专利名称:稳定高产黄酮的雪莲细胞系tuip-8的大规模高密度培养方法
技术领域：
本发明涉及稳定高产黄酮的雪莲细胞系TUIP-8的大规模高密度培养方法，更具体地说是利用生物工程技术，通过优化雪莲细胞培养的工艺如培养基组成、摇瓶培养的条件及生物反应器中培养的工艺条件，实现稳定高产次级代谢产物黄酮的雪莲细胞的大规模高密度培养，属于生物工程领域和中药现代化领域。
背景技术：
用植物细胞大规模培养方法生产有用的次生物质的技术，已成为继微生物发酵技术和动物细胞培养技术以后的当代生物技术的一个重要组成部分。许多药用植物中含有各种特殊的次级代谢产物如生物碱、甾体类、萜类、黄酮类等物质，具有许多重要的药用价值。但是，(1)许多次生代谢物质难于人工合成；(2)天然资源十分匮乏；(3)人工栽培品种品质下降，由于上述原因，限制了许多名贵中药的临床使用和中成药制造。因此，通过药用植物细胞大量培养来解决中药资源问题，无疑是中药现代化的一个重要研究领域，也是珍稀植物资源的生物技术中的重要内容。
植物细胞大规模培养技术的优点(1)不受地域、气候等自然因素的限制；(2)生长速度快，产品可控性好(对中药现代化有利)；(3)可以探索新的合成路线和获得新的有用物质；(4)有利于保护自然资源；(5)用现代高新生物技术(部分)解决中药资源问题，是中药现代化的一个最好的切入点之一。
国内已经研究过的植物细胞培养物已很多，如麻黄草、高山红景天、黄芪、西洋参、毛地黄、杜仲、三七等等，但是植物细胞大量培养技术明显比微生物和动物细胞培养技术发展缓慢，国内还没有采用植物细胞大量培养技术生产药物已实现产业化的项目，主要因为(1)高产稳定细胞系难获得，大多数培养的植物细胞，其中的次级代谢产物含量较天然低，并且在连续传代过程中细胞系品质会退化，合成目的次级代谢产物的能力会逐渐下降乃至消失；(2)植物细胞培养受剪切力、氧传递、细胞的去分化和凝聚作用影响较大，大规模培养技术难度较大；(3)高产值的产品相对较少。
雪莲花类药材是新兴中药，也是藏医蒙医和维吾尔医等的常用民族药。药理研究证明，雪莲具有抗风湿镇痛、强心、终止妊娠、清除自由基及抗疲劳、解痉、降压和平喘、抑制病毒复制、抑制染色体损伤、促进辐射损伤修复、促创面愈合抗炎等作用。雪莲黄酮类化合物中的jaceosidin和hispidulin具有较强的抑制肝癌细胞生长的作用。用雪莲做原料开发成中成药的有用于治疗风湿性关节炎和顽固性颈椎病等的雪莲注射液、用于治疗偏瘫和脑动脉硬化症的雪莲通脉丸、用于治疗II型糖尿病的雪莲降糖汤、用于烧伤创面治疗的复方雪莲烧伤膏等等。但是由于天然雪莲已经非常稀少，并且是国家明令禁止采挖的保护植物，人工引种也很困难，严重影响了以雪莲为主要原料的药物开发与生产。
我们在2002年申请了发明专利“用于大规模植物细胞培养的稳定高产黄酮的雪莲细胞系及其建立方法”(申请号02156868.5，公开号CN1424395A)，获得了一株紫色水母雪莲细胞系TUIP-8(在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏日为2002年12月16日，保藏号为CGMCC No.0855，建议的分类命名为水母雪莲紫色细胞系)。该雪莲细胞系具有下列优点(1)黄酮产量大，黄酮含量占细胞干重的12％左右；(2)培养密度高，悬浮培养密度可达22～25g(干重)/L；(3)生长速度快，培养周期短，一般只需7d～10d；(4)稳定性高，可无限传代，连续传代80代(持续2年时间)细胞的生长特性和合成黄酮的能力没有变化；(5)不存在植物细胞培养中较普遍存在的两相培养，即生长相和诱导相培养，细胞在整个培养周期不会受到损伤，因而易实现植物细胞连续培养和收获以提高反应器的生产能力；(6)生长温度范围较宽，在18～30℃范围内生长良好。该发明为通过培养雪莲细胞来替代雪莲植物的采挖提供了非常好的物质基础，而本发明则是完善该雪莲细胞系的培养工艺，并在生物反应器中实现雪莲细胞的大规模高密度培养。
发明内容
本发明的目的是提供稳定高产黄酮的雪莲细胞系TUIP-8的大规模高密度培养方法，包括摇瓶悬浮培养和生物反应器培养两种。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案稳定高产黄酮的雪莲细胞系TUIP-8的大规模高密度培养方法，该方法为摇瓶悬浮培养在300mL三角瓶中，加入90mL改进的MS培养基，即在MS培养基中添加0.2～0.4mg/L苄基腺嘌呤(BA)、1～4mg/L奈乙酸(NAA)及40～50g/L蔗糖，接种种龄为7d左右的细胞，细胞接种密度为4～8g(干重)/L，摇床转速为130～160r/min，光照强度为50～100μmol/(m2·s)的荧光灯照射，培养温度为18～28℃，pH值为～5.8，培养时间为7-10天，获得细胞聚集尺寸5～20mm的雪莲细胞。
本发明作出的创造性贡献在于优化了该细胞系的摇瓶悬浮培养工艺1)接种密度接种密度为4～8g(干重)/L为宜，即传代时一般为一传三到一传六，接种密度低于2g(干重)/L，细胞的生长受到抑制，黄酮的含量会下降。
2)摇床转速摇床转速在培养前期设定为135r/min，当细胞堆积体积大于1/2的培养体积时，将摇床转速提高至150～160r/min。这种培养方法，细胞聚集尺寸较大，黄酮含量高，细胞密度一般在23g(干重)/L。如果摇床转速低于120r/min，细胞密度很低，细胞会由于氧供应不足而死亡。但如果培养前期转速过高，细胞的聚集尺寸较小，影响黄酮合成。
3)光照强度光照强度一般为50～100μmol/(m2·s)的荧光灯照射，低于50μmol/(m2·s)时，黄酮含量大大下降。而高于100μmol/(m2·s)，细胞合成黄酮的能力不会增加。
4)培养温度最适培养温度为25℃，而在18～28℃之间，细胞仍可良好生长，但长期处于30℃以上高温环境，细胞会逐渐褐化死亡，而低于15℃，细胞生长缓慢，但活力良好，一旦置于20～25℃环境中，可以正常生长。
5)细胞聚集尺寸细胞聚集尺寸可以影响含量，细胞聚集尺寸小于1mm，黄酮含量小于8％，聚集尺寸在10～20mm时，黄酮含量一般均在12％左右。TUIP-8细胞系易于聚团，在传代时应尽量挑选尺寸较大的细胞做种子，这样易于保持细胞合成黄酮的能力。
稳定高产黄酮的雪莲细胞系TUIP-8的大规模高密度培养方法，该方法为生物反应器培养采用装配有两个双叶片搅拌桨和直接曝气的气体分布器的7.5LBiostat CT搅拌式生物反应器，装液量为6L，搅拌转速为30～80r/min，培养基为改进的MS培养基，即在MS培养基中添加0.2～0.4mg/L苄基腺嘌呤(BA)、1～4mg/L奈乙酸(NAA)及40～50g/L蔗糖，接种密度为2.5～4g(干重)/L，培养温度为18～28℃，pH控制在4.8～5.6，溶解氧(DO)控制在30％～60％，用两个功率为10瓦的节能日光灯照射培养，培养时间为10-14天，获得细胞聚集尺寸5mm～20mm的雪莲细胞。
7.5L Biostat CT在位灭菌搅拌式生物反应器(德国B.Braun公司)是专门设计用于动物细胞培养的，它的高径比为2∶1，混合较温和，采用无泡通气供氧系统，防止直接通气对动物细胞产生机械损伤，搅拌桨为双叶片透平桨，悬浮能力较强，而产生的剪切力小，该反应器能够非常好地支持动物细胞的培养，但用于植物细胞培养需要做一些改进。
本发明作出的创造性贡献在于改进了该生物反应器，使之能够支持植物细胞培养，并优化了该细胞系的反应器培养工艺1)生物反应器搅拌系统采用两个双叶片搅拌桨(均为B.Braun公司生产的Biostat CT反应器配件)，在细胞培养前期，即细胞密度小于10g(干重)/L时，搅拌转速设定为60～80r/min，在培养后期，随着细胞密度的增加，将搅拌转速调至30～40r/min，主要依靠鼓泡通气来强化液体混合。
2)去掉无泡通气系统，采用直接曝气的气体分布器(B.Braun公司生产的Biostat CT反应器配件)供氧，在培养前期采用间歇式供气方式，供氧气体为空气，即将进气电磁阀置于”auto”位置，控制溶氧为40％，反应器能根据培养液中溶氧水平自动间歇进气；在培养后期将供氧气体改为氧气，仍将进气电磁阀置于”auto”位置，控制溶氧为20％-30％，反应器能根据培养液中溶氧水平自动间歇进气。
摇瓶悬浮培养和生物反应器培养这两种培养方式中，都使用了改进的MS培养基，这也是本发明的创新之处，即通过对MS培养基成分的改进，得到了最利于培养稳定高产雪莲黄酮的雪莲细胞系TUIP-8的配方。
1)碳源和氮源蔗糖是培养TUIP-8细胞最好的碳源，而如果添加果糖或葡萄糖，反而抑制黄酮合成。蔗糖浓度为40g/L最佳，高于80g/L会抑制细胞生长。氮源主要是硝酸铵和硝酸钾，总氮浓度为60mM最佳，培养基中硝酸铵和硝酸钾的浓度均为20mM。
2)大量元素培养基中大量元素CaCl2、MgSO4·7H2O、KH2PO4、KNO3的最佳浓度分别为3mmol/L、2.4mmol/L、1.5mmol/L和20mmol/L。
3)所述改进的培养基中还添加有肉桂酸、乙酸钠和苯丙氨酸。培养基中添加肉桂酸、乙酸钠和苯丙氨酸三种前体可以较大幅度提高黄酮含量。在细胞培养后期添加前体如肉桂酸，可以较好地消除前体可能对细胞生长的抑制作用，并能较大幅度提高次级代谢产物含量。三种前体在培养后期喂饲对细胞生长和黄酮合成的促进作用的强弱顺序为乙酸钠(17.85mg/L)＞苯丙氨酸(35.7mg/L)＞肉桂酸(14.28mg/L)。在25±1℃环境中悬浮培养TUIP-8细胞，添加前体对提高黄酮产量的也有一定的作用。
4)温度对细胞生长和黄酮合成有重要影响，25±1℃环境中悬浮培养TUIP-8细胞的细胞密度和黄酮含量分别是25.9g/L和11.7％，高于17±1℃条件下培养的雪莲细胞的细胞密度(23g/L)和黄酮含量(7.8％)。
本发明的优点是通过优化雪莲细胞的培养工艺，以及改装生物反应器使之适应雪莲细胞生长，实现植物细胞的高密度培养。用生物反应器培养植物细胞是最终实现产业化的必备条件，在反应器中大量培养雪莲细胞，可以获得雪莲原料，并可从中提取有效药用成分以取代天然雪莲的采挖，保护了国家珍惜药用植物资源。用本发明生产雪莲中主要的药用成分雪莲黄酮，成本小，产量大，不受气候和地理条件限制，并且可以放大生产规模以满足临床用药需求。
下面结合附图和较佳实施例对本发明作进一步说明。
图1用Biostat CT反应器培养紫色雪莲细胞系TUIP-8。
图2培养至下罐前，整个反应器中长满了雪莲细胞。
图3在17℃条件下添加肉桂酸对摇瓶悬浮培养雪莲细胞系TUIP-8的影响图4在17℃条件下添加乙酸钠对摇瓶悬浮培养雪莲细胞系TUIP-8的影响图5在17℃条件下添加苯丙氨酸对摇瓶悬浮培养雪莲细胞系TUIP-8的影响具体实施方式
实施例1、摇瓶悬浮培养稳定高产黄酮的雪莲细胞系TUIP-8一、材料1、雪莲细胞系TUIP-8，本室提供。
2、低温光照摇床，型号THZ-C-1A，江苏省太仓市实验设备厂二、方法采用改进的MS培养基(成分见表1)，添加0.3mg/L BA(苄基腺嘌呤)、2mg/L NAA(奈乙酸)及40g/L蔗糖，氮源的总氮浓度为60mM，其中硝酸铵和硝酸钾的浓度均为20mM，培养基中大量元素CaCl2、MgSO4·7H2O、KH2PO4、KNO3的浓度分别为3mmol/L、2.4mmol/L、1.5mmol/L和20mmol/L。
表1培养水母雪莲细胞TUIP-8的培养基配方(改进的MS培养基)
在300mL三角瓶中，加入90mL培养基，接种种龄为7d的细胞，用低温光照摇床振荡培养，培养条件为1)接种密度6g(干重)/L2)摇床转速培养前期设定为135r/min，当细胞堆积体积大于1/2的培养体积时，将摇床转速提高至155r/min；3)光照强度80μmol/(m2·s)的荧光灯照射；4)培养温度25℃。
5)pH值5.6～5.8三、结果经7-9天培养，获得细胞聚集尺寸5mm～20mm的雪莲细胞，细胞培养密度一般在20-22g(干重)/L，雪莲黄酮的含量约12％。
实施例2、生物反应器高密度培养水母雪莲细胞系TUIP-8一、材料1、雪莲细胞系TUIP-8，本室提供。
2、7.5L Biostat CT在位灭菌搅拌式生物反应器，德国B.Braun公司；双叶片搅拌桨，B.Braun公司生产的Biostat CT反应器配件；直接曝气的气体分布器，B.Braun公司生产的Biostat CT反应器配件。
二、方法采用改进的MS培养基，同实施例1。
培养时间为12～14d，获得细胞聚集尺寸3mm～20mm的雪莲细胞。
1)接种密度3g(干重)/L；2)装液量6L；3)搅拌转速在细胞培养前期，即细胞密度小于10g(干重)/L时，搅拌转速设定为60-80r/min，在培养后期，随着细胞密度的增加，将搅拌转速调至30-40r/min，主要依靠鼓泡通气来强化液体混合；4)光照强度用两个功率为10瓦的节能日光灯照射培养；5)培养温度25℃；6)pH值4.8～5.6；7)溶解氧(DO)在培养前期采用间歇式供气方式，供氧气体为空气，即将进气电磁阀置于”auto”位置，控制溶氧为40％，反应器能根据培养液中溶氧水平自动间歇进气；在培养后期将供氧气体改为氧气，仍将进气电磁阀置于”auto”位置，控制溶氧为20％-30％，反应器能根据培养液中溶氧水平自动间歇进气。
三、结果培养至第7天换液4L含有28mg/L乙酸钠、60mg/L苯丙氨酸的改进MS培养基(见实施例1)，至12d～14d下罐收获细胞，整个反应器中充满了新鲜的雪莲细胞(图1)，细胞的堆积体积接近100％，即细胞几乎生长至培养基液面(图2)，可收获细胞130g(干重)以上，培养密度一般为21g/L工作体积，黄酮含量大于11％，利用该反应器一次培养可获得黄酮14g以上。
实施例3、低温条件摇瓶悬浮培养稳定高产黄酮的雪莲细胞系TUIP-8一、材料1、雪莲细胞系TUIP-8，本室提供。
2、低温光照摇床，型号THZ-C-1A，江苏省太仓市实验设备厂二、方法采用改进的MS培养基(成分见实施例1)，添加0.3mg/L BA(苄基腺嘌呤)、2mg/L NAA(奈乙酸)及40g/L蔗糖，氮源的总氮浓度为60mM，其中硝酸铵和硝酸钾的浓度均为20mM，培养基中大量元素CaCl2、MgSO4·7H2O、KH2PO4、KNO3的浓度分别为3mmol/L、2.4mmol/L、1.5mmol/L和20mmol/L。
在300mL三角瓶中，加入90mL培养基，接种种龄为7d的细胞，用低温光照摇床振荡培养，培养条件为1)接种密度6g(干重)/L；2)摇床转速培养前期设定为135r/min，当细胞堆积体积大于1/2的培养体积时，将摇床转速提高至155r/min；3)光照强度80μmol/(m2·s)的荧光灯照射；4)培养温度17℃。
5)pH值5.6～5.86)添加前体两种方法，一种是在细胞接种时直接添加不同浓度的黄酮合成前体肉桂酸、乙酸钠和苯丙氨酸；另一种是在细胞培养7d后添加上述前体。
三、结果喂饲前体是提高植物细胞合成次级代谢产物的一个有效途径。在本专利研究的浓度范围内，喂饲肉桂酸、乙酸钠和苯丙氨酸对细胞的生长基本无抑制作用，相反，添加乙酸钠和苯丙氨酸还可略微提高最终的培养密度。低温(17±1℃)条件下培养雪莲细胞，添加前体可以较大幅度提高黄酮含量。接种时喂饲前体，三种前体都是在低浓度喂饲条件下更有利于提高雪莲黄酮的产量，表明在细胞密度较低时，喂饲较高浓度的前体对细胞生长有一定抑制作用。在细胞培养后期添加前体如肉桂酸，可以较好地消除前体可能对细胞生长的抑制作用，并能较大幅度提高次级代谢产物含量。三种前体在培养后期喂饲对细胞生长和黄酮合成的促进作用的强弱顺序为乙酸钠＞苯丙氨酸＞肉桂酸。(结果见图3、图4、图5)温度对细胞生长和黄酮合成有重要影响，25±1℃环境中悬浮培养TUIP-8细胞的细胞密度和黄酮含量分别是25.9g/L和11.7％，高于17±1℃条件下培养的雪莲细胞的细胞密度(23g/L)和黄酮含量(7.8％)。但是在25±1℃环境中悬浮培养TUIP-8细胞，添加前体对提高黄酮产量的作用不明显，只提高5％～10％，而且前体的组合喂饲对细胞生长和黄酮合成无协同作用。(见表2)表2 温度和混合加入前体对悬浮培养TUIP-8雪莲细胞的影响
注Cin 肉桂酸，终浓度为14.28mg/L；NaAc乙酸钠，终浓度为17.85mg/L；Phe 终浓度为35.7mg/L L-phenylalanine；
权利要求
1.大规模高密度培养雪莲细胞的方法，其特征在于该方法为摇瓶悬浮培养在300mL三角瓶中，加入90mL改进的MS培养基，即在MS培养基中添加0.2～0.4mg/L苄基腺嘌呤(BA)、1～4mg/L奈乙酸(NAA)及40～50g/L蔗糖，接种种龄为7d左右的细胞，细胞接种密度为4～8g(干重)/L，摇床转速为130～160r/min，光照强度为50～100μmol/(m2·s)的荧光灯照射，培养温度为18℃～28℃，pH值为5.8，培养时间为7～9d，获得细胞聚集尺寸5mm～20mm的雪莲细胞。
2.根据权利要求
1所述的大规模高密度培养雪莲细胞的方法，其特征在于所述摇床转速在培养前期设定为135r/min，当细胞堆积体积大于1/2的培养体积时，将摇床转速提高至150～160r/min。
