专利名称:生产雄性不育植物的方法
本申请要求从于1999年9月30日提交的日本专利申请Hei 11-279307的优先权，该申请的公开内容作为参考文献引入本文。
发明领域本发明涉及一种通过基因操作生产雄性不育植物的方法。
现有技术芽胞杆菌RNA酶是一种从解淀粉芽孢杆菌中得到的RNA酶(参见S.Nishimura和M.Nomura，生化及生物物理学学报.30430-431(1958)；R.W.Hartley，分子生物学杂志.202913-915(1988))。这种酶有110个氨基酸残基，可催化RNA的水解。在细胞中表达后，由于其有效的RNA酶活性，该酶可抑制细胞的功能，并因此在多数情况下导致细胞死亡。通过利用这一特征，可以设想将芽孢杆菌RNA酶基因在植物的某一特定位点表达，将有可能选择性调节该位点的功能。
PCT WO89/10396公开了一种可以获得雄性不育植物的技术，该技术是通过将上述芽孢杆菌RNA酶基因连接到一种花药绒毡层细胞特异性表达启动子的下游，从而构建成雄性不育基因，然后将以这种手段获得的基因转入植物。这种雄性不育技术对于有效地开发F1代杂种是非常有用的。
但是，当利用芽孢杆菌RNA酶基因作为雄性不育基因后，发现据此获得的雄性不育转基因植物常常表现出一些不令人满意的性状。PCTWO96/26283提到这一问题在水稻中的存在。还有报道在莴苣中观察到类似的现象(科学园艺.55125-139(1993)；Arlette Reymaerts，Hilde Van de Wiele，Greta De Ssutter，Jan Janssens工程化基因对育性的控制及其在杂交种生产中的应用)。根据这一报道，将一种雄性不育基因，该基因包括一个来源于烟草的花药特异性启动子(TA29)，和一个芽孢杆菌RNA酶基因，转入莴苣后，产生了生活力下降的植物。
虽然迄今为止，造成这种现象的原因还不能确定，但已有推测认为基因转移位点的所谓“位置效应”可能影响到这种作用机制(参见PCTWO96/26283)。更具体地，当雄性不育基因仅限制在靶位点(即花药)处表达时，可以得到所需雄性不育植物。但有这样一种可能性，即在存在于基因转移位点邻近处的表达调节子(例如内源增强子)的作用下，芽孢杆菌RNA酶基因就可能在除花药外的组织中表达，即使是以极微量的形式。这种情况下，由于有效的酶活性作用，就可能产生上面描述的不令人满意的性状。
为了克服这一问题，PCT WO96/26283公布了一种方法，该方法使用了可在除花药外的组织中有效表达的花椰菜花叶病毒35S启动子(后文称CaMV35S启动子)。换言之，其中使用了芽孢杆菌RNA酶抑制剂，即一种针对芽孢杆菌RNA酶的抑制性蛋白。将连接至CaMV35S启动子的芽孢杆菌RNA酶抑制剂基因同时转入植物，然后该芽孢杆菌RNA酶抑制剂基因在除花药外的组织中组成型表达，从而消除这些组织中芽孢杆菌RNA酶的作用。
但是，以这种方法产生的雄性不育植物中，芽孢杆菌RNA酶抑制剂基因是在植物全身表达的，包括叶片和胚乳等可食用部分。从公众接受转基因作物的角度来看，这种结果是不理想的，因为芽孢杆菌RNA酶抑制剂蛋白表达在了不需要其表达的地方。
发明概述本发明提供了一种可生产雄性不育植物的方法，该法获得的植物除了是雄性不育以外，具有与未经改造的原种相当的正常形态学特征。
本发明提供了一种生产雄性不育植物的方法，该方法通过在植物花药中表达一种外源的RNA酶，其中该酶在除花药外的组织的表达被尽可能多地抑制，从而得到了与出发(即未经改造的)植物相比，表现同样正常形态学的雄性不育植物。
附图简述
图1是表示质粒pTS346结构的模型视图，该质粒是用来转化植物细胞的，其上包括从5’端向3’端方向依次排列的，一个受花药特异性E1启动子控制的芽孢杆菌RNA酶抑制剂基因，以及一个由花药特异性启动子E1片段控制的芽孢杆菌RNA酶基因。
发明详述本发明者们获得了两个表现出改良的雄性不育株系，因为在所有通过转入一种遗传构建体而获得的水稻雄性不育株系中，这两个株系分别只表现出较小程度的形态学异常，其中所述遗传构建体的制备，是通过将一个芽孢杆菌RNA酶基因与一个来自水稻的花药特异性E1启动子连接而成的。通过对这些株系的分析发现，E1启动子被一个大约10kb大小的转座子分成了两部分，该转座子来自于在水稻转化过程中使用的根癌农杆菌LBA4404。根据这一情况推测，由于插入了这一10kb或更大的转座子，E1启动子前部对芽孢杆菌RNA酶基因表达的作用将被减弱，因此，芽孢杆菌RNA酶基因的表达也将降低，从而使转基因雄性不育植物的形态异常状况得到缓解。
这一发现表明，在常规技术中面临的RNA酶在花药外组织中表达的问题是可能解决的，其方法是先将RNA酶基因(例如芽孢杆菌RNA酶基因)连接在比全长缩短了的花药特异性启动子(即启动子片段)下游，然后将这一构建体转入植物基因组中。从这一角度出发，本发明者们进行了更加深入细致的研究，先将一个芽孢杆菌RNA酶抑制剂基因连接在水稻花药特异性E1启动子的下游，将一个RNA酶基因连接在一个从花药特异性启动子得来的片段的下游，然后用它们同时转化植物；由此获得一种转基因水稻植物，其在雄性不育水稻株系的形态学上达到进一步的改良。
因此，本发明提供了一种可生产雄性不育植物的方法，其特征包括将第一个启动子片段连接在一个RNA酶基因的上游，还包括将第二个启动子连接在一个RNA酶抑制剂蛋白基因的上游，该第二启动子与第一启动子相同或不同；然后将这些基因转入植物基因组中，从而生产出基本上雄性不育的植物。
本发明中，RNA酶基因优选使用芽胞杆菌RNA酶基因。芽胞杆菌RNA酶基因可以直接用于本发明中。另一方面，也可以将芽胞杆菌RNA酶基因进行自然或人为突变，以便由此改造该基因所编码酶的活性或其组织特异性。就本发明而言，可以使用任何一种酶基因，只要该酶在植物细胞(尤其是花药)中能够发挥RNA酶作用，并因此抑制这些细胞中蛋白质的生物合成。这些酶的例子包括胰RNA酶A，米曲霉RNA酶T1，生金色链霉菌(Streptomyces aureofaciens)的链霉菌RNA酶(Sarnase)(参见欧洲专利公开号053799)。
用来连接在RNA酶基因上游的启动子(即第一启动子)可以是任何一种启动子，只要它能够诱导将在植物细胞中使用的RNA酶基因的表达。如烟草TA29启动子(参见J.Seurinck等，核酸研究.183403(1990))和拟南芥A9启动子(参见Wyatt Paul等，植物分子生物学杂志.19611-622(1992))等。优选地，当要生产某一植物的雄性不育植物时，第一启动子应是一种针对该植物花药的特异性启动子。就水稻而言，有一些已知的花药特异性启动子，如E1启动子、T72启动子、T42启动子(如PCT WO92/13956所述)，Osg6B启动子、Osg4B启动子(均由T.Tsuchiya等报道，见植物分子生物学.261737-1746(1994))等等。E1启动子的序列由SEQ ID NO6所示。
仅把第一启动子用作一个片段是十分重要的。本文中与第一启动子连用的术语“片段”指与自然存在的启动子序列至少有部分不同的一段序列。例如，这种片段可以是一个在3’区、内部区域和/或5’区发生了缺失、替换或插入的启动子，其中包括被间插序列分为上游和下游两个区的情况。优选经过缺失、替换或插入后，这一片段与自然状态的启动子序列仍有最高约50％的同源性；更优选同源性达到约70％；特别优选同源性高达90％。所述第一启动子片段优选SEQ IN NO7所示的E1启动子的片段。还优选在上述序列基础上通过替换、缺失或插入一个或多个核苷酸等改造后获得的一段序列，只要获得的这种序列具有与SEQ ID NO7所示片段同样的启动子活性。“通过替换、缺失或插入核苷酸来改造”是指可以通过选取不超过10个核苷酸(优选为不超过5个)进行诸如定点诱变等人工操作手段来完成的改造。
第一启动子片段以一种有功能的方式连接在RNA酶基因的上游，这里的术语“有功能的”，意指将该启动子片段连接在一个允许其诱导RNA酶基因表达的位置。
本发明必需使用RNA酶抑制剂蛋白基因。这种基因可以根据所使用的RNA酶基因进行恰当的选择。例如，当RNA酶基因用的是芽胞杆菌RNA酶基因时，优选使用芽胞杆菌RNA酶抑制剂基因作为RNA酶抑制剂蛋白基因。第二启动子以有功能的方式连接在RNA酶抑制剂蛋白基因的上游。第二启动子的作用是，诱导植物细胞中所用的RNA酶抑制剂蛋白基因的表达，该启动子既可以与第一启动子相同，也可以与之不同。当第二启动子与第一启动子相同时，也并不是总有必要以一个片段的形式使用第二启动子。
RNA酶基因和RNA酶抑制剂蛋白基因分别以有功能的方式与第一启动子片段和第二启动子相连接，其中RNA酶基因既可以定位于RNA酶抑制剂蛋白基因的下游，也可以定位于其上游。另外，对这些基因的间隔距离也没有特别的限定。
至于哪些植物可按照本发明中的方法生产雄性不育植物，也没有特别的限制。实例有水稻、玉米、烟草、莴苣和油菜。其中特别优选水稻和玉米。
为了按本发明的方法将基因转入植物基因组中以生产雄性不育植物，可使用农杆菌方法、电穿孔法和粒子枪法等。农杆菌法是优选的。该方法的细节可由本领域技术人员参照如在PCT WO92/13957中描述的方法适当确定。举例来说，可以通过下面的步骤将基因转入植物细胞基因组(1)准备好第一启动子片段；(2)准备好RNA酶基因；(3)将RNA酶基因以有功能的方式连接在第一启动子片段的下游；(4)准备好第二启动子；(5)准备好RNA酶抑制剂蛋白基因；(6)将RNA酶抑制剂蛋白基因以有功能的方式连接在第二启动子的下游；(7)利用限制性内切酶识别位点，将已连接在第一启动子片段下游的RNA酶基因和已连接在第二启动子下游的RNA酶抑制剂蛋白基因，整合至T-DNA中；(8)将步骤(7)得到的T-DNA插入Ti质粒；(9)如果有必要，将步骤(8)得来的Ti质粒在农杆菌宿主细胞中进行扩增；(10)利用步骤(9)得到的农杆菌感染植物细胞，以便将已连在第一启动子片段下游的RNA酶基因和已连接在第二启动子下游的RNA酶抑制剂蛋白基因，转入植物细胞的基因组中。
如此获得的转基因植物细胞，可由愈伤组织培养开始，再生成为完整的植物个体，具体方法参见如Y.Hiei等，植物学杂志6271-282(1994)。
在上述过程中，第一启动子片段可以通过用合适的限制性内切酶切割第一启动子而得到。或者，该片段也可以通过扩增特定序列来制备，具体方法是先用合适的引物，对一个包括该第一启动子和RNA酶基因的质粒进行PCR，去掉不必要的区域，从而获得所需序列的扩增，见后文实施例。还应当理解的是，任何关于上述步骤(尤其是步骤(1)～(7))次序的改变或其中使用材料的变化，均属于本发明的范围之内。另外，也有可能利用含有不同T-DNA的Ti质粒来转化植物细胞，其中一个T-DNA携带有已连在第一启动子片段下游的RNA酶基因，而另一个T-DNA携带有已连接在第二启动子下游的RNA酶抑制剂蛋白基因。再有，如果在步骤(7)的T-DNA中先提供一个选择性标记，就可以轻松地把带有转化基因的愈伤组织筛选出来。这类标记的实例包括将在后面实施例中使用的Bar基因，以及一种抗潮霉素(HPT)基因。不过，并不是总有必要使用选择性标记。转化的成功可以根据如下事实来判定，即从转基因细胞的愈伤组织再生得到的植物已表现为雄性不育。
