专利名称:半夏总有机酸和提取方法及其在制备药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种中草药提取物，特别是涉及一种中草药提取物和提取方法及其在制备治疗疾病药物中的应用。
背景技术：
半夏为天南星科植物三叶半夏Pinellia ternata(Thunb)Breit干燥块茎，是中医临床最常用的中药，具有降逆止呕、燥湿化痰、消痞散结等功效。临床主要用于与各种方剂配伍治疗痰多咳喘、痰饮眩悸、呕吐反胃、胸脘痞闷、梅核气、痰厥头痛等，生品外用治疗痈肿痰核，姜制后多用于降逆止呕。
半夏主产于四川、江苏、安徽、浙江、河南、湖北、江西、山东、云南等地，野生半夏几乎全国大部分地区均有生长，由于半夏临床用量大，野生半夏来源日益萎缩，因而目前药材市场上均以栽培的半夏供临床应用，其中以四川、安徽、河南、山东、湖北等地栽培的半夏药材产量较大。
中药半夏是中医临床最常用的中药之一，其功效多，临床配伍量大。据统计，在558种中药处方中，半夏的使用频率居第22位。半夏的研究已经有近70年的历史，但到目前为止，半夏药材中起治疗作用的有效成分和有效部位均不甚明了，尤其是半夏临床使用最广泛的止咳化痰、消痞散结的有效成分和有效部位不清楚。本发明专利申请的内容就是针对半夏研究中的问题首次提出其止咳化痰、消痞散结的有效部位的类别和提取分离技术以及作用。
中药材的药效物质基础研究一直是中药现代化研究中迫切需要解决的关键问题。也是中药走出国门，为世界医药界所认识和接受的主要科学依据。在中药复方的药效物质基础研究的过程中，组成复方的单味中药本身所具有的药效物质和所产生的作用就成为对整体复方作用贡献的药效物质基础。而到目前为止，临床上常用的300多味中药中仅有数十味中药的主要有效成分比较明确，如人参中的人参皂苷类成分、银杏中的黄酮苷类成分、甘草中的甘草酸类成分、大黄中的蒽醌类成分、丹参中的丹参酮、丹参酸类成分等。综合这些药材的有效成分，均以成分类别作为药效的物质基础。而以单一成分代表药效的例子较少。作为有效部位的研究技术和成分类别，半夏中止咳化痰、消痞散结的有效部位总有机酸类成分在以往的研究中均未见到。
发明内容
1、发明目的
本发明的目的是针对目前半夏药材起治疗作用的有效部位和有效成份尚不清楚的问题，本发明专利申请是从半夏药材中提取起止咳作用和消痞散结作用的有效部位和有效成分，以及提取分离方法和药理药效作用，及其在制备治疗止咳化痰、消痞散结、抗肿瘤药物中的应用。
2、技术方案本发明的目的是采用下列技术方案来实现的半夏总有机酸，其特征是主要包括琥珀酸、棕榈酸、N-乙酰谷氨酸、苹果酸等有效成分。
半夏总有机酸的提取分离方法，其提取工艺步骤如下(1)称取半夏生药材，粉碎成粗粉；(2)用乙醇提取，减压回收乙醇，得醇浸膏；(3)加入稀盐酸，调节PH值，将该溶液用乙酸乙酯进行萃取至萃取液无色后，进行减压浓缩；(4)再用稀碱溶液萃取，合并碱液后，用稀酸酸化；(5)然后用乙酸乙酯萃取，直至乙酸乙酯萃取液无色，并无有机酸反应，萃取液减压回收乙酸乙酯，得提取物浸膏；(6)将浸膏用乙醇溶解后，过滤，滤液减压回收乙醇，得半夏总有机酸提取物。
上述步骤(1)中半夏药材粗粉为10-40目，步骤(2)中所用的乙醇浓度为60-95％，乙醇量为8～15倍量，提取方法为渗漉或加热回流，加热回流的次数为2～3次，每次回流的时间为1～2小时；步骤(3)中的PH值为1.0-3.0，用1∶3的乙酸乙酯萃取，步骤(4)中的稀碱溶液包括Na2CO3、NaOH、NaHCO3，碱液浓度为3-8％，稀酸包括HCl、H2SO4，其浓度为10-30％。
将半夏总有机酸浸膏40-80g与硅胶拌样、湿法上柱，经石油醚∶乙酸乙酯不同的比例梯度洗脱，得到琥珀酸、棕榈酸、N-乙酰谷氨酸；总有机酸溶解在乙醇溶液中，经硅胶G板制备薄层层析得到苹果酸等有效成分。上述技术方案中，拌有机酸的硅胶用量为100～150g，制备层析中硅胶板置硝酸钾饱和溶液中饱和的时间为8～12小时，有机酸乙醇溶液的点样量为100～500ul。
半夏总有机酸在制备治疗止咳化痰疾病的药中的应用。
半夏总有机酸在制备治疗消痞散结疾病的药中的应用。
半夏总有机酸在制备治疗抗肿瘤药中的应用通过半夏总有机酸的药效学研究的结果表明，半夏总有机酸具有止咳、抗炎、提高胃肠动力，抗肿瘤等作用，实验证明半夏药材中的总有机酸是起着止咳化痰、消痞散结作用的有效部位。在总有机酸中的有效成分主要包括琥珀酸、棕榈酸、N-乙酰谷氨酸、苹果酸等。
3、有益效果通过动物实验结果表明从半夏药材中提取的总有机酸具有明显的药理药效作用(1)止咳作用明显。用化学刺激，电刺激豚鼠气管粘膜，引发咳嗽，实验表明总有机酸可以使咳嗽次数减少，咳嗽潜伏期延长，抑制咳嗽引起的呼吸振幅坛高，降低咳嗽强度；(2)抗炎和抑菌作用，用二甲苯引发小鼠耳廓肿，实验表明总有机酸具有抑制小鼠耳廓肿的作用，体外抑菌实验表明，对乙型链球菌有一定的抑制作用，以二氧化硫引咳小鼠，测定咳嗽时炎性介质PGE2(前列腺素)的含量，表明半夏总有机酸高剂量组有降低PGE2含量的作用。
(3)对胃动素分泌有明显提高，具有促进胃动力作用；(4)对体外肿瘤细胞和小鼠实体瘤具有显著的抑制作用。
四具体实施方式
以下通过动物实验结果的实施例对本发明的有益效果作进一步的说明。
实施例1半夏总有机酸的提取方法(1)称取半夏生药材5Kg，磨成粗粉，过14目筛；(2)用10倍量的75％乙醇加热回流2次，每次1.5小时，减压回收乙醇至无乙醇味，得醇浸膏；(3)加入稀盐酸，调节PH至2.0，将该溶液以乙酸乙酯(按1∶3)进行萃取至萃取液无色，减压浓缩；(4)以5％的无水Na2CO3溶液萃取，合并碱液后以20％的盐酸酸化；(5)再用乙酸乙酯(按1∶3)萃取，直至萃取无色，并无有机酸反应，萃取液减压回收乙酸乙酯，得提取物浸膏；(6)将浸膏用95％乙醇溶解后，过滤，滤液减压回收乙醇，得半夏总有机酸提取物。
实施例2总有机酸成分的分离将总有机酸浸膏50g，硅胶120g拌样，湿法上柱，以石油醚∶乙酸乙酯按照不同的比例梯度洗脱，在石油谜∶乙酸乙酯20∶1的比例洗脱液经浓缩后静置结晶得到棕榈酸；在石油谜∶乙酸乙酯1∶1的比例洗脱液经浓缩后静置结晶并以甲醇重结晶得到琥珀酸；在石油谜∶乙酸乙酯1∶5的比例洗脱液经浓缩后静置结晶得到N-乙酰谷氨酸。另将半夏总有机酸浸膏1g溶解于乙醇溶液中，以硅胶G铺板，干燥后再置硝酸钾饱和溶液中的层析缸中饱和10小时，将有机酸溶液以条带点样300ul在硅胶板上，以苯∶乙酸乙酯∶乙醚∶甲酸6∶4∶2∶1.5的配比作为展开剂展开进行制备层析，层析完成后将层析板的大部分遮盖，露出部分以溴酚蓝显色，刮取硅胶板上溴酚蓝显色的每一个条带，各条带以无水乙醇回流提取，过滤，滤液减压浓缩成小体积后静置，在Rf值为0.3左右的条带得到颗粒状结晶经检测为苹果酸。
从半夏总有机酸中得到的4种有效成分，均经熔点、质谱、红外光谱，以及碳谱、氢谱分析并与对照品对照确定。
实施例3、半夏总有机酸对氨水和二氧化硫引发小鼠咳嗽次数及潜伏期的影响1.实验材料1.1样品，①半夏总有机酸浸膏，临用时配制成一定浓度的溶液。配制方法取浸膏适量，精密称定，置乳钵中，加入0.1ml吐温-80，充分研磨，再取10ml生理盐水分数次加入，边加边研，至充分研磨均匀为止。②咳必清。
1.2试剂，氨水、无水亚硫酸钠、硫酸。
1.3仪器，402超声雾化器1.4动物，ICR小鼠，雌雄各半18-22g，由南京中医药大学动物中心提供。
2.方法与结果小鼠40只，雌雄各半，体重20±2g，随机分4组，按表中剂量灌胃给药，给药组分别给予以1％的吐温-80配制的半夏总有机酸溶液，模型组给予同体积的1％的吐温-80溶液。30min后，将动物放入超声雾化器内，加入50ml氨水雾化20s致咳，观察小鼠咳嗽潜伏期及其3min内咳嗽次数。结果见表1。
另取小鼠40只，雌雄各半，体重20±2g，随机分4组，按表中剂量灌胃给药，给药组分别给予以1％的吐温-80配制的半夏总有机酸溶液，模型组给予同体积的1％的吐温-80溶液。30min后，在0.5g无水亚硫酸钠中加5ml 50％硫酸，用500ml烧杯罩住。30s后，将小鼠置于其中，观察2.5min，记录小鼠咳嗽次数和咳嗽潜伏期，结果见表2。
表1半夏总有机酸对氨水引咳小鼠咳嗽次数及潜伏期的影响(X±S，N＝10)
注与模型组相比，**P＜0.01，*P＜0.05表2半夏总有机酸对SO2引咳小鼠咳嗽次数及潜伏期的影响(X±S，n＝10)
注与模型组相比，**P＜0.01实验结果表明总有机酸低剂量、高剂量皆有降低咳嗽次数、延长咳嗽潜伏期的作用，止咳作用明显。与模型组相比，有显著性差异。
实施例4半夏总有机酸对电刺激引起豚鼠咳嗽强度的影响1.实验材料1.1样品，半夏总有机酸浸膏，临用时配制成给药的溶液。配制方法同上。
咳必清(江苏华朋制药厂)1.2试剂，乌拉坦(上海试剂三厂)1.3仪器，powerlab/8s八道生理记录仪(AD instrument)1.4动物豚鼠、雌雄各半270-330g，由南京中医药大学动物中心提供。
2.方法与结果豚鼠体重300g左右，雌雄各半，随机分组，用乌拉坦麻醉(25％，1g/kg)后，切开颈部皮肤，分离气管，插入Y型气管套管，一个支管连接一橡皮管，借助于Z字夹的调节，与压力换能器连接，通过记录仪记录呼吸运动；另一支管通气。用一白金制的单极电极固定于气管的背面，尽量靠近胸部，另一电极由缝针制成，插入胸部皮下组织。分离食管，插管给药用。按表中剂量灌胃给药，给药组分别给予以1％的吐温-80配制的半夏总有机酸溶液，模型组给予同体积的1％的吐温-80溶液。采用电刺激强度为3.5V，脉冲宽度50毫秒，频率10次/秒，刺激时间20秒，刺激的间隔时间为5分钟，观察1分钟。电刺激时，由于咳嗽可使呼吸振幅明显增高。给药后重复给予电刺激，比较呼吸振幅的变化，实验结果见表3。作用强度以抑制百分率表示。抑制率＝(1-给药后呼吸强度均值/给药前呼吸强度均值)×100％表3半夏总有机酸对电刺激造成豚鼠咳嗽强度的影响(X±S，N＝5)
注与模型组比，**P＜0.01，*P＜0.05实验结果表明总有机酸组的咳嗽强度与模型组相比有显著差异；对电刺激引起的咳嗽有抑制作用，抑制咳嗽引起的呼吸振幅增高，降低咳嗽强度。
总之，实验表明半夏总有机酸部位对动物的咳嗽模型具有明显止咳作用，无论是由氨水、二氧化硫等化学刺激、还是电刺激气管粘膜引起的咳嗽模型，总有机酸都显示明显的抑制作用。表明总有机酸是半夏止咳作用的有效部位。
实施例5、半夏总有机酸的抗炎和抑菌作用由于咳嗽时通常伴有炎症的产生，所以本部分工作通过小鼠耳廓肿实验、对腹腔注射醋酸(HAC)所致小鼠腹腔毛细血管通透性增高的影响、对体外培养细菌的作用等实验考察半夏总有机酸在抗炎、抑菌方面的作用。通过对二氧化硫引咳小鼠，咳嗽发生时炎性介质PGE2(前列腺素)、His(组胺)释放量的影响，比较半夏总有机酸对伴随咳嗽产生的炎症的作用。
(一)小鼠耳廓肿胀实验1、实验材料1.1样品，半夏总有机酸浸膏，临用时配制成给药的溶液.配制方法同上。阿司匹林(南京恒生制药厂)1.2试剂，二甲苯(南京化学试剂厂)1.3仪器，电子秤(SartoriousBP211D)、打孔器1.4动物ICR小鼠，雌雄各半18-22g，由南京中医药大学动物中心提供。
2、方法与结果小鼠40只，雌雄各半，体重20±2g，随机分组，按表中剂量给药，给药组分别给予以1％的吐温-80配制的半夏总有酸溶液，模型组给予同体积的1％的吐温-80溶液。给药后1h于小鼠右耳涂抹二甲苯0.1ml，1h后剪下两耳，用1cm打孔器在对应部位打成圆孔，即时称重，算出肿胀度。肿胀度＝(右耳重量-左耳重量)/左耳重量×100％。结果见表4。
表4半夏总有机酸对小鼠耳廓肿的影响(X±S，n＝10)
注与模型组相比，**P＜0.01，*P＜0.05实验结果表明；总有机酸给药小鼠耳廓肿胀度与模型组相比，有明显差异，具有抑制二甲苯引起的小鼠耳廓肿胀作用，总有机酸高剂量组有非常显著差异。
实施例6、半夏总有机酸对胃肠道消化系统的影响(一)对大鼠胃肠道激素的影响1实验材料1.1样品，半夏总有机酸浸膏-，临用时配制成给药的溶液。配制方法同上。
琥乙红霉素(石家庄制药有限公司)1.2试剂，胃动素试剂盒(北京福瑞生物工程公司)、EDTA(江苏省人民医院提供)1.3动物，SD大鼠，雌雄各半130-170g，由南京中医药大学动物中心提供。
2方法与结果SD大鼠40只，雌雄各半，体重150±20g。随机分为6组，实验前禁食12小时，给药组分别给予以1％的吐温-80配制的半夏总有机酸溶液，对照组给予同体积的1％的吐温-80溶液。给药体积为10ml/kg，灌胃给药后1小时，眼眶取血2ml，EDTA抗凝。将血液1000rpm离心10分钟，取上清液按放免试剂盒说明书的操作方法进行检测。胃动素标准工作曲线为Y＝-1.79591X+4851.667(r＝1)结果见表5。
表5半夏总有机酸对大鼠胃动素的影响(X±S，n＝10)
注同对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01实验结果表明半夏总有机酸与对照组相比，有显著性差异，总有机酸对胃动素分泌有明显提高，具有促进胃动力作用。
实施例7、半夏总有机酸的抗肿瘤作用本实验通过体外培养的肿瘤细胞生长作用的影响，以及对荷瘤小鼠肿瘤生长的影响等实验，从离体和在体两方面考察半夏总有机酸的抗肿瘤作用。
(一)半夏总有机酸对体外培养的肿瘤细胞生长的影响1、实验材料1.1药品，半夏总有机酸(以1％的吐温-80配制的半夏总有机酸溶液，过滤除菌，4℃遮光保存。)1.2试剂，胰酶(Amresco 2430B18)、小牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)、RPMI1640(Gibco BRL 107551)、MTT(sigmachemicalco.99H0519)、DMSO(扬中县化剂厂)1.3仪器，DG5031酶标仪(华东电子管厂医疗电子仪器厂)1.4细胞，人胃癌细胞BGC823(上海生化所提供)2、方法与结果体外培养BGC823细胞4-5天，加入0.25％胰酶，使贴壁细胞脱落。用10ml含5％小牛血清的RPMI 1640培养液配成悬液，计数板记数(约104)。以完全培养基稀释细胞悬液，配成106个/ml。取96孔板，每孔加细胞悬液200ul，培养24h后(37℃5％CO2)，待细胞贴壁后每孔加药200ul，继续培养24h，吸出药液加MTT液20ul，培养4h后，吸出MTT液，加DMSO150ul，在酶标仪下490nm处读OD值。细胞存活率＝给药组OD值/对照组OD值，结果见表6。
(2)年龄在18岁以下或65风以上患者，妊娠或哺乳妇女，对本药过敏者。
(3)不合作者(指不能配合饮食控制或不按规定用药而影响疗效者)。
(4)有严重心、肝、肾等并发症，或合并有其它严重原发性疾病，精神病患者。
(5)近1个月内有糖尿病酮症，酮症酸中毒以及感染者。
(6)未满规定观察期而中断治疗，无法判断疗效或资料不全者。
(七)试验方法1、根据健字号药的要求，本组35例患者均在原饮食控制及口服降糖药的基础上，加服本发明药物胶囊(主要成份黄氏、知母、地黄、麦冬、天花粉、五味子、山药、黄精、葛根、乌梅)。
2、服用量服用胶囊每次4粒，每日2次。
3、疗程一个月。
(八)观察项目、证候空腹血糖、餐后2小时血糖、血常规、尿常规、酮体、心电图、肝功、肾功能等测定。临床症状变化采用记分法其中口渴喜饮6分、多食善饮5分、怕热心烦3分、倦怠乏力3分、自汗盗汗3分，气短懒言3分、心悸失眠3分、溲赤便秘3分、舌红少苔或黄2分，脉弦数或细数2分(九)疗效判定1、显效治疗后症候积分下降≥2/3，空腹血糖＜7.2mmol/L(130mg/dl)，餐后2小时血糖＜8.3mmol/L(150Mg/dl)，24小时尿糖定量＜10.0g；或血糖、24小时尿糖定量较治疗前下降30％以上。
2、有效治疗后症候积分下降≥1/3，空腹血糖＜8.3mmol/L(150mg/dl)，餐后2小时血糖＜10.0mmol/L(180mg/dl)，24小时尿糖定量＜25.0g；或血糖、24小时尿糖定量较治疗前下降10％以上。
3、无效治疗后症状无明显改善，血糖尿糖下降未达上述指标。
(十)治疗结果与分析1、降糖疗效本组35例均为服药一个疗程(一个月)，降低空腹血糖、餐后2小时血糖、24h尿糖定量疗效见表8表8 35例患者治疗前后血糖、尿糖变化
表7半夏总有机酸对S180荷瘤小鼠肉瘤生长的抑制作用(X±S，n＝10)
注**P＜0.01实验结果表明半夏总有机酸组与模型组相比，实体瘤重具有非常显著性差异，高剂量组达到63.88％的抑制率，说明总有机酸对实体瘤生长有显著抑制作用。
权利要求
1.一种半夏总有机酸，其特征在于它包括琥珀酸、棕榈酸、N-乙酰谷氨酸、苹果酸有效成分。
2.一种提取权利要求
1总有机酸的方法，其步骤如下(1)称取半夏生药材，粉碎成粗粉；(2)用乙醇提取，减压回收乙醇，得醇浸膏；(3)加入稀盐酸，调节PH值，将该溶液用乙酸乙酯进行萃取至萃取液无色后，进行减压浓缩；(4)再用稀碱溶液萃取，合并碱液后，用稀酸酸化；(5)然后用乙酸乙酯萃取，直至乙酸乙酯萃取液无色，并无有机酸反应，萃取液减压回收乙酸乙酯，得提取物浸膏；(6)将浸膏用乙醇溶解后，过滤，滤液减压回收乙醇，得半夏总有机酸提取物。
3.根据权利要求
2所述的提取总有机酸的方法，其特征是步骤(1)中半夏生药材粗粉为10-40目。
4.根据权利要求
2所述的提取总有机酸的方法，其特征是步骤(2)所用的乙醇浓度为60-95％，乙醇用量为8-15倍，提取方法为渗漉或加热回流。
5.根据权利要求
2所述的提取总有机酸的方法，其特征是步骤(3)中的PH值为1.0-3.0。
6.根据权利要求
2所述的提取总有机酸的方法，其特征是步骤(4)中的稀碱溶液包括Na2CO3、NaOH、NaHCO3，碱液浓度为3-5％；稀酸包括HCl、H2SO4、其浓度为10-30％。
7.如权利要求
1的半夏总有机酸在制备治疗止咳化痰疾病的药中的应用。
8.如权利要求
1的半夏总有机酸在制备治疗消痞散结疾病的药中的应用。
9.如权利要求
1的半夏总有机酸在制备治疗抗肿瘤药中的应用。
专利摘要
本发明公开了一种从中药材半夏中提取出起止咳化痰、消痞散结作用的总有机酸部位，并又从总有机酸中分离得到琥珀酸、棕榈酸、N-乙酰谷氨酸、苹果酸四种有效成分。其提取方法是将半夏药材粉碎成粗粉，用乙醇提取后，先后用乙酸乙酯、碱液、乙酸乙酯萃取，减压浓缩得浸膏，再用乙醇溶解浸膏后过滤，减压回收乙醇，得总有机酸浸膏。再将浸膏与硅胶拌样，湿法上柱，经石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱后而得到琥珀酸、棕榈酸、N-乙酰谷氨酸，经制备层析得苹果酸等四种有效成分。实验结果表明，总有机酸具有显著的止咳化痰、抗炎抑菌、促进胃动力和抑制肿瘤细胞生长等作用。
文档编号C07B63/00GKCN1283599SQ200310106459
公开日2006年11月8日 申请日期2003年11月28日
发明者吴皓, 李伟, 何凌云, 王媚, 池玉梅, 张科卫, 许凤清 申请人:南京中医药大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan