专利名称：一种水母雪莲高产黄酮细胞系的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种水母雪莲高产黄酮细胞系。
水母雪莲(Saussurea medussa Maxim)为我国传统中药材，民间用于治疗风湿性关节炎、妇女月经不调、胎衣不下等。临床上还应用于治疗动脉硬化等。雪莲含多种有效成分，其中主要为黄酮类化合物。此外，雪莲还可用于化妆品等。但是由于水母雪莲生长在海拔4000米以上的高山雪线附近，故引种栽培至今尚未成功，目前仍采用采挖野生雪莲提取黄酮类化合物，该方法缺点在于(1)水母雪莲为多年生草本植物，自然生长缓慢，采集野生雪莲入药对野生资源具有严重的破坏性，而且还破坏生态环境。为此，水母雪莲早已被列为国家三级保护植物。(2)野生雪莲中有效成分黄酮类化合物含量低，通常只有干重的0.9％左右。
本发明的目的在于针对上述问题和存在缺陷，提出一种水母雪莲高产黄酮细胞系的筛选及悬浮和固体培养生产方法，该方法采用植物细胞大规模培养技术，实现工业化生产黄酮类化合物。
本发明人通过对雪莲进行组织培养得到了三种水母雪莲高产黄酮细胞系，黄色系，红色系，和白色系。将红色系命名为A-2，并在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(中国，北京，中关村，邮政编码100080，电话010-62555614)进行了保藏，保藏日为2000年8月30日，保藏号为CGMCC No.0484.2，分类命名为水母雪莲(Saussureamedusa)(A-2)。
实验证明在悬浮或固体培养下，用本发明提供的A-2系和培养基，其细胞生长速率可达35-40g干重/升/月，黄酮类化合物的含量可达培养物干重的6-7％。表1水母雪莲细胞A-2系(红色系)与黄色系、白色系及天然植株类黄酮含量及特征性的比较培养物 细胞生产量 黄酮产量 黄酮含量(细胞干重，g/L)(mg/L) (％)a天然植株0.60白色系 18.8±1.38 146.1 0.76黄色系 21.4±1.46 1399.6 6.90红色系 22.3±1.35 1364.7 6.23a％愈伤组织干重表2水母雪莲细胞A-1(黄色系)与红色系、白色系愈伤组织特征性的比较愈伤组织系 特征白色系 结构松软，色泽淡白，水渍状，生长快，培养后期出现轻微褐化黄色系 培养前期结构松散，生长快；培养后期结构略致密，质地略硬本系有时黄色与绿色互变，黄酮形成的最高峰在培养的第10-20d红色系 培养前期结构较松散，生长快；培养后期结构较致密，质地较硬本发明较已有技术相比具有如下优点及积极效果(1)雪莲为国家保护植物，利用植物细胞大量培养生产雪莲黄酮化合物，走工业化生产的途径，可有限地保护野生资源，保护生态环境。
(2)应用细胞大量培养生物合成黄酮类化合物，可获得稳定的质量和产量，不受自然条件的限制的影响。
(3)只需要占用有限的厂房和培养室。
(4)通过人工调节与控制细胞的生长和次生产物的合成；可极大地提高黄酮类化合物的产量(5)该项技术，不使用生物反应器进行工业化生产，故可免去购置生物反应器的昂贵投资。一次投资量小，产量与含量稳定，污染率极底。
实施例1.水母雪莲细胞系的制取A.采集水母雪莲的外植体(如叶、花、径)诱导愈伤组织，外植体先用自来水冲洗数小时，然后用多种杀菌剂侵泡杀菌，用无菌水洗5-6次，每次2-3min，消毒后接种于带有不同种类及不同浓度的植物激素组合的1/2MS培养基上，放置于25±10℃，光照培养。经二周培养后，即可在外指体的切口部位形成愈伤组织。B.愈伤组织在MS培养基上继代培养(最佳25±1℃，光照培养)，每15d转代一次，用目视法反复筛选，反复继代培养可获得A-2细胞系(红色系)。经60Co照射后得高产细胞系，保存及继代每15d一次。2、利用水母雪莲细胞悬浮和固体二步培养生产黄酮类化合物的方法(A)将上述的A-2细胞系接种于下述MG生长培养基中，接种量为30-60g.fw/L；接种后放入光照培养室中培养12-14d，温度为20-25℃；(B)将(A)中得到的细胞系转接至下述MP生产培养基中，接种量为和培养室条件同(A)项；培养13-15d后，获得黄酮类化合物；(C)将(B)中得到的培养物送入60℃的烘箱中烘干，用粉碎机粉碎成20目的粗粉，用70％乙醇提取，提取液用于总黄酮的测定或金合欢素和高车前素二种黄酮的定量定性分析。3、雪莲细胞悬浮和固体二步培养生产工艺流程(A)按本发明MG生长培养基的配方组成，配制生长培养基。用pH计测定pH值，并用1N的HCI及1N的KOH调节培养基pH值在5.2～5.8范围内。加入0.7-1％琼脂(液体培养基不用加)，沸腾后分装至50ml三角瓶内，每瓶20ml。用封口膜封口后，进行高压消毒，压力为1.0～1.2kg/cm2，时间为15～20分钟。(B)将经过继代培养获得的A-2细胞系，在超静工作台中接种于上述生长培养基中，接种量为30-60g.fw/l。将接种后的培养瓶放入光照培养室中培养13-14d.温度为20-25℃。(C)按(A)项所述的程序，按本专利申请MP生产培养基的配方组成，配制生产培养基。将(B)项在生长培养基上生长12-13d的愈伤组织，在超静工作台中转接至生产培养基中，接种量为30-60g鲜重/L，培养条件同(B)项。培养13-15后，用不锈钢勺将培养物全部取出，放入塘制瓷盘内，送入60℃的烘箱中烘干或直接用新鲜的愈伤组织侵泡于70％酒精中，进行下述第4项的黄酮类化合物的分离提取。4、雪莲黄酮类化合物的分离提取工艺取雪莲细胞培养物于空气循环干燥器60℃烘干后，以粉碎机粉碎成20目的粗粉20目的粗粉，用70％乙醇提取，或直接用新鲜的愈伤组织侵泡于70％酒精中，进行总黄酮类的提取。表3.MS、MG、MP三种培养基成分组成MS MP MGmg/Lmg/Lmg/LNH4NO31,650 800 800KNO31,900 10001000KH2PO4170 170 340MgSO4·7H2O 370 370 370CaCl2·2H2O 440 220 110FeSO4·7H2O 27.85 13.727.85Na2-EDTA 37.25 18.537.25MnSO4·4H2O 22.322.311.5ZnSO4·7H2O 8.610 --H3BO36.26.2 6.2KI 0.83 -- --NaMoO4·2H2O 0.25 0.250.25CuSO4·5H2O 0.025 0.2 0.1CoCl2·6H2O 0.025 -- 0.013蔗糖30,000 45,000 30,000葡萄糖 ---15,000 10,000甘氨酸 2 1 1硫胺素·HCl 0.40.4 0.4烟酸0.50.5 -肌醇100100 100pH 5.85.8 5.8注1、MP(生产培养基)、MG(生长培养基)是从MS培养基修饰得到的。
权利要求
1.一种水母雪莲高产黄酮细胞系，其保藏号为CGMCC0484.2。
全文摘要
本发明提供了一种水母雪莲高产黄酮细胞系,其保藏号为CGMCC0484.1。用本发明提供的A-2系和培养基,其细胞生长速率可达35－40g干重/升/月,黄酮类化合物的含量可达培养物干重的6-7%。
文档编号C12N5/04GK1340611SQ00123740
公开日2002年3月20日 申请日期2000年9月1日 优先权日2000年9月1日
发明者赵德修, 邢建民, 叶和春, 李茂寅, 赵敬芳, 吕东平 申请人:中国科学院植物研究所