本发明还提供了一种载体，该载体可以通过前面描述的农杆菌方法，将上述基因转入植物细胞基因组中。该载体含有一个T-DNA，使得载体存在于被农杆菌侵染的植物细胞中时，可将T-DNA转入植物细胞基因组；其T-DNA上包括有i)一个启动子片段和一个在该启动子控制下表达的RNA酶基因；ii)一个与上述启动子相同或不同的启动子，以及在该第二启动子控制下表达的一个RNA酶抑制剂蛋白基因。优选将包括上述遗传元件i)和ii)的T-DNA整合到供植物转化的Ti质粒中，从而构建成本发明中的载体。目前已有多种可用于植物转化的Ti质粒；例如，根癌农杆菌LBA4404中携带的pAL4404。如果必要，本发明载体上可包括一个或多个从以下序列中挑选出的元件，这些可供选择的元件包括在农杆菌中扩增所需的复制起始，分别定位于RNA酶基因和RNA酶抑制剂蛋白基因下游的终止子，和/或适合于筛选转基因植物细胞的标记基因。
本发明还提供了转基因植物细胞，其包括i)一个启动子片段和一个在该启动子控制下表达的RNA酶基因，ii)一个与上述启动子相同或不同的启动子，以及在该启动子控制下表达的一个RNA酶抑制剂蛋白基因，且i)和ii)均已转入基因组中，本发明还提供了一种由该转基因细胞再生得来的雄性不育植物。
本发明的效应本发明可生产一种雄性不育植物，与传统方法生产的雄性不育植物相比，该植物在形态学或开花特征上没有表现或仅表现出较低程度的异常；其具体产生方法是，通过将一个芽胞杆菌RNA酶基因连接在由于缺失上游区域而降低活性的启动子下游，另将一个芽孢杆菌RNA酶抑制剂基因连接在水稻花药特异性启动子的下游，然后使这些基因一起转化入植物细胞基因组中。
现在，参考下面的实施例详述本发明。但不应理解为本发明仅限于此。
实施例用质粒pTS172(参见日本专利申请Hei 10-220060)作为模版，用来扩增已经连接在E1启动子片段下游的芽胞杆菌RNA酶基因。PCR使用的引物是172del-F(参见SEQID NO1)和172del-R(参见SEQ ID NO2)，每条引物中均含有一个PstI酶切识别位点，经PCR扩增后，将所获得的产物用PstI进行酶切。由此，得到了一段来自于pTS172的E1启动子片段。该片段两端均为粘性末端，其中仅包括一段约360bp的序列，其上含有E1启动子的起点及其上游序列。按常规方法，用T4DNA连接酶将这一片段的两个末端连接在一起，使之重新环化，得到一个新的质粒pTS172A(参见SEQ ID NO3)。也就是说，在质粒pTS172A中，原质粒pTS172中的约1.7kb的E1启动子区域已被SEQ ID NO7所示的356bp的片段所替换。
接下来，一个包括E1启动子(参见PCT WO92/13956)及与其相连的一个芽孢杆菌RNA酶抑制剂基因(参见R.W.Hartley，分子生物学杂志.202913-915(1988))在内的片段(参见SEQ ID NO4)，经末端补平后整合入pTS172Δ质粒中的PstI位点，得到质粒pTS346(参见SEQ ID NO5)，图1表示了pTS346的结构。
用EcoRI从pTS346中切出一段5.5kb的片段，随后将该片段插入pSB11BS(其结构将在后文描述)的EcoRI位点。进而，通过同源重组的方法把T-DNA区域整合入受体载体pSBI(参见T.Komari等，植物学杂志.10165-174(1996))。将由此得到的重组质粒(pSB1346)转入根癌农杆菌LBA4404中，该菌被用于水稻(品种为Asanohikari)的转化。质粒pSB11BS的构建是通过把芽孢杆菌RNA酶抑制剂基因(参见R.W.Hartley，分子生物学杂志.202913-915(1988))整合入中间载体pSB11(参见T.Komari，植物学杂志.10165-174(1996))的StuI位点而完成的。
利用含有上述重组质粒的根癌农杆菌LBA4404，完成了对水稻(品种为Asanohikari)的转化。虽然转化方法基本上与Hiei等(植物学杂志.6271-282(1994))的方法相一致，但使用了膦丝菌素(浓度为10mg/L)来筛选转基因植物，因为该雄性不育基因构建体中包括一个作为选择标记的膦丝菌素乙酰转移酶基因。
与pSB1172(参见于1999年8月3日提交的PCT/JP99/04167)构建体进行了对比，该构建体包括一个正常长度的E1启动子，但没有芽孢杆菌RNA酶抑制剂基因，比较结果表明，本文的转化效率及所得转基因植物中形态正常植物的比率都有显著提高。结果见下表。
表1转化效率
*检测了45个株系中的38个。
权利要求
1.一种生产雄性不育植物的方法，其包括将第一启动子片段连接在RNA酶基因的上游，将一个与该第一启动子相同或不同的第二启动子连接在一个RNA酶抑制剂蛋白基因的上游，然后将这些基因转入植物基因组，并因此得到所述基本上雄性不育的植物。
2.权利要求
1的生产雄性不育植物的方法，其中所述RNA酶基因是芽孢杆菌RNA酶基因。
3.权利要求
1或2的生产雄性不育植物的方法，其中所述RNA酶抑制剂蛋白基因是芽孢杆菌RNA酶抑制剂基因。
4.权利要求
1～3中任一项的生产雄性不育植物的方法，其中所述第一启动子和第二启动子均为可引起花药特异性表达的启动子。
5.权利要求
1～4中任一项的生产雄性不育植物的方法，其中所述第一启动子是SEQ ID NO6所示启动子的一部分。
6.权利要求
1～5中任一项的生产雄性不育植物的方法，其中所述第一启动子是SEQ ID NO7所示的启动子。
7.一种启动子，其包括SEQ ID NO6所示序列的一部分。
8.一种启动子，其包括SEQ ID NO7所示的序列，或者是由该序列经替换、缺失或加入一个或多个核苷酸等手段改造而得到的一种序列。
9.一种包含有T-DNA的质粒载体，该T-DNA包括i)第一启动子片段及一种在该启动子诱导下表达的RNA酶基因，ii)与第一启动子相同或不同的第二启动子，以及在该启动子诱导下表达的RNA酶抑制剂蛋白基因，当该质粒载体处于农杆菌侵染的植物细胞中时，应能够将所述T-DNA导入植物细胞基因组。
10.一种转基因植物细胞，其中包括已转入其基因组中的i)第一启动子片段及一种在该第一启动子诱导下表达的RNA酶基因，ii)与第一启动子相同或不同的第二启动子，以及在该第二启动子诱导下表达的RNA酶抑制剂蛋白基因；以及一种从该细胞再生得来的雄性不育植物。
专利摘要
一种可生产雄性不育植物的方法,所得雄性不育植物与原植物相比,表现出相似的正常形态但为雄性不育。更明确地说,本发明涉及一种生产雄性不育植物的方法,其特征包括,将一个第一启动子片段连在一种RNA酶基因上游,将一种与该第一启动子相同或不同的第二启动子连在一种RNA酶抑制剂蛋白基因的上游,并将这些基因转入植物基因组从而得到所述基本上雄性不育的植物。
文档编号C12N5/10GKCN1336796SQ00802835
公开日2002年2月20日 申请日期2000年9月12日
发明者浜田和行, 中木户文夫 申请人:日本烟草产业株式会社导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan