明，经过愈伤组织途径产生的新植株会出现变异，且花瓣的组织培养的变异率高于茎尖、腋芽等外植体，与现有技术中通过杂交育种、辐射诱变、化学诱变等方法得到菊花新品种的途径比较，利用花瓣作为外植体可产生变异植株，利用花瓣组织培养技术可以快速、简便地获得菊花的变异植株，为菊花诱变育种提供了新的思路和途径，因此，本发明将组织培养与体细胞无性系变异技术相结合为菊花诱变育种提供了新的思路和途径，建立以菊花花瓣为外植体的快速诱变育种技术体系，可为菊花新品种选育提供新方法与优质资源。

2、针对现有技术之不足，本发明提供了一种基于利用花瓣组织培养的菊花诱变育种方法，所述方法包括如下步骤：

3、(1)外植体消毒：取菊花的花瓣为外植体，进行外植体消毒；

4、(2)愈伤组织及再生芽诱导：将步骤(1)消毒好的外植体接种于再生培养基中进行愈伤组织及再生芽诱导；

5、(3)生根培养：将步骤(2)所得再生芽接入生根培养基中进行培养v

6、(4)炼苗移栽：对步骤(3)中所得组培苗进行炼苗后移栽至基质中培养。

7、根据一种优选实施方式，所述步骤(1)中选取菊花‘红丹特’完全盛开的中层和外层舌状花为外植体。

8、根据一种优选实施方式，将所述步骤(1)消毒好的花瓣用剪刀剪去四周边缘，将其剪成约0.5cm2大小，远端轴向下放置在再生培养基中进行再生。

9、根据一种优选实施方式，所述步骤(1)的消毒体系为：75％乙醇消毒30s+1％次氯酸钠消毒5min。消毒方法为：洗洁精水震荡冲洗30min，流水冲洗2h，转入超净工作台再用75％乙醇表面消毒30s，无菌水冲洗2～3次，后用1％的次氯酸钠处理5min，无菌水冲洗3～5次，最后用滤纸吸干外植体表面水分备用。

10、优选地，所述步骤(2)中的外植体每4周继代一次。

11、优选地，所述步骤(2)的愈伤组织及再生芽诱导的培养条件为光照周期光照16h，黑暗8h，温度23±1℃。

12、优选地，所述步骤(3)的生根培养条件为光照周期光照16h，黑暗8h，温度23±1℃。

13、优选地，所述步骤(4)中组培苗利用水培法炼苗。步骤(4)中组培苗利用水培法炼苗2～3天，然后将小苗移栽到基质中，浇透水后放入长日照培养室培养。

14、优选地，所述步骤(4)炼苗后移栽至草炭土与蛭石比例为3∶1的基质中培养。

15、优选地，所述步骤(4)的培养条件为光照周期光照16h，黑暗8h，温度23±1℃。

16、本发明还提供一种愈伤组织及再生芽诱导方法，包括如下步骤：将所述步骤(1)消毒好的外植体接种于第一培养基中进行愈伤组织诱导；培养14天后，更换培养基，将愈伤组织置于第二培养基中培养，培养28d时更换至第三培养基中继续培养，培养40d时，将其接种在生根培养基中生长，

17、所述第一培养基为：ms+6-苄氨基嘌呤(6-ba)1.0mg/l+萘乙酸(naa)0.5mg/l+2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-d)0.75mg/l，含3.0％蔗糖和0.75％琼脂，ph 5.8～5.9；

18、所述第二培养基为：ms+6-苄氨基嘌呤(6-ba)2.0mg/l+萘乙酸(naa)1.0mg/l，含3.0％蔗糖和0.75％琼脂，ph 5.8～5.9；

19、所述第三培养基为：ms+6-苄氨基嘌呤(6-ba)2.0mg/l+萘乙酸(naa)1.0mg/l，含3.0％蔗糖和0.75％琼脂，ph 5.8～5.9。

20、本发明还提供一种基于利用花瓣组织培养的菊花诱变育种方法的再生培养基，再生培养基为：以ms培养基为基本培养基，添加浓度为1.0～3.0mg/l的6-苄氨基嘌呤(6-ba)、0.1～1.0mg/l的萘乙酸(naa)，含3.0％蔗糖和0.75％琼脂，ph 5.8～5.9。

21、根据一种优选实施方式，再生培养基为：ms+6-苄氨基嘌呤(6-ba)2.0mg/l+萘乙酸(naa)1.0mg/l，含3.0％蔗糖和0.75％琼脂，ph 5.8～5.9。

22、本发明还提供一种基于利用花瓣组织培养的菊花诱变育种方法的生根培养基，生根培养基为：1/2ms+萘乙酸(naa)0.02mg/l，含3.0％蔗糖和0.75％琼脂，ph 5.8～5.9。

23、本发明还提供一种基于利用花瓣组织培养的菊花诱变育种方法、所述方法中的培养基以及愈伤组织及再生芽诱导培养基在菊花新品种选育中的应用。

24、本发明的有益效果：本发明针对‘红丹特’这一品种再生率较低的问题，尝试了大量的分化培养基筛选来优化组培体系，提高再生体系，进而扩大获得突变体的数量，以获得更多的变异植株，本发明提供了一种基于利用花瓣组织培养的菊花诱变育种方法，并建立了一种以花瓣为外植体的菊花再生体系。该方法包括外植体消毒、愈伤组织及再生芽诱导、生根培养、炼苗移栽四个过程，其以菊花中层和外层舌状花为外植体，所述外植体消毒方法为75％乙醇消毒30s，再用1％次氯酸钠消毒5min；所述愈伤组织及再生芽诱导培养基为以ms为基础培养基，添加2.0mg/l6-ba和1.0mg/l naa；所述生根培养基为在1/2ms基础上添加0.02mg/l naa，本发明通过上述四个步骤建立了一个以花瓣为外植体的高效稳定的再生体系并获得再生突变植株，提供了花瓣愈伤组织诱导、不定芽分化和生根的最优植物生长调节剂种类和浓度，获得最优再生及生根培养基。根据本实验的结果可知，与传统育种相比，本发明利用花瓣再生仅需要45d即可获得再生芽，而传统育种需要经过杂交授粉和种子成熟，萌发，这一过程需要数月。本技术可以快速获得红色系列菊花切花新品种，现有技术侧重于菊花花瓣再生体系的建立，并没有关注和统计再生植株是否发生变异以及变异情况，本发明提出并验证了在红色系菊花花瓣作为外植体培养时，具有再生植株变异系数大，且再生植株变异率高，并可以快速拿到新种质的特点。本发明不仅提出菊花花瓣再生方法，同时也提供了变异情况统计和观测，为菊花新品种培育的具体实施提供了参考和预期结果。本发明发现，在再生过程中，花瓣作为外植体，可产生变异植株，且再生植株变异率高，与传统杂交、诱变育种等手段相比，本发明建立了以菊花花瓣为外植体的快速诱变育种技术体系，可以快速、简便地获得变异植株，同时，本发明提供的菊花再生体系的建立方法为菊花诱变育种提供了新的思路和途径，为菊花新品种选育提供了优质资源。