3.根据权利要求
1所述的大规模高密度培养雪莲细胞的方法，其特征在于所述获得的雪莲细胞以细胞聚集尺寸为5mm～20mm的为最佳，其黄酮含量一般均在12％左右。
4.大规模高密度培养雪莲细胞的方法，其特征在于该方法为生物反应器培养采用装配有两个双叶片搅拌桨和直接曝气的气体分布器的7.5L Biostat CT搅拌式生物反应器，装液量为6L，搅拌转速为30～80r/min，培养基为改进的MS培养基，即在MS培养基中添加0.2～0.4mg/L苄基腺嘌呤(BA)、1～4mg/L奈乙酸(NAA)及40～50g/L蔗糖，接种密度为2.5g～4g(干重)/L，培养温度为18℃～28℃，pH控制在4.8～5.6，溶解氧(DO)控制在30％～60％，用两个功率为10瓦的节能日光灯照射培养，培养时间为12～14d，获得细胞聚集尺寸3mm～20mm的雪莲细胞。
5.根据权利要求
4所述的大规模高密度培养雪莲细胞的方法，其特征在于所述的搅拌转速在细胞培养前期，即细胞密度小于10g(干重)/L时，搅拌转速设定为60～80r/min，在培养后期，随着细胞密度的增加，将搅拌转速调至30～40r/min。
6.根据权利要求
4所述的大规模高密度培养雪莲细胞的方法，其特征在于所述的直接曝气的气体分布器在培养前期采用间歇式供气方式，供氧气体为空气；在培养后期供氧气体为氧气。
7.根据权利要求
1或4所述的大规模高密度培养雪莲细胞的方法，其特征在于所述改进的MS培养基中蔗糖的最佳浓度为40g/L。
8.根据权利要求
1或4所述的大规模高密度培养雪莲细胞的方法，其特征在于所述改进的MS培养基的氮源主要为硝酸铵和硝酸钾，总氮浓度为60mM最佳，培养基中硝酸铵和硝酸钾的浓度均为20mM。
9.根据权利要求
1或4所述的大规模高密度培养雪莲细胞的方法，其特征在于所述改进的MS培养基中的CaCl2、MgSO4·7H2O、KH2PO4、KNO3的最佳浓度分别为3mmol/L、2.4mmol/L、1.5mmol/L和20mmol/L。
10.根据权利要求
1或4所述的大规模高密度培养雪莲细胞的方法，其特征在于所述培养温度为25℃。
11.根据权利要求
1或4所述的大规模高密度培养雪莲细胞的方法，其特征在于在培养7天后，换液4L含有28mg/L乙酸钠、60mg/L苯丙氨酸的改进MS培养基。
专利摘要
本发明建立了大规模高密度培养雪莲细胞的工艺与方法。通过优化雪莲细胞的培养参数，优化培养基的组成，以及改装生物反应器使之适应雪莲细胞生长，实现植物细胞的高密度培养。在7.5L生物反应器培养雪莲细胞，培养密度一般为21g/L工作体积，黄酮含量大于11％。用本发明生产雪莲中主要的药用成分雪莲黄酮，成本小，产量大，不受气候和地理条件限制，可以放大生产规模以满足临床用药需求。从雪莲细胞培养物中提取有效药用成分可取代天然雪莲的采挖，有利于保护国家珍惜药用植物资源。
文档编号C12N5/02GKCN1556199SQ200310124256
公开日2004年12月22日 申请日期2003年12月31日
发明者胡显文, 高丽华, 李佐虎, 陆军, 陈惠鹏, 胥照平, 李世崇, 张正光 申请人:中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所, 中国人民解放军军事医学科学院生物工导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan