专利名称:一种纳氏虫及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种原生动物及其应用，特别涉及一种纳氏虫及其应用。
背景技术：
湖泊富营养化问题的日益严重，经常导致蓝藻水华爆发。蓝藻水华是一个典型的生态问题，控制和治理藻华的关键是找到一种能够直接有效杀死或者抑制藻类生长的因子，该因子应该经济，便于大规模使用，而且不能造成二次污染。化学杀藻剂的使用可以在一段时期内有效的控制水华，但是价格昂贵，且可能产生二次污染。即使化学杀藻剂不产生立刻的负面影响，也会增加湖泊底泥中有害物质的浓度。从水体中分离得到的生物控藻因子(主要是微生物)不仅不会产生上述问题，而且它们专一性作用于靶标生物，是一种很有希望的控藻因子。
自然界中有很多生物都可以控制藻类的生长，它们主要包括蓝藻病毒(噬藻体)、溶藻细菌、原生动物、真菌和放线菌(赵以军石正丽等蓝藻病毒(噬藻体)的研究进展中国病毒学1999 14(2)100-104；赵以军 刘永定 有害藻类及其微生物防治的基础—藻菌关系的研究动态 水生生物学)。它们直接分离于自然界，因此使用这些生物控藻因子只是对原有湖泊生态平衡的改变，不会象营养源控制(下行调控)和“生物操纵”(Biomanipualtion)对湖泊生态系统产生根本的改变。它们适合在水华发生初期使用，短期内控制藻类生物量或者阻止藻类大量增殖。
比较各种控藻生物因子的环境适应力、繁殖能力、控藻效力、宿主范围、对宿主改变的适应能力以及不利环境下的抗逆性等多种因素，人们认为原生动物是一种很有实用潜力的控藻剂(Daft，M.J.，Burnham，J.C.，and Yamamoto，Y.1985.Algalbloomsconsequences and potential cures.J.Appl.Bacteriol.(Symp.Suppl.)175-186)。原生动物作为控藻因子有以下优势原生动物取食范围广，食量大，实验室中观测到，只要原生动物数目达到某一阈值，体系中的藻细胞会迅速消耗殆尽；很多原生动物在食物耗尽时会形成包囊，当藻类重新增多时，包囊又会破壁成为食藻营养体；包囊结构具有很强的抗逆性，这种形式容易包装和运输；容易繁殖，原生动物可以利用有机培养基大量发酵培养。
自然界中，有很多种类的原生动物可以以藻类为食，甚至有一些原生动物将藻类作为它们的唯一食物来源。就目前的报道来说，食藻原生动物主要分为鞭毛虫、变形虫和纤毛虫三个大类。
双鞭毛阿米巴科中的纳氏虫属(Naegleria Sp.)阿米巴，多孳生于淡水中，活动的滋养体呈长阿米巴形，大小为7×20μm，常向一端伸出宽大奔放的伪足，另一端较细小为伪尾区，在不良环境中可形成有2根鞭毛的滋养体，此型不分裂也不直接形成包囊。包囊圆形，直径9μm，单核，囊壁光滑有孔。
蓝藻类分布广泛，主要生活在淡水中，可形成‘水华’，我国南方一年四季都可以看到由蓝藻类形成的水华。其中，鱼腥藻或拟鱼腥藻水华由螺旋鱼腥藻(Anabaenaspiroides)或其他鱼腥藻属的种类以及拟鱼腥藻引起。优势种极为突出，可占生物总量的95％以上，水色蓝绿或深绿，可见到翠绿色絮纱或蓝绿色浮膜。
发明创造内容本发明的目的是提供一种新的具有较强食藻能力的纳氏虫。
本发明所提供的纳氏虫是纳氏虫(Naegleria sp.)W2，已于2003年11月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCC№1044。
纳氏虫(Naegleria sp.)W2 CGMCC №1044自滇池水华水样分离得到。
实验证明，纳氏虫(Naegleria sp.)W2 CGMCC №1044可以取食多种链状蓝藻，可单独使用，如将其附着在漂浮物(比如稻草杆或大麦)上，它们本身即有控藻作用，产生较好的效果，同时也可与其它原生动物、溶藻菌和噬藻体等控藻因子共同使用，会产生更全面的控藻效果，在有效治理水体富营养化，特别是蓝藻水华方面将发挥重要作用，市场潜力巨大。
图1a为纳氏虫W2在水华鱼腥藻(Anabaena flos-aquae)上形成的食藻斑及空白对照图1b为纳氏虫W2在水华鱼腥藻(Anabaena flos-aquae)上形成的食藻斑的相隔6小时的变化情况图2为纳氏虫W2在鱼腥藻培养液中引起的溶藻情况图3A为微分干涉视场下纳氏虫W2的营养体图3B为微分干涉视场下纳氏虫W2的包囊图4为微分干涉视场下同一个原生动物营养体对一个鱼腥藻细胞丝的取食过程图5为不同取食时期纳氏虫W2在普通明视场(BR)和荧光暗视场(FL)下的显微照片图6为原生动物基因组DNA及其18SrRNA基因的PCR扩增图7为纳氏虫W2和Naegleria australiensis 18SrRNA基因的比对图8为三角瓶中纳氏虫W2食藻过程实验进行60小时的照片图9a为三角瓶中纳氏虫W2食藻过程实验中叶绿素-a变化曲线(代表藻细胞生物量)图9b为三角瓶中纳氏虫W2食藻过程实验中原生动物数目对数曲线图9c为三角瓶中纳氏虫W2食藻过程实验中pH值变化曲线图9d为三角瓶中纳氏虫W2食藻过程实验中溶解氧(DO)变化曲线图10为纳氏虫W2对鱼腥藻悬浮培养物的除藻效果图11为纳氏虫W2食藻过程中Chl-a含量的变化具体实施方式
实施例1、原生动物纳氏虫(Naegleria sp.)W2 CGMCC №1044的分离以及食藻特性1.纳氏虫(Naegleria sp.)W2 CGMCC №1044的分离将滇池水华水样经过宿主藻-水华鱼腥藻(Anabaena flos-aquae)细胞培养液富集之后，用藻苔稀释涂布法分离。藻苔平板培养4-5天之后，藻苔上形成不断扩大的食藻斑，如图1a和图1b所示，图1a中，左侧培养平板为培养4天后藻苔上形成的食藻斑；右侧培养平板为空白对照；图1b中，左侧培养平板为6小时前的食藻斑，右侧培养平板为6小时后的食藻斑。经过显微镜检验，形成食藻斑的是一种变形虫，即纳氏虫(Naegleria sp.)W2 CGMCC №1044。将食藻斑用牙签挑接到藻液中会引起溶藻，如图2所示，图2中，右侧培养瓶为接入0.5ml纳氏虫(Naegleria sp.)W2 CGMCC№1044培养物96小时的溶藻状况；中间培养瓶为接入0.5ml W2培养物48小时的溶藻状况；左侧培养瓶为空白对照。
2.纳氏虫(Naegleria sp.)W2 CGMCC №1044的食藻范围将不同藻类培养物制成藻苔平板，根据纳氏虫(Naegleria sp.)W2 CGMCC №1044在藻苔上形成食藻斑的能力评估其食藻范围。结果如表1所示表1.纳氏虫(Naegleria sp.)W2 CGMCC №1044以及其它两种原生动物对各种蓝藻的取食情况*
注*培养6天后记录食藻斑的大小-，不形成食藻斑；+，食藻斑直径≤15mm；++，食藻斑直径＞15mm.
