无菌甲壳纲动物模型的构建方法与应用

本发明涉及无菌甲壳纲动物模型的构建方法与应用。

背景技术：

1、无菌动物是指利用现有的手段、技术在体内外检测不到任何活的微生物、病毒和寄生虫的动物。无菌动物的发展史可以追溯到1896年nuttal和thierfelder在无菌实验室中以剖腹产的方式接生了第一个无菌动物(豚鼠)。随着技术的不断发展，无菌动物的研究逐渐系统化，研究人员也掌握了无菌类动物模型的饲养技术，而饲养的无菌动物模型也逐渐扩展到小鼠、鸡、猪和山羊等物种。尽管无菌动物模型的物种范围在逐步扩展，但是可以发现基本都是集中在脊椎动物，而进化地位较低的无脊椎动物却鲜见作为动物模型。尤其是水产养殖中的无脊椎动物的研究受限于环境及物种因素，无法开展深入的微生物与宿主相互关系的内在机制研究。

2、目前研究宿主-微生物相互作用的主要动物模型是无菌小鼠和无菌斑马鱼，它们具备两个重要的特点：一是基因型已经得到很好的表征；二是转接对象与该无菌模型(无菌小鼠或无菌斑马鱼)的基因组在功能上能够达到99％的相似度。微生物学家通过无菌模型和正常动物的比对来研究微生物对宿主各方面的影响，通过添加单一或者复合的微生物菌株来研究微生物与宿主之间的互作。脊椎动物模式生物的斑马鱼作为肠道微生物与宿主相互关系的重要研究模型，虽然相较于小鼠具有体外受精、繁殖能力强、生命力旺盛、饲养成本低等优势，但是对于水生无脊椎动物的相关研究却无法转接到无菌斑马鱼模型，因此亟需一种甲壳类动物作为无菌甲壳纲动物模型，用于进一步探索微生物和甲壳纲动物宿主相互关系。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是如何提供一种甲壳纲动物作为无菌甲壳纲动物模型。

2、丰年虫，又名卤虫、丰年虾、仙女虾等，是一种广泛分布于世界各地的耐高盐度的小型甲壳动物，属于节肢动物门中甲壳纲。这与目前水产养殖中的虾、蟹等经济甲壳类同属于甲壳纲，因此其是作为无菌甲壳类动物模型的理想对象。旧金山丰年虫(artemiafranciscana)是我国上个世纪90年代后引进的原产于美国主要丰年虫产区旧金山湾的一种丰年虫品种，具有较高的繁殖率和较强的适应性，其全基因组已被公布于nationalcenter for biotechnology information(ncbi)。因此无菌丰年虫的培养与应用，以此作为研究微生物与甲壳纲动物之间相互作用的无菌模型，对进一步探索微生物和甲壳纲动物宿主相互关系的内在机制具有重要意义。

3、为解决上述技术问题，本发明首先提供了无菌丰年虫在制备无菌甲壳纲动物模型中的应用。

4、具体而言，前述应用涉及将无菌丰年虫用作无菌甲壳纲动物模型，验证某物质、一种甚至多种微生物对无菌甲壳纲动物的影响。

5、所述物质可以为天然的物质或经化学、生物等方法合成的物质，可以是单一的化合物，也可为混合物。

6、所述影响包括对无菌丰年虫的生长性能、先天免疫、抗应激等各方面的影响。

7、所述微生物除包括微生物本体外，还包括微生物所产生的代谢物、培养物。

8、本发明还提供了无菌丰年虫在作为无菌甲壳纲动物模型中的应用。

9、本发明还提供了无菌丰年虫在制备研究甲壳纲动物与微生物相互作用的动物模型中的应用。

10、本发明还提供了无菌丰年虫在作为研究甲壳纲动物与微生物相互作用的动物模型中的应用。

11、前述微生物包括各类天然的自然界中分离的微生物，也包括各类经人工处理后的微生物。

12、进一步的，上述应用中所述无菌丰年虫按照包括如下步骤的方法制备：将丰年虫虫卵经过浸泡、脱壳除菌、孵化和无菌性检验后，得到无菌丰年虫，所述无菌丰年虫为无菌甲壳纲动物模型；所述浸泡包括将丰年虫虫卵用无菌水进行浸泡，得到含有浸泡后的丰年虫虫卵的水体；所述脱壳除菌，包括如下步骤：向所述含有浸泡后的丰年虫虫卵的水体中加入naoh溶液和naclo溶液并通入无菌空气，得到脱壳除菌水体，1.5～3min后中和水体，得到中和后的水体，在所述中和后的水体中收集丰年虫虫卵，得到脱壳除菌的丰年虫虫卵；所述naoh溶液的加入量满足所述脱壳除菌水体中naoh的含量为40g/100ml，所述naclo溶液的加入量满足所述脱壳除菌水体中naclo的含量为50g/100ml；所述孵化，包括如下步骤：将所述脱壳除菌的丰年虫虫卵转移至无菌亚甲基蓝海水溶液中，通入无菌气体，25～30℃光照培养箱中孵育26～30h，得到孵化后的丰年虫虫体和水体；所述无菌性检验，包括如下步骤：将孵化后的丰年虫虫体和水体分别接种于培养基中检测为无菌后，所得丰年虫虫体即为无菌丰年虫。

13、进一步的，上述应用中所述无菌亚甲基蓝海水溶液的溶质为亚甲基蓝，溶剂为3％无菌海水，亚甲基蓝的浓度为0.1g/100ml。

14、进一步的，上述应用中所述孵化中光照的光量子通量密度为27μe/m2/s。

15、进一步的，上述应用中所述中和水体包括如下步骤，向通入无菌空气处理后的水体中加入na2s2o3溶液，所述na2s2o3溶液的加入量满足所述中和后的水体中na2s2o3的含量为0.001g/100ml。

16、进一步的，上述应用中所述无菌性检验中的培养基包括2216e琼脂培养基、ypd琼脂培养基、mrs琼脂培养基和lb琼脂培养基。

17、本发明还提供了用于构建无菌甲壳纲动物模型的组合物，所述组合物包括naoh、naclo、na2s2o3和亚甲基蓝、海水。

18、实验证明，本发明与现有技术相比，具有以下优点：

19、本发明通过实验验证表明，无菌丰年虫可用于制备无菌甲壳纲动物模型或直接作为无菌甲壳纲动物模型。由于无菌丰年虫本身生长周期较短，可极大的缩短研究周期，为以无菌甲壳纲动物模型为基础的研究如微生物与宿主关系的研究等提供帮助。

技术特征：

1.无菌丰年虫在制备无菌甲壳纲动物模型中的应用。

2.无菌丰年虫在作为无菌甲壳纲动物模型中的应用。

3.无菌丰年虫在制备研究甲壳纲动物与微生物相互作用的动物模型中的应用。

4.无菌丰年虫在作为研究甲壳纲动物与微生物相互作用的动物模型中的应用。

5.根据权利要求1～4任意一项所述的应用，其特征在于，所述无菌丰年虫按照包括如下步骤的方法制备：将丰年虫虫卵经过浸泡、脱壳除菌、孵化和无菌性检验后，得到无菌丰年虫，所述无菌丰年虫为无菌甲壳纲动物模型；

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述无菌亚甲基蓝海水溶液的溶质为亚甲基蓝，溶剂为3％无菌海水，亚甲基蓝的浓度为0.1g/100ml。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述孵化中光照的光量子通量密度为27μe/m2/s。

8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述中和水体包括如下步骤，向通入无菌空气处理后的水体中加入na2s2o3溶液，所述na2s2o3溶液的加入量满足所述中和后的水体中na2s2o3的含量为0.001g/100ml。

9.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述无菌性检验中的培养基包括2216e琼脂培养基、ypd琼脂培养基、mrs琼脂培养基和lb琼脂培养基。

10.用于构建无菌甲壳纲动物模型的组合物，所述组合物包括naoh、naclo、na2s2o3和亚甲基蓝、海水。

技术总结
本发明公开了一种无菌甲壳纲动物模型的构建方法与应用。本发明提供的无菌甲壳纲动物模型具体为无菌丰年虫，通过实验验证表明，该无菌丰年虫可作为无菌甲壳纲动物模型。由于无菌丰年虫本身生长周期较短，可极大的缩短研究周期，为以无菌甲壳纲动物模型为基础的研究提供帮助。

技术研发人员：周志刚,刘树彬,张震,于哲,杨宏伟,张青双,冉超,杨雅麟,药园园,丁倩雯
受保护的技术使用者：中国农业科学院饲料研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13