专利名称:一种生产克隆羊驼的方法
本发明涉及一种生产克隆羊驼的方法，更具体的说，涉及一种用科间核转移生产克隆羊驼的方法。
羊驼，偶蹄目，骆驼科，草食动物，羊驼能生产世界上最细、最精美的天然纤维，且毛绒长、柔软、结实、耐用、保温、无油脂、绝缘，共有22种天然颜色；用羊驼毛纺织品制作的服装肤感柔滑，无“刺痒”感，弹性极好，垂感佳，能保持形状，可与丝绸、开士米及细羊毛混纺媲美。
近几年，国际动物毛纤维市场的变化，刺激和驱动了世界各国对羊驼的研究和发展，包括一些发达国家，均加大了投入，努力在这一新兴的畜牧业市场中多占一些份额，澳大利亚和秘鲁是世界上羊驼饲养业最为先进的国家，已对羊驼毛密度、毛色遗传规律、饲养技术进行深入透彻的研究，并应用遗传原理，研究出产毛量高、适应市场需求毛色的育种技术，现已培育出年产毛量10kg的羊驼。
由于羊驼繁育速度慢，每年一胎，一胎1～2仔，按照常规的羊驼繁育发展速度难以满足市场对羊驼绒的需求，利用胚胎移植的方法虽然能加快羊驼繁育速度，但由于羊驼数量少，价格昂贵，难以找到受体，且成本高；异种间胚胎移植，移植物都要遭受排斥，如何利用高新技术特别通过科间核转移技术超常规繁育羊驼已是摆在广大科技工作者特别是畜牧业工作者面前一项重要而迫切的任务。
哺育动物细胞核移植，不仅在生命科学中是一种很重要的工具，而且对具有优良品质的经济动物的扩繁也是一种可行的方法。
在哺育动物中，已应用早期的胚胎分裂球或胚胎来源的培养细胞(胚胎干细胞，以下简称为ES细胞)来提供细胞核，获得了相应的克隆动物绵羊(使用8--16细胞)[Willadsen S.W.，et al，Nature，1986]；兔(使用8细胞)[Stice S.L.，et al，Biol.Reprod.，1989]；猪(使用2--8细胞)[Prather R.S.，et al.Biol.Reprod.，1989]；牛(使用2--32细胞)[Prather R.S.，et al.J.Anim.Sci.，1987]；山羊(使用8细胞)[张涌，“国外畜牧-草食家畜分册”，1993]；小鼠(ES细胞)[Tsunda Y.，et al.Journal of Repoduction and Fertility.，1993]。
然而，经过持续的研究工作，首例克隆绵羊是通过导入体细胞核生产的(Willmut I..，et at.，Nature.1997]；从而纠正了先前的发育理论，随后，获得了不同类型的体细胞克隆动物如胎儿成纤维细胞核移植绵羊[Schnieke A.E.，et al.，Science，1997]、胎儿成纤维细胞核移植牛[Gibelli J.B.，et al.IBID，1998]、输卵管上皮细胞核移植牛、同种间核移植羊[成国祥等，中国专利公开号CN1294902A]等等。
然而，以上所述克隆技术都是针对已经进行许多研究工作的家畜、实验动物及灵长类动物，所涉及的步骤烦琐，还没有关于克隆羊驼的报道，因此本领域有必要探讨和开发一种实用的方法，通过科间核移植生产克隆高品质经济动物--羊驼。
本发明的目的就是提供一种成本低、繁殖速度快、效率高、并能够阻断动物疫病传染途径的羊驼扩繁方法。
本发明的目的就是提供一种缩短羊驼妊娠期的方法。
本发明的目的就是提供一种通过科间核转移生产克隆羊驼的方法。
本发明生产克隆羊驼的方法是这样实现的制备源于羊驼身上供核细胞；制备去核的代孕动物的供质卵母细胞；将供核细胞直接注射到去核的卵母细胞中，形成重构卵；激活重构卵并将激活的重构卵移植到代孕动物的输卵管内，或，在体外或体内对激活的重构卵进行培养，形成重构胚，将重构胚移植到代孕动物的子宫内，饲养代孕动物以生产克隆羊驼。
本发明的生产克隆羊驼的方法进一步说明如下1、制备源于羊驼身上供核细胞用从羊驼身上采集的ES细胞、体细胞系制备供核细胞，要求羊驼无传染或其他疾病、毛绒产量高、体格健壮，ES细胞源于羊驼早期的胚胎分裂球和胚胎来源的培养细胞；体细胞包括上皮细胞、神经细胞、表皮细胞、角质细胞、造血细胞、黑素细胞、软骨细胞、淋巴细胞、红细胞、巨噬细胞、单核细胞、成纤维细胞、心肌细胞、其他肌细胞等，以上细胞可得自羊驼的不同器官皮肤、肺、胰腺、肝器、胃、肠、心脏、肌肉、丘组织、生殖器官、膀胱、肾脏、尿道、和其他泌尿器官等，供核细胞还可得自羊驼身体的其他器官或细胞，它包括所有的体细胞、生殖细胞、ES细胞，优选的活跃的非休眠细胞，以增强克隆效率。如通过在子宫冲洗液中加入含1％青霉素-链霉素磷酸盐缓冲的盐水(PBS)，然后离心采集细胞，从子宫冲洗液中采集的细胞在补充了10％的胎牛血清(FBS)和1％青霉素-链霉素的Dulbecco改进的Eagle氏培养液(DMEM)中，在37±2℃、5％CO2的环境下培养。
从子宫内膜或输卵管采集的上皮细胞用PBS清洗、胰蛋白酶消化成单个细胞，然后在以上相似环境下培养。
对于丘细胞，用透明质酸酶溶液处理丘细胞-卵母细胞复合体以分离卵母细胞周围的丘细胞，在37±2℃、5％CO2的环境下用胰蛋白酶消化成单个细胞，然后在以上相似的环境下培养。
对于耳朵成纤维细胞，在无菌环境下清洗和粉碎，然后在37±2℃、5％CO2的环境下用胰蛋白酶消化成单个细胞，以上相似环境下培养。
供核细胞经传代培养，血清饥饿培养，遗传分析，冷冻保存或作供核用。
2、制备受体卵母细胞在体外将从代孕动物输卵管和卵巢采集的不成熟的I期卵母细胞在培养液中培养成为成熟的II期卵母细胞，还可通过外科手术，从开始发情或注射人绒毛膜促性腺激素24--48小时的未超排诱导或超排诱导供质的代孕动物输卵管内冲出II期卵母细胞，代孕动物为羊和牛。
从来源于屠宰场的输卵管采集的不成熟的I期卵母细胞在补充了FBS的TCM199培养液中在37±2℃、5％CO2的环境下培养16--24小时使其成为成熟的II期卵母细胞。
在注射人绒毛膜促性腺激素24--48小时的超排诱导的供质母畜的腹部切一口，将母畜的输卵管和卵巢暴露于体外，用冲卵液(F10培养液+5％BSA)从输卵管内冲出II期卵母细胞。
3、卵母细胞去核将成熟的卵母细胞(在卵母细胞成熟开始16--24小时)移入手术液中，在显微镜下，用持卵针固定卵母细胞，卵母细胞排出的极体处于钟表3点位置，去核针正对着或稍偏离极体去除极体和10％--15％胞质，以得到去核卵母细胞。
4、注射供核细胞形成重构卵供核细胞注射前先进行处理培养的供核细胞经0.25％的胰蛋白酶消化后，再用蛋白酶E(1--10mg/L)，37±2℃、5％CO2的环境下培养1--10分钟，洗涤后，移入手术液中，并直接将其注入去核卵母细胞中，形成重构卵；重构卵还可通过将含细胞质的供核细胞移入去核卵母细胞卵周隙中，在融合液中电刺激发生融合的方法获得，也可通过先将供核细胞的细胞质去除，然后将不含或含少量细胞质的细胞核直接注射入去核的卵母细胞的胞质内的方法获得。
5、激活重构卵对重构卵通过电刺激法或化学法加以激活，形成激活的重构卵，将重构卵在激活液(0.3M甘露醇，5mg/ml胎牛血清，0.1±0.02mMMgSO4)中进行间隔1秒每次持续40微秒的电压为600-2000V/cm电刺激三次后，再用化学方法激活(10μM离子酶素5分钟+2μM 6-DMAP2-6小时)，激活后重构卵移入的CZB溶液中培养。
6、重构卵的培养或直接移植重构卵采用两种方法培养。
a、体内培养应用手术的方法，将激活的重构卵吸入移卵管，将移卵管从输卵管喇叭口处插入，将重构卵移入输卵管内，随后在输卵管与子宫连结部用手术线结扎，在体内培养6天后，剪下输卵管，用培养液冲出胚胎(即重构胚)。
b、体外培养利用饲养细胞(feeder cell)(例如输卵管上皮细胞)进行体外培养，形成胚胎(即重构胚)。
以上两种方法培养的重构胚可冷冻保存并在移植前解冻，也可直接进行移植。
也可将被激活的重构卵直接移入代孕动物的输卵管内，让其妊娠产仔。
7、胚胎移植将发育的重构胚移入与胚胎发育同步的代孕动物子宫内，一个月后B超检查是否妊娠，细心饲养，待其产仔。
由于牛和羊的胚胎卵裂速度和发育速度比羊驼快得多(牛的妊娠期平均为9个月，羊的妊娠期平均为5个月，羊驼的妊娠期平均为11.5月)，因此用由牛或羊的去核卵母细胞发育而成的胎盘取代羊驼的胎盘，必将缩短克隆羊驼的妊娠期。
在本发明中所提到的CZB培养液、TCM199培养液、F10培养液等都是本领域常规的培养液，其中CZB培养液配方如表一，TCM199培养液配方如表二，6-DMAP为6-二甲基氨基嘌呤。
本发明的优点采用上述方法的组装配套使用，加快了羊驼扩繁的速度、缩短了羊驼的妊娠期、成本更低、效率更高，并能够彻底阻断羊驼疫病传染途径，达到了通过科间核转移技术超常规快速繁育羊驼的目的。
表一
表二 TCM199培养液
附图及简要说明
图1为本发明生产克隆羊驼的流程图。
图2为本发明实施例1的流程图。
图3为本发明实施例2的流程图。
图4为本发明实施例3的流程图。
实施例1见图2用来自羊驼苏丽(Suri)的耳朵内侧细胞、用胶东山羊为代孕动物来克隆苏丽(Suri)，包括以下步骤1、供核细胞的制备及培养用手术方法，无菌条件下取约1cm2的苏丽(Suri)的耳朵内侧皮肤，用PBS洗涤，然后粉碎至100目，在37±2℃、5％CO2的环境下，0.125胰蛋白酶消化0.5-3小时，灭菌纱布过滤后以1000转/分钟转速离心3分钟，沉淀用TCM199培养液(含10％FBS)悬浮，于四孔板培养，待细胞长满后，传代培养，用于供核。
2、获得卵母细胞从来源于屠宰场的胶东山羊输卵管中采集的不成熟的I期卵母细胞在补充了FBS的TCM199培养液中在37±2℃、5％CO2的环境下培养16--24小时使其成为成熟的II期卵母细胞。
3、卵母细胞去核与供核细胞的核转移将卵母细胞移入含有7.5μg/ml的细胞松弛素B的CZB培养液中20分钟，再移入含有20mM HEPES的CZB培养液中，同时将消化成球状的上皮细胞也移入该液中，卵母细胞除核后，将上皮细胞直接注入卵母细胞的胞质中，形成重构卵；重构卵置入CZB培养液中培养30分钟，然后进行激活处理。
4、激活与包埋将重构卵置于含细胞松弛素B(7.5μg/ml)+离子霉素(10μM)中的CZB培养液中，37±2℃培养5分钟，然后移入含细胞松弛素B(7.5μg/ml)+6-DMAP(2μM)的CZB中，于37±2℃，液滴法培养2-6小时，然后进行间隔1秒每次持续40微秒的电压为600-2000V/cm三次电刺激后，再用化学方法激活(10μM离子酶素5分钟+2μM 6-DMAP 2-6小时)，激活后的重构卵移入CZB溶液中培养，然后进行包埋。
包埋采用双层包埋，所用的包埋液是0.8％与1.0％琼脂糖(低熔点)溶液，该包埋液制备方法如下在10ml锥形玻璃离心管内将适量的琼脂糖和生理盐水混合煮沸，至完全溶解后置于41℃的水浴中待用。
包埋时，在一塑料平皿中加入含Ca2+、Mg2+的PBS液，在PBS液底部用吸管加入胎牛血清，将待包埋的卵母细胞移入血清层，使其自然下沉，待位于底壁吸出，然后移入另一个刚加入0.8％琼脂糖的小平皿中，用琼脂糖洗涤2-4次，再均匀吸卵，移至PBS中，让其自然凝固，再分割，换一口径大的吸管，按相同的方法进行第二次包埋，不同点在于包埋液琼脂糖浓度为1.0％。
5、重构卵的移植用手术法将包埋后的重构卵移入代孕胶东山羊输卵管，1个月B超检查是否妊娠，细心饲养，待其生产克隆羊驼。
实施例2见图3用来自羊驼苏丽(Suri)的乳腺上皮细胞、用山东黄牛为代孕动物来克隆苏丽(Suri)，包括以下步骤1、乳腺上皮细胞的制备及培养无菌条件下取约1cm2的苏丽(Suri)的乳腺组织，用PBS洗涤，然后粉碎至100目，在37±2℃、5％CO2的环境下，0.125胰蛋白酶消化0.5-3小时，灭菌纱布过滤后以1000转/分钟转速离心3分钟，沉淀用TCM199培养液(含10％FBS)悬浮，于四孔板培养，待细胞长满后，传代培养，用于供核。
2、获得卵母细胞从来源于屠宰场的山东黄牛输卵管中采集的不成熟的I期卵母细胞在补充了FBS的TCM199培养液中在37±2℃、5％CO2的环境下培养16--24小时使其成为成熟的II期卵母细胞。
3、卵母细胞去核与供核细胞的核转移该步骤与实施例1的步骤3相同。
4、激活与包埋该步骤与实施例1的步骤4相同。
5、重构卵的移植用手术法将包埋后的重构卵移入山东黄牛输卵管内，1个月B超检查是否妊娠，细心饲养，待其生产克隆羊驼。
实施例3见图4用来自原驼(Guanaco)的丘细胞、用绵羊为代孕动物来克隆原驼(Guanaco)，包括以下步骤1、丘细胞的制备及培养通过在子宫冲洗液中加入含1％青霉素-链霉素磷酸盐缓冲的盐水(PBS)，然后1500转/分钟转速离心3分钟采集细胞，用透明质酸酶溶液处理丘细胞-卵母细胞复合体以得到卵母细胞周围的丘细胞，在37±2℃、5％CO2的环境下用胰蛋白酶消化成单个细胞，用TCM199培养液(含10％FBS)悬浮，于四孔板培养，待细胞长满后，传代培养，用于供核。
2、获得卵母细胞在注射人绒毛膜促性腺激素24--48小时的超排诱导的绵羊的腹部切一口，将其的输卵管和卵巢暴露于体外，用冲卵液(F10培养液+5％BSA)从输卵管内冲出II期卵母细胞。
3、卵母细胞去核与供核细胞的核转移该步骤与实施例1的步骤3相同。
4、激活与包埋该步骤与实施例1的步骤4相同。
5、重构卵的体内培养和回收应用手术的方法，将激活的重构卵吸入移卵管，将移卵管从输卵管喇叭口处插入，将重构卵移入输卵管内，随后在输卵管与子宫连结部用手术线结扎，在体内培养6天后，剪下输卵管，用培养液冲出胚胎(即重构胚)。
6、重构胎的移植将重构胚移入与胚胎发育同步的绵羊子宫内，1个月B超检查是否妊娠，细心饲养，待其生产克隆羊驼。
权利要求
1.一种生产克隆羊驼的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤(1)用从羊驼身上采集的胚胎干细胞(ES细胞)、体细胞系制备供核细胞；(2)制备去核的代孕动物供质卵母细胞；(3)将供核细胞直接注射到去核的卵母细胞中，形成重构卵；(4)对重构卵进行激活处理；(5)将激活的重构卵移植到代孕动物的输卵管内，或，在体外或体内对激活的重构卵进行培养，形成重构胚，将重构胚移植到代孕动物的子宫内；(6)饲养代孕动物以生产克隆羊驼。
2.根据权利要求
1所述的生产克隆羊驼的方法，其特征在于，所述的羊驼包括大羊驼(Llama)、原驼(Guanaco)、羊驼(Alpaca)、小羊驼(Vicuna)。
3.根据权利要求
1所述的生产克隆羊驼的方法，其特征在于，所述的代孕动物为牛和羊。
4.根据权利要求
1所述的生产克隆羊驼的方法，其特征在于，所述的从羊驼身上采集的体细胞包括乳腺细胞、生殖细胞、卵丘细胞、上皮细胞、内皮细胞，神经细胞、表皮细胞、角质细胞、造血细胞、黑素细胞、软骨细胞、淋巴细胞、红细胞、巨噬细胞、单核细胞、成纤维细胞、心肌细胞、其他肌细胞。
5.根据权利要求
1所述的生产克隆羊驼的方法，其特征在于，所述的卵母细胞是这样获得的从源于代孕动物输卵管和卵巢中采集的不成熟的I期卵母细胞在补充了FBS的TCM199培养液中，37±2℃、5％CO2的环境下培养16--24小时，使其成为成熟的II期卵母细胞。
6.根据权利要求
1所述的生产克隆羊驼的方法，其特征在于，所述的卵母细胞还可以这样获得的从开始发情或超排诱导24--48小时的的代孕动物的输卵管内冲出II期卵母细胞。
7.根据权利要求
1所述的生产克隆羊驼的方法，其特征在于，所述的去核卵母细胞是这样获得的用透明质酸酶溶液处理丘细胞--卵母细胞复合体，以得到分离了周围丘细胞的卵母细胞，去除卵母细胞极体和10％--15％胞质，得到去核卵母细胞。
8.根据权利要求
1所述的生产克隆羊驼的方法，其特征在于，所述的供核细胞注射前经过以下处理将经传代培养、血清饥饿培养的供核细胞经0.25％的胰蛋白酶消化后，再用蛋白酶E(1--10mg/L)，37±2℃、5％CO2的环境下培养1--10分钟。
9.根据权利要求
1所述的生产克隆羊驼的方法，其特征在于，所述的重构卵是这样实现的将供核细胞直接注入去核卵母细胞中，形成重构卵。
10.根据权利要求
1所述的生产克隆羊驼的方法，其特征在于，对重构卵按如下方法进行激活处理将重构卵在激活液(0.3M甘露醇，5mg/ml胎牛血清，0.1±0.02mM MgSO4)中进行间隔1秒每次持续40微秒的电压为600-2000V/cm电刺激三次后，在10μM离子酶素激活5分钟并在2μM 6-DMAP激活2-6小时。
专利摘要
本发明涉及一种用科间核转移生产克隆羊驼的方法，包括以下步骤用从羊驼身上采集的胚胎干细胞(ES细胞)、体细胞系制备供核细胞；制备去核的代孕动物供质卵母细胞；将供核细胞直接注射到去核的卵母细胞中，形成重构卵；对重构卵进行激活处理；将激活的重构卵移植到代孕动物的输卵管内，或在体外或体内对激活的重构卵进行培养，形成重构胚，将重构胚移植到代孕动物的子宫内；饲养代孕动物以生产克隆羊驼。采用该方法可加快羊驼扩繁的速度、缩短羊驼的妊娠期、成本更低、效率更高，并能够彻底阻断羊驼疫病传染途径，该方法可大批量生产医学、畜牧业及珍稀动物的药品和器官。
文档编号A01K67/02GKCN1471814SQ02135287
公开日2004年2月4日 申请日期2002年7月29日
发明者刘晓明 申请人:刘晓明导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan