用于大规模植物细胞培养的稳定高产黄酮的雪莲细胞系及其建立方法

专利名称:用于大规模植物细胞培养的稳定高产黄酮的雪莲细胞系及其建立方法
技术领域：
本发明涉及用于大规模植物细胞培养的稳定高产黄酮的雪莲细胞系及其建立方法，更具体地说是利用生物工程技术，通过人工诱变使雪莲的愈伤组织发生基因突变，获得稳定高产雪莲黄酮的雪莲细胞系及其建立方法，属于生物工程领域和中药现代化领域。
水母雪莲(Saussurea medusa Maxim)系菊科凤毛菊属植物，是一种名贵植物药材，产于我国甘肃、青海、西藏、新疆等地的海拔4800～5100米的高山砾石间。具有散寒除湿、壮阳补血、抗炎镇痛等作用，民间用于治疗风湿性关节炎、阳萎、妇女月经不调、胎衣不下、高山不适应症等。最近临床及药理研究证明，雪莲有延缓衰老及治疗脑动脉硬化、缺血性中风等症。雪莲提取物金合欢素(jaceosidin)和高车前素(hisidulin)对治疗癌症、抗炎和抗衰老具有明显的作用。用雪莲研制的雪莲注射液和雪莲风湿胶囊对治疗风湿症具有良好的效果。但是雪莲的人工栽培未能成功，由于掠夺性采挖，天然雪莲资源已经严重匮乏，而人工化学合成其中的有效药用成分目前又无法实现，因此，为保护国家珍稀植物，满足临床需求，一个十分有希望的方法是通过植物细胞的大规模培养生产雪莲的有用次生代谢产物。
中国科学院植物研究所赵德修研究员申请的雪莲细胞系专利(申请号00123740.3，公开号CN1340611A)具有较好的细胞生长特性和较高的生物合成黄酮的能力，但仍存在一些不足(1)黄酮含量还较低；(2)对环境尤其是对温度的变化适应能力较差；(3)不太适合用生物反应器大规模高密度培养，而这会限制其产业化。(4)未考察细胞的遗传稳定性。本发明则采用几种诱变手段，获得了可以无限传代培养的稳定高产雪莲黄酮的雪莲细胞系。
本发明的另一个目的是提供这个细胞系的建立方法。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案稳定高产次级代谢产物黄酮的雪莲细胞系TUIP-8，并在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市海淀区中关村北一条13号，100080，电话010-62542758)，保藏日为2002年12月16日，保藏号为CGMCC No.0855，建议的分类命名为水母雪莲紫色细胞系。该雪莲细胞系具有以下特征颜色为深紫色，结构致密，质地较硬，黄酮含量为细胞干重的12％左右，细胞的培养密度可达20g(干重)/L以上，黄酮产量一般为2.5g/L，培养周期一般为7～10天。
一种建立稳定高产次级代谢产物黄酮的雪莲细胞系的方法，该方法包括以下步骤(1)天然植株愈伤组织的诱导和培养；(2)愈伤组织的筛选，获得原始雪莲细胞系；
(3)人工诱变；(4)高产稳定细胞系的筛选、传代；(5)高产细胞系的培养。
所述人工诱变包括60Co-γ射线照射诱变、温度诱变和紫外诱变。对原始雪莲细胞系采用60Co-γ射线照射诱变，以获得黄酮产量更高的雪莲细胞系；对60Co-γ射线照射诱变获得的雪莲细胞系采温度诱变即用高温和低温培养，使其基因发生突变，以适应较宽温度范围生长的需要，并且提高细胞生物合成次级代谢产物黄酮的能力；对几种雪莲细胞采用紫外光线照射，使其基因发生突变，以提高细胞生物合成次级代谢产物黄酮的能力。
本发明的优点是本发明是通过人工诱变方法，使雪莲的愈伤组织发生基因突变，并获得可无限传代培养的稳定高产雪莲黄酮的雪莲细胞系。该细胞系(1)黄酮产量大，黄酮含量占细胞干重的12％左右，培养密度高，大于20g(干重)/L培养基，培养周期短，一般为10d。(2)稳定性高、可无限传代。(3)生长温度范围较宽，在18～30℃范围内生长良好。(4)不存在两相培养，在整个培养周期内不会使细胞损伤。(5)在反应器中生长良好，适合大规模反应器培养植物细胞实现产业化。因此在一定的环境下悬浮培养该雪莲细胞，可以制各大量的雪莲细胞培养物作为雪莲药材原料以取代天然雪莲的采挖，保护了国家珍惜药用植物资源，同时满足了临床用药需求。
一、天然植株愈伤组织的诱导和培养取天然水母雪莲的芽或嫩茎做外植体，用自来水充分冲洗干净，在75％乙醇中浸泡30s，再用高压灭菌的去离子水反复冲洗5次，放在经高压灭菌的新华滤纸上吸干去离子水。用无菌手术剪刀或无菌刀片将处理好的雪莲芽或嫩茎切成2～3mm长的小段，在MS(配方见表1)中添加0.2mg/L-0.4mg/L BA(苄基腺嘌呤)、1mg/L-4mg/L NAA(奈乙酸)、0.8g/L琼脂及40g/L-50g/L蔗糖固体培养基上生长，25℃光照培养，约14d诱导出愈伤组织。
表1MS培养基配方


二、愈伤组织的筛选，原始雪莲细胞系的获得1、挑选颜色最深、色彩鲜亮、质地致密较硬的组织在固体培养基上继代培养，培养条件温度为25℃，用光照强度为50～100μmol/(m2·s)的日光灯照射，每隔15～20d继代一次；2、用目测法从固体培养基中挑选颜色最深、色彩鲜亮的紫色愈伤组织于装有50mL液体培养基的300mL三角摇瓶中悬浮培养，液体培养基为MS添加适当的植物生长激素及40g/L蔗糖，接种量约为鲜重3g/瓶，摇床转速150r/min，6～7d换液30mL，12d后再从液体培养基中挑选颜色紫黑、色彩光鲜、质地致密的细胞团转移到固体培养基上培养，接种的细胞团的大小约为3mm，4～5d后挑选色泽均一鲜亮、质地致密较硬的细胞块分割成大小约1～2mm的细胞团继续在固体培养基上继代培养12～15d，之后再挑选细胞转入液体中培养。如此由固体培养至液体悬浮培养再至固体培养反复筛选多次，便可得到性质稳定的紫色原始雪莲细胞系RP-1。采用紫外分光光度法测定RP-1细胞中黄酮含量，其黄酮含量约为细胞干重的4.34％±0.21％(wt％)，而天然雪莲花中的黄酮含量一般只有0.4～0.5wt％。
三、人工诱变1、60Co-γ射线照射诱变分别采用2.5Gy，5Gy，10Gy，20Gy和40Gy的剂量、照射速率为0.9Gy/min的60Co-γ射线照射在固体培养基上生长了10d的RP-1细胞系，并进行继代培养，按照步骤二所述的方法由固体培养至液体悬浮培养再至固体培养反复筛选性质稳定的细胞系。结果如
图1所示，其中经40Gy照射筛选到的IRP-5细胞系黄酮含量最高，约为细胞干重的6％，黄酮含量比原始细胞系RP-1提高了近40％。
2、温度诱变将60Co-γ射线照射获得的高产黄酮细胞系IRP-5置于37℃下培养20h，并进行继代培养，按照步骤二所述的方法反复筛选性质稳定的细胞系。再将获得的高产细胞系置于15℃下培养24h，按同样方法筛选。结果如图2所示，得到的细胞系TIP-33在摇瓶中的培养密度可达18.6±2g(干重)/L，黄酮含量约10％，是天然植株的约20倍。
3、紫外诱变(1)将60Co-γ射线照射获得的高产黄酮细胞系IRP-5置于距离功率为20W的紫外灯下30cm处照射30min，按照步骤二所述的方法反复筛选性质稳定的细胞系，得到的UIP-17细胞系，其黄酮含量从5.96％提高到8.8％。
(2)将60Co-γ射线照射诱变和温度诱变获得的高产黄酮细胞系TIP-33置于距离功率为20W的紫外灯下30cm处照射30min。按照步骤二所述方法反复筛选性质稳定的细胞系，结果如图2所示，得到的紫黑色雪莲细胞系TUIP-8的黄酮含量从8.8％提高到12.3％。
四、高产稳定细胞系的筛选、传代雪莲细胞系TUIP-8在25℃条件下，用300mL三角摇瓶悬浮培养，装液量为50mL，接种密度约为3～4g(干重)/L，6～7d换液30mL，每隔10～12d传代一次，结果如图3所示，连续传代悬浮培养50代以后，细胞的生长特性和黄酮生物合成特性保持不变，在摇瓶中的培养密度一直维持在19g(干重)/L，黄酮含量一直维持在12％，表明获得的细胞系TUIP-8是一株可无限传代培养的高产稳定的性质均一的雪莲细胞系。
五、高产细胞系的培养在三角摇瓶中悬浮培养高产细胞系300mL三角摇瓶悬浮培养，装液量为50mL，接种密度约为3～4g(干重)/L，培养基为MS添加适当的植物生长激素及40g/L蔗糖，摇床转速150r/min。如果培养温度为25℃，则6d～7d换液30mL，每隔10d～12d传代一次或者直接收获细胞。收获的细胞挤干水分后可用95％的乙醇溶液浸取其中的黄酮，也可在60℃～65℃下烘干保存，烘干的细胞可用70％的乙醇溶液浸取其中的黄酮。用旋转蒸发器蒸发乙醇和水，便可得到黄酮粗品。
该雪莲细胞系具有下列优点(1)黄酮产量大、培养密度高、培养周期短。
(2)稳定性高、可无限传代。
(3)该雪莲细胞系不存在植物细胞培养中较普遍存在的两相培养，即生长相和诱导相培养，细胞在整个培养周期不会受到损伤，因而易实现植物细胞连续培养和收获以提高反应器的生产能力。
(4)生长温度范围较宽，在18～30℃范围内生长良好。
(5)在反应器中生长良好，适合大规模反应器培养植物细胞实现产业化。
因此在一定的环境下悬浮培养该雪莲细胞，可以制备大量的雪莲细胞培养物作为雪莲药材原料以取代天然雪莲的采挖，保护了国家珍惜药用植物资源。从该细胞培养物中可提取到高含量的雪莲的主要活性成分黄酮类化合物，用于研究开发成各种治疗和保健用中药，为大量培养生产雪莲黄酮类化合物等药用成分并实现产业化奠定了良好的基础。
实施例2、稳定高产雪莲黄酮雪莲细胞系TUIP-8的摇瓶培养稳定高产雪莲黄酮雪莲细胞系TUIP-8经过37℃高温和15℃低温诱变，获得了能在18～30℃较宽温度范围良好生长的能力。如表2和图4所示，在30℃环境下生长，细胞比生长速率较快，但细胞团含水量大，最终长满整个摇瓶的最大培养密度可达16.9g(DW)/L，但黄酮含量较低。而在18℃环境中培养，细胞生长缓慢且致密，培养周期较长，细胞团含水量小，质地较硬，因此可以达到较高的培养密度(25.6g(DW)/L)，细胞中的黄酮含量稍有下降。综合各种因素，我们在培养过程中一般设定培养温度为20～25℃，在这种环境下，细胞生长速度适中，培养密度一般为20g(干重)/L，黄酮含量在11％～13％左右。
使用本方法培养的雪莲细胞系TUIP-8密度高，黄酮产量大。在摇瓶中进行悬浮培养，细胞生长量为20±2g/L(DW)，细胞总黄酮生产量为2.3g/L～2.5g/L，培养周期为7～12d。
表2温度对悬浮培养TUIP-8雪莲细胞生长和黄酮合成的影响温度比生长速率最大培养密度黄酮含量黄酮产量最优培养时间(℃) (d-1)(g(DW)/L) (％)(mg/L) (d)*18 0.16825.6 10.15 2598.41625 0.22119.8 12.23 2421.51230 0.26616.9 8.861497.38*当细胞接种密度约为3～4g(DW)/L.时实施例3、稳定高产雪莲黄酮雪莲细胞系TUIP-8的反应器培养在7.5L Biostat CT在位灭菌搅拌式生物反应器(德国B.Braun公司)中培养，接种密度为2.5g(干重)/L，培养温度为25℃，pH控制在4.8～5.6，溶解氧(DO)控制在30％～60％，采用直接曝气的气体分布器供氧，搅拌转速为60r/min～90r/min，培养基为MS培养基，添加0.2mg/L-0.4mg/L BA(苄基腺嘌呤)、1mg/L-4mg/L NAA(奈乙酸)及40g/L-50g/L蔗糖，装液量为6L，培养至第7天换液4L，至12d～14d下罐收获细胞，整个反应器中充满了新鲜的雪莲细胞，细胞的堆积体积接近100％，即细胞几乎生长至培养基液面，可收获细胞130g(干重)以上，培养密度一般为21g/L工作体积，黄酮含量大于11％，利用该反应器一次培养可获得黄酮14g以上。
权利要求
1.稳定高产次级代谢产物黄酮的雪莲细胞系TUIP-8，其保藏号为CGMCCNo.0855。
2.一种建立稳定高产次级代谢产物黄酮的雪莲细胞系的方法，其特征在于该方法包括以下步骤(1)天然植株愈伤组织的诱导和培养；(2)愈伤组织的筛选，原始雪莲细胞系的获得；(3)人工诱变；(4)高产稳定细胞系的筛选、传代；(5)高产细胞系的培养。
3.根据权利要求
2所述的方法，其特征在于所述人工诱变包括60Co-γ射线照射诱变、温度诱变和紫外诱变。
4.根据权利要求
2所述的方法，其特征在于所述步骤(1)天然植株愈伤组织的诱导和培养是指取天然水母雪莲的种胚或嫩茎进行处理消毒处理，并切成2～3mm长的小段，在MS中添加0.2mg/L-0.4mg/L BA(苄基腺嘌呤)、1mg/L-4mg/L NAA(奈乙酸)、0.8g/L琼脂及40g/L-50g/L蔗糖固体培养基上生长，25℃光照培养，诱导出愈伤组织。
5.根据权利要求
2所述的方法，其特征在于所述步骤(2)愈伤组织的筛选，原始雪莲细胞系的获得是指(1)挑选颜色颜色最深、色彩鲜亮、质地致密较硬的组织在固体培养基上继代培养，培养条件温度为25℃，用光照强度为50～100μmol/(m2.s)的日光灯照射，每隔15～20d继代一次；(2)从固体培养基中挑选颜色最深、色彩鲜亮的紫色愈伤组织于装有50mL液体培养基的300mL三角摇瓶中悬浮培养，液体培养基为MS添加适当的植物生长激素及40～50g/L蔗糖，接种量约为鲜重3g/瓶，摇床转速150r/min，6～7d换液30mL，12d后再从液体培养基中挑选颜色紫黑、色彩光鲜、质地致密的细胞团转移到固体培养基上培养，接种的细胞团的大小约为3mm，4～5d后挑选色泽均一鲜亮、质地致密较硬的细胞块分割成大小约1～2mm的细胞团继续在固体培养基上继代培养12～15d，之后再挑选细胞转入液体中培养；如此由固体培养至液体悬浮培养再至固体培养反复筛选多次，得到性质稳定的紫色原始雪莲细胞系RP-1。
6.根据权利要求
3所述的方法，其特征在于所述60Co-γ射线照射诱变是指分别采用2.5～40Gy的剂量、照射速率为0.9Gy/min的60Co-γ射线照射在固体培养基上生长了10d的RP-1细胞系，并进行继代培养，由固体培养至液体悬浮培养再至固体培养反复筛选性质稳定的细胞系。
7.根据权利要求
3所述的方法，其特征在于所述温度诱变是指将60Co-γ照射获得的高产黄酮细胞系IRP-5置于37℃下培养20h，并进行继代培养，由固体培养至液体悬浮培养再至固体培养反复筛选性质稳定的细胞系；再将获得的高产细胞系置于15℃下培养24h，按同样方法筛选，得到细胞系TIP-33。
8.根据权利要求
3所述的方法，其特征在于所述紫外诱变是指(1)将60Co-γ照射获得的高产黄酮细胞系IRP-5置于紫外灯下照射30min，反复筛选性质稳定的细胞系，得到UIP-17细胞系；(2)将60Co-γ照射诱变和温度诱变获得的高产黄酮细胞系TIP-33置于紫外灯下照射30min，得到TUIP-8细胞系。
9.根据权利要求
2所述的方法，其特征在于所述步骤(4)高产稳定细胞系的筛选、传代指雪莲细胞系TUIP-8在25℃条件下，用300mL三角摇瓶悬浮培养，装液量为50mL，接种密度约为3～4g(干重)/L，6～7d换液30mL，每隔10～12d传代一次。
10.根据权利要求
2所述的方法，其特征在于所述步骤(5)高产细胞系的培养是指在摇瓶和生物反应器中培养在300mL三角摇瓶悬浮培养，装液量为50mL，接种密度约为3～4g(干重)/L，培养基为MS添加适当的植物生长激素及40g/L蔗糖，摇床转速150r/min，培养温度为20～25℃，6d～7d换液30mL，每隔10d～12d传代一次或者直接收获细胞；在7.5L Biostat CT在位灭菌搅拌式生物反应器(德国B.Braun公司)中培养，接种密度为2.5g(干重)/L，培养温度为25℃，pH控制在4.8～5.6，溶解氧(DO)控制在30％～60％，采用直接曝气的气体分布器供氧，搅拌转速为60r/min～90r/min，培养基为MS培养基，添加0.2mg/L-0.4mg/L BA(苄基腺嘌呤)、1mg/L-4mg/L NAA(奈乙酸)及40g/L-50g/L蔗糖，装液量为6L，培养至第7天换液4L，至12d～14d下罐收获细胞。
专利摘要
本发明建立了稳定高产次级代谢产物黄酮的雪莲细胞系的方法及其培养技术以取代野生雪莲的采挖。利用60Co－γ射线照射、温度诱变和紫外光线照射等手段诱变雪莲愈伤组织，以提高雪莲细胞中黄酮的含量。用上述三种诱变方法处理原始雪莲细胞系，获得了一株稳定高产雪莲细胞系TUIP－8，黄酮含量大于12％，比天然植株高20～30倍。由于与细胞生长和黄酮合成的基因的稳定性，TUIP－8连续传代50代，细胞的培养密度和黄酮含量一直维持在20g(干重)/L和12％左右。该细胞系适应能力强，可以在18℃～30℃环境中生长，最适培养温度范围为20℃～25℃。
文档编号A01H4/00GKCN1424395SQ02156868
公开日2003年6月18日 申请日期2002年12月19日
发明者胡显文, 高丽华, 赵德修, 陆军, 李佐虎, 黄留玉, 郑涛, 陈惠鹏, 胥照平, 李世崇 申请人:中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所