专利名称：:一种微生物发酵合成α-酮戊二酸的方法
技术领域：
：本发明涉及一种微生物发酵合成α-酮戊二酸的方法。
背景技术：
：α-酮戊二酸(α-ketoglutaricacid，简称α-KG)，化学名称2-氧代-1，5戊二酸，结构式为是白色或类白色的粉末状物质，易溶于水，作为一种有机中间体广泛应用于有机合成生产中；是一种重要的生化试剂、另外可作为配套试剂用于测定肝功能，作为营养强化剂广泛应用于提高机体免疫能力；降低术后患者和长期病人的机体损耗；在脑部作为氨酪酸和谷氨酸合成的前体；与身体内的能量产物有关。作为运动营养饮料的成分，可促进有氧供能；提高运动员胰岛素水平，促进氨基酸、血糖等供能物质的吸收，提高肌糖原和蛋白质合成，提高内源性睾酮水平，促进运动后恢复。目前，α-酮戊二酸的制备方法是化学合成法。而微生物发酵合成α-酮戊二酸尚未见文献报道。
发明内容本发明的目的是提供一种微生物发酵合成α-酮戊二酸的方法。本发明的技术方案利用多重维生素营养缺陷型菌株光滑球拟酵母(Torulopsisglabrata)CCTCCM202019发酵生产丙酮酸过程中，培养基中添加碳酸钙和增大生物素的浓度能促进发酵液中α-KG的生成。1菌种光滑球拟酵母(T.glabrata)CCTCCM202019，烟酸、生物素、硫胺素、盐酸吡哆醇四种维生素营养缺陷型菌株，且丙酮酸脱羧酶活性组成型降低，为本研究室选育菌株，该菌种已申请中国专利，申请号为02113142.2，公开号CN1392246A。2培养基和培养方法培养基组成(g/L)葡萄糖100，乙酸钠6，氯化铵7，KH2PO45，MgSO4·7H2O0.8，KCl5，盐酸硫胺素20μg/L，生物素40～60μg/L，烟酸4mg/L，盐酸吡哆醇100μg/L，CaCO320-40，微量元素液5mL，初始pH5.0，自来水配制；微量元素液CaCl2·2H2O2g，FeSO4·7H2O2g，ZnCl20.5g，MnCl2·4H2O0.2g，CuSO4·5H2O0.05g，2mol/LHCl溶解后定容至1L。培养方法为摇瓶发酵，500mL锥形瓶中发酵培养基为50mL，温度为30℃，转速200r/min，发酵时间为48h；发酵罐发酵，7L发酵罐中发酵培养基体积为4L，温度为30℃、通气量3L/(L·min)，搅拌转速为400r/min，发酵时间为60h。3分析方法葡萄糖的测定3，5-二硝基水杨酸法。丙酮酸和α-酮戊二酸的测定采用高压液相色谱(HPLC)测定。色谱条件为StableBondC18反相柱，柱温28℃，检测器UV210nm，流动相0.1％H3PO4，流速1.0mL/min，进样体积10uL。丙酮酸羧化酶和丙酮酸脱氢酶活性的测定将在30℃下培养了24h的细胞用无菌水离心洗涤3次，然后悬浮在pH为7.5的0.1mol/L的磷酸钾缓冲液中，用玻璃珠于4℃下振荡5min，使细胞在悬浮液中混合均匀，于4℃超声波破碎2min，工作强度为30％，工作1s间隔0.5s；随后在4℃、10,000r/min下离心3min，除去细胞碎片，取上清液测定。丙酮酸羧化酶(PC)活性的测定反应混合物中含有pH7.8的磷酸盐(PBS)缓冲液0.56mL、蒸馏水1.7mL、0.5mol/LNaHCO3溶液0.4mL、0.1mol/LMgCl2溶液0.2mL、1.0mmol/L的乙酰辅酶A溶液0.4mL、0.1mol/L5，5-二硫代二苯基安息香酸的乙醇溶液0.1mL、1000μ/mL的柠檬酸合成酶0.02mL、0.1mol/L的三磷酸腺苷(ATP)溶液0.2mL，细胞抽提物0.2mL，将上述混合液于30℃下保温10min。添加0.2mL0.1mol/L的丙酮酸启动反应，反应60s后添加0.3mL的1mol/L的KOH终止反应，然后用分光光度计在415nm下检测草酰乙酸的生成量。根据标准曲线计算出丙酮酸羧化酶的活性。1个酶活单位表示为1min内该酶催化产物生成的微摩尔数。丙酮酸脱氢酶系(PDH)活性的测定反应混合物中含有pH7.8磷酸钾缓冲液1.0mL、2.5mmol/L烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)0.2mL、0.2mmol/L焦磷酸硫胺素0.2mL、0.1mmol/L乙酰辅酶A0.4mL、0.3mmol/L二硫苏糖醇0.1mL、1mmol/L氯化镁0.2mL、1mg/mL牛血清蛋白0.1mL，6mmol/L2-碘苯基-3-硝基苯氯化四唑(INT)0.4mL，0.1mg/L硫辛酰胺脱氢酶0.1mL、细胞抽提物0.5mL。将上述混合液于30℃保温10min后添加0.2mL5mmol/L丙酮酸启动反应，反应60s后加入0.5mL的1mol/L的H2SO4溶液终止反应，然后于30℃下用分光光度计在500nm下检测INT的减少量。1个酶活单位表示为在1min内该酶催化底物减少的微摩尔数。细胞干重(DCW)用分光光度计测定OD值后按照1OD＝0.23g干菌体进行计算；蛋白质含量的测定用改进的Folin-酚法。4相关技术条件对α-酮戊二酸生成的影响①摇瓶与发酵罐生产丙酮酸的对比实验在发酵罐中对培养基进行灭菌，接种混匀后，将30mL已接种的培养基无菌转移至已灭菌的500mL三角瓶中进行摇瓶培养，以考察培养基组成完全相同的情况下发酵罐和摇瓶培养的差异。如表1所示，当摇瓶和发酵罐中不调节pH时，细胞生长微弱，丙酮酸积累也很少。在摇瓶中用CaCO3作为缓冲剂时，细胞正常生长，丙酮酸大量积累，但同时也产生了较高浓度(6.8g/L)的α-KG。在发酵罐培养中，如果用NaOH调节pH，发酵液中α-KG浓度很低。但如果改用CaCO3调节pH，发酵液中α-KG的浓度则比用NaOH调节pH时增加了8倍。在发酵罐和摇瓶培养中，用CaCO3调节pH时的CPYR/CKG值相近，表明CaCO3的添加对发酵液中α-KG的积累有重要影响。表1摇瓶和发酵罐上发酵的对照说明CPYR/CKG为丙酮酸的碳摩尔数与α-KG的碳摩尔数的比值。②CaCO3添加时间和浓度对α-KG产生的影响为了说明CaCO3的添加是否是导致α-KG产生的主要因素，本发明研究了CaCO3添加时间和浓度对α-KG产生的影响。在维生素浓度不变的前提下，延迟CaCO3添加时间可明显抑制α-KG的产生并提高CPYR/CKG值(图1)，而增加培养基中的CaCO3浓度会导致α-KG的积累增加(表2)。这些结果表明CaCO3有可能以某种方式(如激活了PDH或PC)，使丙酮酸进入TCA循环的通量增加。表2不同装液量下CaCO3质量浓度对丙酮酸发酵的影响③Ca2+、CO32-对α-KG的影响发酵液中CaCO3的存在促进了α-KG的积累，但具体是Ca2+还是CO32-或者是两者共同促进了α-KG的积累呢？为了解释这一问题，作者设计了5种方法来自动控制7L发酵罐(装液量4L)发酵过程的pH(1)流加5mol/L的NaOH；(2)流加2.5mol/L的Na2CO3；(3)流加CaCO3悬浊液(150gCaCO3/100mL水)；(4)在发酵开始后流加浓度为40％的CaCl2浓缩液(流加速度25mL/h，共流加8h，使发酵液中CaCl2终浓度达到20g/L)，同时流加5mol/L的NaOH；(5)在发酵开始后流加浓度为40％的CaCl2浓缩液(流加方法同(4))，同时用2.5mol/L的Na2CO3调节pH。5种情况下的发酵过程曲线如图2所示。从图2(A)可知，当用NaOH对发酵过程的pH进行调节时，CPYR/CKG值可保持在50～60之间；用NaCO3调节pH时，发酵过程中的CPYR/CKG值下降到20～30。当用CaCO3调节pH时，或者当发酵液中有大量CaCl2存在、再用NaOH或NaCO3调节pH时，发酵过程中的CPYR/CKG值均低于10。结合图2(B)可以认为，Ca2+和CO32-都促进了α-KG的积累，其中Ca2+对α-KG积累起主要促进作用。此外，在图2(C)中发现，与用NaOH调节pH的发酵过程相比，当培养基中有大量Ca2+存在时，细胞生长较快，最终细胞浓度也较高。这可能是因为Ca2+作为细胞内的第二信使，能够加速细胞的生长；此外，有Ca2+存在时α-KG浓度较高，为合成更多细胞物质提供了可能，导致最终细胞量有所提高。研究还发现用不同物质调节pH时对丙酮酸的积累速度和产量也有影响。如图2(D)所示，当有Ca2+存在时，由于细胞生长较快，丙酮酸积累速度也较快，但丙酮酸的产量有所下降。同时由于α-KG的产生，丙酮酸对葡萄糖得率有所下降(数据未给出)。④硫胺素和生物素浓度对α-KG生成的影响在菌株T.glabrataCCTCCM202019中，PDH和PC是控制丙酮酸降解进入TCA循环的两个重要酶(系)(图3)，其活性的高低决定了进入TCA循环碳流的多少。由于该菌株自身不能合成硫胺素(B1)和生物素(Bio)，因此该菌株胞内的PDH和PC活性可分别被培养基中的B1和Bio浓度所控制。为了考察具体是哪个酶(系)影响α-KG的产生，本发明在CaCO3添加浓度为40g/L的前提下，研究了不同B1和Bio浓度对α-KG积累的影响。结果发现，改变培养基中B1的浓度，对α-KG的积累、特别是对CPYR/CKG值没有影响(图4A)。而增加培养基中Bio的浓度，则导致α-KG的浓度不断上升且CPYR/CKG值不断下降(图4B)，培养基中生物素的浓度以40～60μg/L为宜。由于Bio是PC的辅因子，据此可以认为α-KG的产生是由PC活性变化而引起的。⑤采用不同调节pH物质对PC和PDH活性的影响维持培养基中维生素质量浓度不变，在发酵进行到细胞对数生长期时(20h)，测定采用不同物质调节发酵液中pH时细胞内PC和PDH活性的变化。结果发现(图5)，当有Ca2+存在时，胞内PC的活性最高可提高40％，而PDH的活性没有明显变化。表明Ca2+可提高PC的活性，从而使丙酮酸通过丙酮酸羧化途径进入TCA循环的通量增加。由于α-KG脱氢酶亦以B1为辅因子，在B1限制的条件下，α-KG脱氢酶活性也很低，由此导致发酵液中α-KG大量积累。本发明首次发现酵母的PC活性有可能被Ca2+激活，从而使T.glabrata从发酵生产丙酮酸转向合成高浓度的α-KG。综上所述，培养基中添加CaCO3的质量浓度为20～40g/L，生物素浓度为40～60μg/L，α-酮戊二酸的生成量为15～40g/L。本发明有益效果在多重维生素营养缺陷型菌株光滑球拟酵母CCTCCM202019发酵生产丙酮酸的摇瓶和发酵罐实验中发现，CaCO3的添加对发酵液中α-酮戊二酸(α-KG)的积累有重要影响。在维生素浓度不变且供氧充分的前提下，延迟CaCO3添加时间可明显抑制α-KG的产生，并提高丙酮酸与α-KG的碳摩尔比(CPYR/CKG)；而增加培养基中的CaCO3浓度会导致α-KG积累的增加。用不同物质调节发酵液中pH的实验证实在丙酮酸发酵过程中，Ca2+对α-KG的积累起主要作用，CO32-起辅助作用，两者对α-KG的积累具有协同效应。维持培养基中CaCO3浓度不变，改变培养基中硫胺素的浓度，对α-KG的积累、特别是对CPYR/CKG值没有影响；而增加培养基中生物素的浓度，则导致α-KG的浓度不断上升且CPYR/CKG值不断下降。当有Ca2+存在时，胞内丙酮酸羧化酶的活性可提高40％，而丙酮酸脱氢酶系的活性没有明显变化，培养基中Ca2+和生物素浓度的增大可显著提高丙酮酸羧化酶的活性，从而使T.glabrata从发酵生产丙酮酸转向合成高浓度的α-KG。图1CaCO3(40g/L)添加时间对α-KG生成的影响图2不同物质调节pH时对α-KG产生的影响图3Torulopsisglabrata中丙酮酸的代谢图4硫胺素、生物素浓度对α-KG积累的影响图5不同调节pH的物质对PC和PDH活性的影响生物材料样品保藏光滑球拟酵母，保藏日期2002年4月29日，保藏单位名称及简称中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号NOM202019。具体实施方式实施例1在7L发酵罐中对培养基进行灭菌，按照10％(体积比)接种微生物种子，接种混匀后，将50mL已接种的培养基无菌转移至已灭菌的500mL三角瓶中，同时添加40g/L碳酸钙进行摇瓶培养，30℃、200rpm培养48h，测得α-酮戊二酸浓度为15.8g/L，CPYR/CKG为3.1。实施例2接种、培养条件同实施例1，另加入20～40μg/L的生物素，发现α-酮戊二酸浓度随着生物素浓度的增大而增大，CPYR/CKG逐渐减小。在培养基中生物素总浓度达到60μg/L时，测得α-酮戊二酸浓度为23.5g/L，CPYR/CKG为1.47。实施例3在7L发酵罐中装4L发酵培养基后进行灭菌，按照10％(体积比)接入光滑球拟酵母，培养基中添加有40g/L碳酸钙，同时含有60μg/L生物素。30℃、通气量3L/(L·min)，转速400rpm培养60h后测得α-酮戊二酸浓度为38.4g/L，CPYR/CKG为0.72。权利要求1.一种微生物发酵合成α-酮戊二酸的方法，其特征是利用多重维生素营养缺陷型菌株光滑球拟酵母(Torulopsisglabrata)CCTCCM202019发酵生产丙酮酸过程中，培养基中添加碳酸钙和增大生物素的浓度能促进发酵液中α-KG的生成。2.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述发酵过程的培养基组成(g/L)葡萄糖100，乙酸钠6，氯化铵7，KH2PO45，MgSO4·7H2O0.8，KCl5，盐酸硫胺素20μg/L，生物素40～60μg/L，烟酸4mg/L，盐酸吡哆醇100μg/L，CaCO320-40，微量元素液5mL，初始pH5.0，自来水配制；微量元素液CaCl2·2H2O2g，FeSO4·7H2O2g，ZnCl20.5g，MnCl2·4H2O0.2g，CuSO4·5H2O0.05g，2mol/LHCl溶解后定容至1L。3.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述发酵过程的培养方法为摇瓶发酵，500mL锥形瓶中发酵培养基为50mL，温度为30℃，转速200r/min，发酵时间为48h；发酵罐发酵，7L发酵罐中发酵培养基体积为4L，温度为30℃、通气量3L/(L·min)，搅拌转速为400r/min，发酵时间为60h。4.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述发酵过程培养基中添加CaCO3的质量浓度为20～40g/L，生物素浓度为40～60μg/L，α-酮戊二酸的生成量为15～40g/L。专利摘要一种微生物发酵合成α－酮戊二酸的方法，通过在培养基中添加碳酸钙和增大生物素浓度促进丙酮酸发酵过程中生成大量α－酮戊二酸。光滑球拟酵母CCTCCM202019发酵生产丙酮酸过程中，延迟碳酸钙添加时间会抑制α－KG的生成，并提高丙酮酸与α－KG的碳摩尔比(C文档编号C12P7/40GKCN1544642SQ200310106298公开日2004年11月10日申请日期2003年11月13日发明者陈坚,李寅,刘立明,伦世仪,陈坚申请人:江南大学导出引文BiBTeX,EndNote,RefMan