专利名称：：防治土壤害虫的组合物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及防治土壤害虫，特别是有害昆虫的改进组合物，所述组合物含有生物防治剂。在全球许多种主要作物中，如根蠕虫，切根虫，根蝇和线虫的土壤害虫会造成其产量的严重下降。在一些情况下，凭借化学农药会得到令人满意的防治效果，但是防治土壤害虫的很多种主要产品受到有关当局限制或撤销的威胁。因此，开发防治土壤害虫的生物防治剂是所期望的目标。在开发生物防治剂的过程中，要克服的最明显的技术障碍可能是制剂。基于苏云金杆菌的产品除外，现存的大多数的生物防治剂都不能满足效果，残效期和低造价的要求(Rhodes，1990，AspectsofAppliedBiology24145-153)。将真菌用于土壤害虫防治的情况下更如此。到目前为止，只得到非常少的上述产品，通常在田间作过测试的制剂是基于简单的半固体发酵方法，如施用在谷粒上的菌落(Keller&Zimmermann，1989，239-270页，inWildingetal.Insect-FungusInteractions.AcademicPress，London)，可选择地，如Andersch等人，在1990.EP87116-508中所述的方法，使真菌在液体培养物中生长成为菌丝团，然后脱水并施用到土壤中，类似的方法，如Krueger&Roberts所述，使用菌丝碎片(SocietyforInvertebratePathologyAnnualMeeting，1988，使用WO84/01089中所述的技术)。将生物量的真菌在液体培养物中液面下发酵是较理想的，这是因为这种生产方法适合于现存的工业生产，且生产的费用相对低。当在液体培养物中生长时，许多昆虫致病真菌，如白僵菌属(Beauveria)，轮枝菌属(Verticillium)，蛾霉菌属(Nomuraea)，Tolypocladium属，拟青霉菌属(Paecilomyces)(Bartlett&Jaronski，1988.Pp.61-85inBurge.FungiinBiologicalControlSystems.ManchesterUniversityPress.Manchester)和绿僵菌属(Metarnizium)(Andersch，1992.Pflanzenschutz-NachrictenBayer45129-142)会产生酵母状的芽生孢子。令人遗憾的是，这些孢子结构精细，并难于配制(Andersch，VideSupra)。有关成功地配制芽生孢子的描述并不多。Blachere等人，1973。在AnnZool.Ecol.anim.569-79中描述了一种通过在二氧化硅上干燥保存卵孢白僵菌(Beauveriatenella)芽生孢子的方法，但是其中不含有刺激真菌在土壤中生长的营养物，结果所得的粉末状物质不适于以颗粒状向土壤施用。另外，此干燥方法(在通风炉中干燥5至36小时)以工业规模生产是不实用的。Fargues等人1979，Ann.Zool.Ecol.Anim.11247-257试图配制的白僵菌的芽生孢子。尽管在冷冻条件下上述制剂可保持八个月的活力，可是即使在5℃下贮藏，该物质在五个月内即失效。Fargues等人，1983.J.Invert.Pathol.41，131-142探讨了某些粘土的性质对芽生孢子在土壤中活性扩展的影响。可是，根据这些并不能生产出农用制剂。Ward，1984.Pp.175-184inScher.AdvancesinPesticideFormulationTechnology.ACS.WashingtonDC.间接提到了选择特殊的粘土配制昆虫致病真菌的繁殖体。曾经被描述过的施用到土壤的真菌制剂是用于害虫防治目的外的，非芽生孢子形成的真菌的情况。例如Lewis&Papavizas，1987，PlantPathology36438-446描述的，通过藻酸盐包囊的方法将木霉属(Trichoderma)和胶霉属(Gliocladium)的真菌混入颗粒剂中。Knudsen&Lin，1990.Phytopathology80724-727把营养物质混入到这些类似的真菌制剂中，加入营养物质会增加颗粒位点上菌丝的密度，但不能增加菌丝在土壤中扩展的距离。由此可见，本发明的与土壤害虫致病真菌的芽生孢子混合的并能使真菌在土壤中生长并繁殖的的农用制剂对上述害虫的生物防治具有相当大的价值。因此本发明提供了一种颗粒组合物，其中包含以芽生孢子形式存在的，杀虫活性量的真菌生物防治剂。除了芽生孢子之外，上述真菌芽生孢子的颗粒剂还包含选自菌丝体断片，固体稀释剂或支持物(本文下述称为“填料”)和施用后使真菌生长和繁殖的复合营养源的其它成分。另外，颗粒剂可含有其它物质如防腐剂，抗氧剂，铒料或引诱剂，和渗透调节剂。真菌接种物的生产是用活的繁殖体接种到如Sabouraud’s葡萄糖肉汤液体培养基上，繁殖体由如白僵菌属，绿僵菌属，拟青霉菌属，蛾霉属，Tolypocladium属，多毛菌属或轮枝菌属中的一种真菌的分生孢子，芽生孢子或菌丝体组成。培养基被放在如烧瓶或发酵桶的容器中。然后在适合真菌生长的条件下使培养物生长几天，接着通过离心或过滤收集生物量的，由芽生孢子和菌丝断片混合物组成的真菌。从制备物中还可以除去水，例如加压除水。填料例如可以是矿物土如高岭土(陶土)，蒙脱石，硅藻土，硅石，漂土，等等。在组合物中使用的营养物质可以是细的植物粉，如以下实施例6中所例示的。营养物质的选择将根据在组合物中使用的真菌生物防治剂而变化。填料和营养物可按所需比例一起混合，例如通过搅拌混合，而且它们还可与生物量的真菌混合。搅拌所得混合物直到获得均匀的混合物。将水，优选去离子水加入混合物直到其稠度适合于挤出产物。然后在压力下挤出糊状物以形成颗粒。颗粒可以是球状体。颗粒干燥后，例如在流动床或强气流下干燥后，接着可在室温下贮藏直到应用，例如在真空下，在氮气条件下，或在如硅胶的干燥剂存在下贮存。可将颗粒剂施用到土壤，或植物表面如玉米植株的轮生叶，此后在孢子形成前真菌借助菌丝的扩展生长，以增加真菌与敏感宿主相遇的可能性。本发明的另一方面是提供了一种防治对真菌生物防治剂敏感的土壤寄居害虫的方法，其中包含向土壤施用根据本发明的颗粒组合物。实施例1使用灭菌接种环，用事先已显示出对黄瓜条叶甲(Diabroticabalteata)致病性的昆虫致病真菌球孢白僵菌(Beauveriabassiana)菌株的分生孢子对盛于250ml锥形瓶中的50mlSabouraud’s葡萄糖肉汤接种。接锥形瓶放在开到200rpm的旋转振荡器上，在24℃的温度下振荡7天然后培养由芽生孢子和菌丝体断片组成的混合物，其中含有大约95％的芽生孢子。在SorvallRC3C摇桶式旋转器上以5000rpm，将生物量真菌离心10分钟，然后在消毒蒸馏水中再次悬浮并再次离心两次，在几层手纸之间挤压片状沉淀物以除去过量的液体，使最终的含水量为75-85％。在杵和研罐中，以14∶5的重量比混合以制备由GTY粉(高岭土)和Fulgel(漂土)组成的粘土混合物。然后以83∶17的重量比将其与芽生孢子/菌丝体的断片的混合物一起研磨。以大约1∶5的重量比向混合物中加入去离子水，直到糊状物的稠度适合挤出。加压通过0.5mm的Endecoot筛挤出糊状物。所得颗粒是球状的，并在室温下在流动床上使之干燥25分钟，然后将其贮藏在存有硅胶的真空包封的干燥器中。颗粒活力的测定是通过在0.05％Tween80中使颗粒均浆，并悬浮放置于含有0.05g/l氯霉素的Sabouraud’s葡萄糖琼脂上。令人惊奇地是，发现颗粒干燥后仍保持活力，回收了2×107群落形成单元(cfu)/g。Tween80是含有聚氧乙烯(20)脱水山梨醇单油酸酯的表面活性剂的注册商标。实施例2如上所述通过使真菌在含有500ml培养肉汤的1升锥形瓶中生长六天而生产生物量的真菌。如实施例1中所述制备颗粒，只是在制造挤出糊状物之前，通过以重量比50∶33∶17粘土混合物∶营养物∶生物量真菌混合粘土混合物和生物量真菌与营养物提供营养源。在通风橱中将颗粒风干大约16小时。土壤菌落是通过在田间容量的松盖的通用塑料容器中将1g干燥颗粒放置在两层5g田间土壤中间而测定的。在24℃培育18天后测量从颗粒层的径向生长，并且测评价孢子的形成。营养源特别是大豆粉的存在能够促进生长和孢子的形成。实施例3如实施例2所述的制备挤出颗粒，其含有或不含营养物(33％豆粉)并含有按重量计浓度为1.7％，10％或17％的菌丝断片或芽生孢子。如实施例1中所述生产主要由芽生孢子组成的接种物。通过使真菌在同样的培养基和同样的温度下生长，但不振荡而生产主要由菌丝体组成的接种物。然后用去离子水冲洗菌丝体，在用Whatman1号滤纸过滤收集之前，均浆生成菌丝断片。以按重量计1％或3％的剂量，向在塑料小盆中的土壤加入颗粒。土壤湿度调为23％。向8个盆中的每一盆播种一棵发芽的玉米种子，并同时用10个一龄的黄瓜条叶甲或玉米根叶甲(Dvirgifera)幼虫侵染。将盆在20℃下保持10天，然后评价幼虫的死亡率。结果示于表2，表明向颗粒中加入营养源后，会增加所有种的死亡率，此次试验加入的是大豆粉。菌丝用Hy表示，芽生孢子用Bs表示。实施例4如实施例2中所述的生产主要由芽生孢子组成的接种物，除了真菌是生长在含有400ml培养基的1升烧杯中。接种物生长4天或7天。如实施例2中所述制备挤压颗粒，挤压后将颗粒在20℃的流化床干燥器上干燥8至30分钟，若是最终水分含量＜3％的颗粒，则需要在20℃下干燥16分钟并在30℃下干燥15分钟。测定颗粒的水分含量，然后将颗粒真空包封在袋中并在实验室温度(20-25℃)下贮藏六个月。结果示于表3。尽管真空包封后仍发现在实验的末期颗粒的水分含量已发生了变化，但很显然干燥颗粒能够提高贮藏稳定性。有一些证据证明，对于干燥的颗粒生长7天的真菌比生长4天的真菌增加了稳定性。实施例5如实施例4所述制备挤压颗粒，其中含有按重量计33％的大豆粉，17％生物量真菌(生长3天)，45％的填料(GTY，CalfloE，CelitePF或Celite500)和5％粘着剂(Fulgel，Borrebond或PEG40000)。不含粘着剂的颗粒含有按重量计50％的填料。将颗粒风干，然后如实施例3所述对黄瓜条叶甲进行生测，不同之处是以1％的重量比将颗粒混入土壤，并且在侵染7天后测定死亡率。在土壤中真菌的种群，用cfu/g表示，它是通过在Doberski和Tribe，1980，TransactionsoftheBritishMycologicalSociety74，95-100的选择培养基上辅覆土壤悬浮液的稀释液而测定的。结果示于表4。由于各种填料/粘着剂混合物具有类似的作用，由此可推断出，根据颗粒所需的物理性质，各种填料和粘着剂可被代替。CalfloE，CelitePF和Celite500是从Celite(UK)Limited，LivingtouRoad，HassleNorthHumbersideHu13OEG得到的填料粉末产品的商品名。实施例6如实施例5中所述制备颗粒，以下述比例将营养物与颗粒的其它成分混合33％营养物，17％生物量真菌，45％GTY，5％Fulgel。测定了下述营养源葵花籽粉，杏仁粉，绿豆粉，蔬菜蛋白质组织(TVP)粉，大麦片粉，苹果和香蕉烤谷糠粉，黑麦粉，大豆粉，麦芽和Hijiki海藻粉。干燥后，如实施例3中所述，用黄瓜条叶甲对颗粒进行生物测定。在盆中以土壤量的1％和0.5％加入颗粒，7天后测定死亡率，加入0.1％颗粒的处理，在12天后测定死亡率。如实施例5中所述在作评价时，对真菌的繁殖体计数。将颗粒在实验室温度下在部分真空条件下保存10个月，以研究贮藏稳定性。结果示于表5和表6。从上述结果可以清楚地发现营养源不同其作用效果和颗粒的贮藏稳定性就不同。从效果残效期的结合来看最好的营养源是葵花籽粉，杏仁粉和大豆粉。实施例7如实施例2中所述制备颗粒。在挤压之前以按重量计33％的浓度将营养源加入到混合物中。测试的营养源是荞麦粉，西谷粉，aduki豆粉，大麦片粉，鹰嘴豆粉，葵花籽粉，杏仁粉，黑米粉，角豆，细麦麸，全代蛋粉和全麦粗面粉。干燥后，通用塑料容器中，将1g的颗粒放在两层5g的土壤中，调至田间容积(fieldcapacity)。在20℃培育31天后透过容器的透明壁评价径向生长和孢子形成。根据0至4的设定标准目测评价孢子的形成。应用五种不同的土壤源评价不同土壤类型范围的颗粒支持真菌生长和孢子形成的能力。结果示于表7。上述证明，为了使真菌在土壤中生长和形成孢子需要营养源。与其它供试的材料相比，葵花籽粉和杏仁粉明显地优越。实施例8根据实施例5中的方法制备颗粒，不同之处是如下所述进行的变化，在挤压混合物之前使生物量真菌生长四天。颗粒含按重量计17％生物量真菌，33％的营养源(大豆粉或葵花籽粉)。加入浓度为5％的其它成分(PEG4000(分子量4000的聚乙二醇)和植物油，如豆油，玉米油或花生油)，剩余部分由GTY粉组成。将颗粒在实验室温度下，在真空包封的干燥器中，贮藏12个月。贮藏后0，1，4，8和12个月测定活力。结果示于表8。在贮藏期间采用葵花籽粉制备的颗粒比用豆粉制备的颗粒稳定。加入1％的葵花籽油，玉米油，花生油，或PEG会提高用豆粉制备的颗粒稳定性。12个月后，如实施例3中所述，用黄瓜条叶甲对颗粒进行生物测定。将按重量计0.5％和1％的颗粒混入土壤中，分别在9天和8天后评价死亡率。结果示于表9。试验证明在12个月的贮藏期结束时，所有的颗粒都保持一定的活性，采用葵花籽粉，大豆粉＋PEG，和大豆粉＋花生油的颗粒在试验中活性最高。实施例9如实施例5中所述制备颗粒，不同的是生物量真菌生长五天，并且颗粒含17％生物量真菌，33％葵花籽粉，和50％GTY/Fulgel。用未过筛的田间土壤(WisboroughGreen淤泥肥土)填充二个大聚丙烯鱼池，在鱼池的底部铺上一层粗砂和冲洗过的白砂以帮助排水。在每个池中耕出两道大约8cm宽，6cm深，90cm长并间隔75cm的犁沟，在每个犁沟的底部播种二十颗甜玉米(品种Earliking)的种子。在未处理池中将从犁沟中移去的土直接放回，而在处理的池中每犁沟土与1.93g颗粒混合后放回，在与种子直接接触土壤层中颗粒的浓度最大。在实验过程中湿度保持在15-20％，播种一周后，每垄的幼苗数减至11。播种二周后在每池土壤的28个凹陷处每个放入5只新孵化的黄瓜条叶甲幼虫。一周后，如上述再向土中放入70只幼虫。播种后38天，测定植珠的高度，并从每个池子中移出土壤样品。将土壤样品暴露在60℃的温度下18小时使菌丝和芽生孢子失活以确定孢子数。从14次重量样品中计算孢子数，然后如实施例5中所述通过稀释涂覆而测定。从土壤中移出植物，根据1-10的标准评价根损伤，10为损伤最严重。移出植物后，用聚乙烯膜覆盖土壤，以使其中包含的黄瓜条叶甲的成虫在17天内羽化。将这些计算在内并记录下所有症状。结果示于表10。上述证实了，当用商业上可接受的剂量向田间土壤中施用本颗粒时，本颗粒会导致真菌在土壤中建有效的种群，并在几周内保持该种群。实施例10如实施例5中所述制备颗粒，但有如下述的改变。真菌接种物生长两或七天。在混合前，将生物量的真菌在去离子水，6摩尔山梨醇，40％W/V的PET4000，或甘露糖醇和氯化镁的混合物(每升去离子水中分别为74g和27g)浸泡两小时；在去离子水中冲洗四次共20分钟，并与含有大豆粉的颗粒混合。可直接配制不含有营养源的颗粒，这种颗粒不需要与渗透调节剂接触。将颗粒样品在实验室温度下在干燥器中真空贮藏0、1、6和12个月。结果示于表11。可见当培养两天的生物量真菌与大豆粉一起配制时的差的贮藏稳定性，可通过在配制制剂之前用渗透调节剂处理生物量的真菌，或通过延长以获时间而克服。实施例11如实施例5中所述制备颗粒。在制备颗粒之前可用防腐剂抗坏血酸(0.5％)，生育酚(0.026％)或BHA/BHT(丁基化的羟基苯甲醚和丁基化的羟基甲苯1∶1的混合物(0.014％))改良豆粉的半成品。干燥后，或是将颗粒贮藏在真空包封的袋中或是贮藏在真空条件下硅胶存在的干燥器中。如实施例3中所述，制备后马上和在实验室温度下贮藏六个月后用黄瓜条叶甲对颗粒进行生物测定。加入的颗粒是土壤量的0.5％，并在土壤中培育三天使得在加入幼虫前真菌生长和孢子形成。侵染七天后评价死亡率。结果示于表12。可见，加入防腐剂BHA/BHT可提高且最适条件下的贮藏稳定性。表1</tables>表2表3表4对照死亡率8％表5<p>表6表7Champ.＝淤泥肥土Champaign，IL，USAPTM＝砂质肥土PearTreeMeadow，Jealott’sHill，Berkshire，UKEA＝砂质肥土EastAngliaFieldStation，Mildenhall，Suffolk，UKPent＝砂质肥土PenfurzenField，Jealott’sHill，Berkshire，UKPeat＝市售泥炭堆肥RG=径向生长(mm)Sp.＝孢子形成0＝孢子形成，4＝大量孢子形成表8表9对照死亡率(混入0.5％)＝0％对照死亡率(混入1.0％)＝5％表10表11表12在0月对照死亡率8％，在六个月6％权利要求1.一种颗粒组合物，其中包含杀虫活性量的真菌生物防治剂，所述防治剂以芽生孢子的形式存在。2.根据权利要求1的颗粒组合物可选择地包含一种或多种其它成分，该成分选自真菌生物防治剂的菌丝体断片，固体稀释剂或支持物和吱持真菌生长和孢子形成的复合营养源。3.根据权利要求2的颗粒组合物另外还可含有选自防腐剂，抗氧剂，铒料或引诱剂和渗透调节剂的一或多种其它成分。4.根据权利要求1的颗粒组合物，其中真菌生物防治剂是昆虫病原体。5.根据权利要求4的颗粒组合物，其中昆虫病原体选自白僵菌属(Beauveria)，轮枝菌属(Verticillium)，蛾霉菌属(Nomuraea)，多毛菌属(Hirsutella)，Tolypocladium属，拟青霉菌属(Paecilomyces)和绿僵菌属(Metarhizium)。6.根据权利要求5的颗粒组合物，其中昆虫致病菌是球孢白僵菌(Beauveriabassiana)。7.防治对真菌生物防治剂的作用敏感的土生有害昆虫的方法，其中包含向害虫存在或预期存在的土壤中施用根据权利要求1的颗粒组合物。8.根据权利要求7的方法，其中真菌生物防治剂是球孢白僵菌。9.根据权利要求8的方法，其中的害虫是叶甲属(Diabroticaspp.)害虫。全文摘要一种包含杀虫活性量的真菌生物防治剂的颗粒组合物，所述的防治剂中存在有芽生孢子。文档编号A01N63/04GK1121684SQ94191879公开日1996年5月1日申请日期1994年12月14日优先权日1993年12月29日发明者D·J·罗斯,J·方德林,J·T·波特申请人:曾尼卡有限公司