表1表明，纳氏虫(Naegleria sp.)W2 CGMCC №1044可以取食多种链状蓝藻，而对单细胞的组囊藻Anacystis nidulans和微囊藻Microcystis aeruginosa没有取食作用。表1中，W3和D5为从北京地区分离的两种食藻原生动物，属于丝足纲(Filosea)吮噬科(Vampyrelldae)核虫属(Nuclearia)该属的原生动物动物它们与藻类关系密切，往往和藻类共生或寄生与藻类上，以藻类为主要食物。
3.纳氏虫(Naegleria sp.)W2 CGMCC №1044的形态特征通过显微镜观察，确定了纳氏虫(Naegleria sp.)W2 CGMCC №1044的形态特征，如图3A、图3B和图4所示，原生动物纳氏虫(Naegleria sp.)W2 CGMCC №1044休息时椭圆形，直径10-30um，在运动或捕食时会随产生不定型的透明伪足，此时身体直径20-50um。单核(直径4-6um)，取食后产生食物泡(3-10um)，食物耗尽后营养体会形成包囊(直径10-20um)。图3A中，N为细胞核，V为食物泡，P为伪足；图3B中，C为包囊；CW为包囊壁；图3A和图3B中标尺代表10um。图4中，图片A为一个原生动物沿着藻丝朝一段运动；图片B为纳氏虫(Naegleria sp.)W2 CGMCC №1044伪足延伸包围了藻丝的一端；图片C和D为藻丝被原生动物吞食；V为食物泡；P为伪足；F为鱼腥藻细胞丝，图中标尺代表10um。
在430nm波长光线激发下，藻细胞中的藻红素和叶绿素会被激发出红色荧光，根据此原理，跟踪了藻细胞在原生动物体内的流动和消化情况，结果如图5所示，表示藻细胞在纳氏虫(Naegleria sp.)W2 CGMCC №1044体内食物泡中的消化进程从图片A和B可以看出接入W2 24小时，存在大量藻丝，原生动物数量还没有上去，原生动物食物充裕，整个细胞体都发出藻细胞的红色荧光；从图片C和D可以看出接入纳氏虫(Naegleria sp.)W2 CGMCC №1044 48小时，原生动物数量显著提高，细胞体中含有大量发出红色荧光明亮的食物泡；从图片E和F可以看出接入纳氏虫(Naegleria sp.)W2 CGMCC №1044 96小时，体系中的食物接近耗尽，只剩大量藻骸(CD)，很多营养体已经没有食物泡。图5中，F为藻丝；V为食物泡；P为伪足；N为细胞核；T为纳氏虫(Naegleria sp.)W2 CGMCC №1044营养体，图中标记代表20um。
4.通过rDNA基因鉴定技术确定W2的分类地位以往原生动物的微观形态结构和生活特性是其鉴定的主要标准，但是对于一种新分离得到的原生动物要通过形态结构确定所属的种类需要丰富的经验和较长的时间。生物细胞中编码rRNA的保守基因，已成为确定物种分类地位的重要标识和研究分子进化的重要参数。由于分子克隆技术的日益成熟，获得原生动物的rDNA序列已经非常简便快捷。
以食藻原生动物基因组DNA为模板，以W2-A(5′-TGTTGAGTCAA ATTAAGCCGC-3′)和W2-S(5′-AATTAGGGTTCGATTCCGGA-3′)为引物进行PCR扩增。扩增产物经过1.0％琼脂糖凝胶电泳分离，结果如图6所示，表明各个食藻原生动物基因组DNA都扩增出来出现了特异性的亮带，其大小均与设预计的930bp一致。图6中M表示λDNA/EcoR I+HindIII Marker；A道为鱼腥藻对照PCR扩增的结果；纳氏虫(Naegleria sp.)W2 CGMCC №1044、W3、2H、D5(W3、2H、D5为三种食藻原生动物，属于丝足纲(Filosea)吮噬科(Vampyrelldae)核虫属(Nuclearia))为四种食藻原生动物的基因组DNA；1-8道为分别以纳氏虫(Naegleria sp.)W2 CGMCC №1044、W3、2H、D5的基因组DNA做模板的18SrRNA基因PCR产物。
对各种食藻原生动物18SrRNA基因PCR产物的克隆测序结果进行BLAST分析，结果如图7所示，表明纳氏虫(Naegleria sp.)W2 CGMCC №1044 18SrRNA基因部分序列和澳大利亚纳氏虫(Naegleria australiensis)的18SrRNA基因部分序列的相似性达到99％。结合显微观察和宏观实验，W2的形态和生活史特性都符合纳氏虫属的特征，确定纳氏虫(Naegleria sp.)W2 CGMCC №1044属于裂芡目(Schizopyrenida)纳氏虫属(Negleria)。
纳氏虫(Naegleria sp.)，也称为福氏内格里阿米巴，是土壤和水环境中分布很广的一类原生动物。目前对纳氏虫的研究主要针对它的致病性，福勒尔-耐格里(Naegleria fowleri)原虫会引起原发性阿米巴性脑膜脑炎(primary amebicmebubgo-encepha-litis)，和W2 CGMCC №1044 18SrRNA基因部分序列相似性达到99％的澳大利亚纳氏虫(Naegleria australiensis)也会引起人或其他动物的化脓性阿米巴脑膜炎。实验室中研究的W2 CGMCC №1044至今仍未发现具任何的致病性，并且国外对该属原生动物的研究中也从未有关于其食藻活性的报导。本属原生动物主要依据rDNA(5.8S DNA或者18S rDNA)序列分为24个种[7]，其中与W2的rDNA序列相似性最高的为99％(923个碱基的序列中有4个碱基的差异)，W2 CGMCC №1044与同属的Naegleria.gruberi 18S subunit ribosomal RNA gene的相似性为97％(923个碱基的序列中有20个碱基的差异)，与同属的Naegleria italicasubunit ribosomal RNA gene的相似性为97％(923个碱基的序列中有23个碱基的差异)，与Naegleria clarki的相似性为96％(717个碱基的序列中有24个碱基的差异)，W2 CGMCC №1044与Naegleria fowleri、Naegleria indonesiensis、Naegleria fowleri、Naegleria lovaniensis、Naegleria andersoni和Naegleria jamiesoni等同属种类的rDNA序列相似性在96％-94％之间。对于非常保守的核糖体RNA编码基因来说，这样的差异已经足以成为W2为新种的证据。
实施例2、W2模拟控藻实验(1)三角瓶中纳氏虫(Naegleria sp.)W2 CGMCC №1044食藻过程实验在300ml三角瓶中进行，每瓶120ml鱼腥藻藻液。向初始叶绿素A含量为0.95mg l-1的鱼腥藻藻液中投加纳氏虫(Naegleria sp.)W2 CGMCC №1044培养液，使纳氏虫(Naegleria sp.)W2 CGMCC №1044起始浓度分别为100，500，1000个细胞/ml。每天监测鱼腥藻生物量、活动的原生动物数量，溶解氧和pH值。实验结果如图8、图9a、图9b、图9c和图9d所示，表明在3天时间内，纳氏虫(Naegleria sp.)W2 CGMCC №1044大量繁殖，当达到105个细胞/ml时，藻细胞生物量急剧降低，同时体系的溶解氧和pH值都下降。4天以后，作为纳氏虫(Naegleria sp.)W2 CGMCC №1044食物的藻细胞已经很少，大部分纳氏虫(Naegleria sp.)W2 CGMCC №1044营养体开始形成包囊，进入休眠状态，体系中溶解氧由于复氧作用有所回升。图8中，A列三瓶原生动物初始浓度为2000个细胞/ml；B列三瓶原生动物初始浓度为500个细胞/ml；C列三瓶原生动物初始浓度为100个细胞/ml；D列三瓶为空白对照。图9a、图9b、图9c和图9d中每个点代表三组重复的平均值，方差用误差线标出。
(2)W2对鱼腥藻模拟水华的除藻效果将培养3天的鱼腥藻培养物混匀后分装于水槽中各2升，分别加入0、0.004、0.04、0.4、4.0ml的纳氏虫(Naegleria sp.)W2 CGMCC №1044悬浮液(2-3个/ul)，每隔12小时测定溶藻效率及其叶绿素-a(Chl-a)含量的变化。结果如图10和图11所示，图10表明当体系中原生动物数目达到105cells/ml以后，藻细胞生物量会急剧下降(从48小时处理和96小时处理的差异可以看出)，达到除藻效果。图11表明，随着纳氏虫(Naegleria sp.)W2 CGMCC №1044浓度的增加，叶绿素-a的含量不断下降。
权利要求
1.纳氏虫(Naegleria sp.)W2 CGMCC №1044。
2.纳氏虫(Naegleria sp.)W2 CGMCC №1044在治理水体富营养化中的应用。
3.纳氏虫(Naegleria sp.)W2 CGMCC №1044在治理蓝藻水华中的应用。
专利摘要
本发明公开了一种纳氏虫及其应用，其目的是提供一种具有较强食藻能力的纳氏虫及其应用，本发明所提供的纳氏虫为纳氏虫(Naegleria sp.)W2 CGMCC №1044，可以取食多种链状蓝藻，可用于治理水体富营养化，特别是蓝藻水华。
文档编号C12N1/10GKCN1266267SQ200310117125
公开日2006年7月26日 申请日期2003年12月3日
发明者安成才, 刘新尧, 石苗, 廖永红, 邹莉, 吴为中, 温东辉, 张仲凯 申请人:北京大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan