专利名称:生物诱变技术的制作方法
生物诱变技术涉及使用诱变因子诱导植物产生突变，改良基因型。
诱变技术在植物育种上的应用始于19世纪20年代的辐射诱变育种，其后40年代又开始了化学诱变育种;随着农业生产的不断发展，要求人们采用新的技术方法创造自然界中尚未发现的优良变异，从而培育出更多的优良品种;由于诱变育种在这方面具有一定的优点，而且取得了一定的成效，因此诱变技术发展较为迅速，在育种工作中占有相当的地位。目前诱变技术已在微生物育种和植物育种中得到广泛应用的是辐射和化学诱变育种，即利用物理和化学因素作诱变剂，诱导生物发生遗传性的变异，然后根据育种目标进行选择，以培育新的品种。物理和化学诱变可以提高突变频率，比自然突变频率高100-1000倍，突变谱范围广，可以在短时间内有效地改良植物品种的个别性状如增强抗逆性、改进品质等，为育种工作创造了极其丰富的原始材料。然而物理、化学诱变需要一定的设备条件，物理、化学诱变所产生的突变，其频率还是较低，特别是有经济价值的性状突变发生频率低;物理、化学诱变剂对人体有不同程度的危害，需要一定的保护设施;诱变处理过程中，还对环境造成了一定程度的污染。
生物诱变技术是将生物的活物质如DNA或微生物如病毒、噬菌体等引入另一生物进行诱变。该技术在微生物育种中应用的研究工作已经开始。1962年Alikhanian观察到放线菌噬菌体的显著诱变效应，他们报告利用放线菌噬菌体选育VB12、链霉素、红霉素和竹桃霉素的生产菌株;我国的微生物工作者在抗噬菌体菌株的选育试验中发现敏感菌经不同噬菌体感染后，部分菌株获得抗性，抗菌素产量产生变异，得到了比原种产量高的变异菌株，形态上的变异大于物理、化学诱变，这说明噬菌体侵入寄主后导致了寄主性状的改变。
用生物诱变技术诱导高等植物产生突变的研究工作仅见于通过离体培养进行细胞或组织的抗性选育。Carlson首次用离体选择技术将烟草野火病毒素类似物加入培养基中筛选抗病细胞系，并建立了完整的植株;以后又有许多学者用类似方法获得了玉米抗小斑病，马铃薯抗晚疫病、甘蔗抗眼点病，油菜抗黑脚病的突变体及其再生植株等等。1982-1984年江苏农科院农业生物遗传生理研究所的研究人员用水稻愈伤组织直接接种白叶枯病原菌筛选抗菌愈伤组织，分化再生植株，並鉴定了再生植株及后代的抗病性的稳定性和可遗传性。这里开始了用活体病原菌感染愈伤组织从中筛选抗性细胞系。
目前在农业生产中的抗性育种，虽然也采用了将植物病原菌直接引入寄主作物中的方法，但其目的是鉴定作物的抗病性，再在其中选择高抗材料以期得到抗性品种。
至今尚未见到直接将病原微生物引入寄主作物，使之产生各种突变，从中选择具有优良性状的变异，用于品种选育。
本发明旨在探索一种经济有效、简易可行、安全可靠的诱导突变的方法，既不需要物理、化学诱变所需的特别的设备条件，又能获得比物理、化学诱变频率更高的突变，为作物育种开辟更为丰富的基因资源。
本发明是基于病原菌能引变寄主的遗传提出的。
本发明的具体解决方案如下在适宜的温湿度条件下，在寄主作物的营养生长时期，将植物病原引入寄主作物植株的生长点及四周，使之产生各种性状的变异，在M1代中淘汰未发病(O级)和轻度发病(Ⅰ级)的个体，选留发病重(Ⅱ级)和严重(Ⅲ级)，即地上部分经历了二次以上调萎死亡的再生植株，再在M2代中选择突变体;作生物诱变因子的有真菌性病原菌、细菌性病原菌和病毒性病原等，其真菌性病原菌和细菌性病原菌的制备方法可以是直接获取作物感病部位的病原菌制成悬浮液，也可以是当年或隔年分离培养的病原菌;当年分离的强毒菌株需经钝化处理或直接引入抗性材料，生物诱变处理的适宜温湿度应选择在使病原菌导致寄主缓慢致死的范围内，其处理剂量应既能使病原接种上寄主材料，又要使发病过程的潜伏期尽可能延长。
实施生物诱变技术应遵循下列原则1、生物诱变处理的适宜时期应是寄主作物细胞分裂最旺盛时期，此阶段细胞中DNA的活动最剧烈，对外界因素的反应最敏感。禾本科植物中生物诱变的适宜处理时期为分蘖期。
2、生物诱变处理的部位以植株生长点及四周为宜。生长点是细胞数目最多、分裂最旺盛部位，因而突变产生的机率大。
3、生物诱变处理还应选择一个适宜突变诱发的外界条件。濒临死亡的细胞，其DNA的复制易出现错误，而导致变异，因而选择一定的温湿度条件既控制发病速度又促进寄主再生，创造一个缓慢致死的条件是诱发突变的必要条件。
4、突变细胞成为性细胞后，变异可遗传后代，因此诱变处理时期还应掌握在性细胞形成前，以获得可遗传的变异。
下面结合实例对本发明作进一步的阐述一、水稻白叶枯病原菌诱变寄主水稻的具体程序和结果为1、病原的准备可用当年或隔年分离培养的菌种，也可用病田病叶的浸泡液。
采用培养的菌种时，则在使用前先将保存的菌种转移在新的培养基上置26℃恒温培养48-72小时备用。当年分离的菌株如系弱毒菌株，培养好后则可使用，如系强毒菌株，则需先经钝化处理如连续转管等，或可直接引入抗性材料，其目的是创造一个缓慢致死的条件，避免强毒菌株迅速杀死寄主。
制备病叶浸泡液时，可在病区，直接采摘足够的病叶，切成1-2cm的小段，浸于冷开水中泡20分钟，过滤后备用，浸泡液要随泡随用;病叶量不够时，可先将病原菌接种在感病品种上，待叶片大量发病后再按上法浸制。
2、水稻秧苗的准备白叶枯病原菌诱发寄主水稻突变的处理时期以旬平均温度24-31℃为宜，同时又应使诱变材料-水稻处于分蘖期，因此要因地制宜确定水稻的播种期，湖南以5月下旬-6月初播种为宜，秧田要注意稀播，培育壮秧，尤其要求秧苗根系健壮。
用于诱变处理的材料应根据育种目标选择综合性状良好，只有少数性状需进一步改良的品种，或具有特殊性状和特殊用途的材料。
品种间存在遗传保守性的差异，故M2代出现的突变频率高低不一;通常陈年种子长成的植株遗传保守性较弱，使用在干燥器内保存2-4年的种子易获得嵌合体。
3、诱变处理操作(1)拔起苗床内生长健壮，根系发达，带有1-2个分蘖的秧苗，洗尽泥土后，剥去其分蘖;用五束针(五根缝衣针捆扎而成)蘸浓度为3亿个/ml的白叶枯病原菌的悬浮液穿刺生长点及四周(茎基部)1-2次，接种且形成5-10个对穿的孔洞，再将此秧苗浸入约3亿个/ml病原菌的菌液内2-3小时(以淹没伤口为准)，也可用医用注射器将菌液一次注入茎基部生长点及四周。
(2)将经处理的秧苗在傍晚17∶00-18∶00气温下降后移植在观察圃内，观察圃的管理要使秧苗不曝晒或深淹秧苗，促进秧苗快返青，早恢复生长，尤其要注意促进地下部分的健壮发育。
4、M1代的培育和种子的选收经诱变因子处理后的植株移栽成活的即为M1代。
M1代培育是诱变成功与否的关键。处理的材料在移栽后半个月出现第一次感病高峰，病原菌杀死生长点及周围分生组织的绝大部分，导致地上部分的凋萎死亡，然而残存的小部分细胞再次发生分蘖，形成植株;此植株在第二次发病高峰期，地上部分又一次被杀死，第二次又重新长出分蘖形成植株，如此可重复若干次。
对M1代加强管理，就是促进尽可能多的植株在地上部分凋萎死亡后，能重新长出新的分蘖。
为节省人力、物力，提高诱变效率，在M1代收种时，可以淘汰未发病(O级)和发病轻度(Ⅰ级)的个体，而选留发病重(Ⅱ级)和严重(Ⅲ级)植株，供单株选收种子。
附生物诱变处理分级标准O级经诱变处理移栽成活后，不发病;或仅出现枯叶型，枯心型病状;或只出现黄叶、花叶型病状;不出现地上部分凋萎死亡。
Ⅰ级经诱变处理移栽成活后，地上部分全部凋萎死亡一次，再形成的植株并且生长茂盛。
Ⅱ级经诱变处理移栽成活后，地上部分经二次凋萎死亡，尔后再恢复生长。
Ⅲ级经诱变处理移栽成活后，地上部分经历三次或三次以上的凋萎死亡，尔后恢复生长。
O级植株，经诱变处理后未发病或轻度发病，说明诱变因子的引入对其发生的作用甚微，产生突变的可能性极小，因此予以淘汰。
Ⅰ级植株，是因只经历了一次地上部分的凋萎死亡，重新长出的分蘖可能是未经受病原菌杀伤的分生组织形成的，这些分蘖生活力强，生长快，很快形成优势分蘖，而被诱变因子杀伤组织分生出来的分蘖生活力弱，生长十分缓慢，因此竞争能力差，最终被优势分蘖排挤掉，产生突变的可能性相对较小。
Ⅱ级植株有两次地上部分被彻底杀死，病原菌也经历了较长时间的蔓延和扩展，生长点及周围的组织绝大部分被杀死或杀伤，幸免者甚少。因而再生的植株大部分是经受了诱变因子作用的组织分生而成，产生突变的可能性较大。
Ⅲ级植株，其地上部分经历了三次或三次以上彻底杀死过程，未经受病原菌杀死或杀伤的组织微乎其微，因而再生的植株产生突变的可能性大。
5、M2代的选择M1代选收的单株种子，种植成M2代株系。
生物诱变处理的全过程在营养生长阶段完成，部分突变细胞成为性细胞参与生殖，因此M2株系中会出现一定比例的突变体，突变频率一般为百分之几，有时也可达50%以上。
M2代出现的突变是多向性的，包括抗性、米质、产量、生育期、生长势等特性和株高、叶型、色素、芒等特征。
多数情况下，M2出现的变异材料的基本综合性状不如亲本，但在M3代往往分离出超亲个体，因此M2代出现的突变体应尽量收种，並种植成M3。
在种植M2株系同时应种植亲本作对照。
6、M3代的选择在M3代中一般出现百分之几的分离，有时还会分离出相对M2为显性的性状。在百分之几的分离个体中易出现基本综合性状超过亲本的优良单株，应特别注意选择分离的M3株系，对M3的稳定部分和分离出的株系应给以必要的鉴定，对某些有价值和特殊用途的性状予以保留或利用。
M3代以后的处理和杂交育种及物理、化学诱变育种相同。
7、诱变处理结果如下①1979年6月，用水稻白叶枯病菌处理水稻品种红410的10个单株，秋后选收其中的两个M1单株种子，80年种植成两个M2株系，在其中一个株系的200个单株的群体中发现3株变异株。以该株系的未变异个体为对照，一个变异株的性状表现为叶色深、叶片窄、谷粒较长;81年种植此变异株，株系中少数个体出现分离，主要特征是谷粒有芒，分别定名为B1和B1一芒。82年种植时，B1不再分离，B1一芒继续分离。84年品比试验时，B1的产量比亲本红410和湘矮早10号分别增产4.35%和6.38%，85年抗病试验中B1高抗稻瘟病;该品系全生育期为110天，比亲本早2-3天，株高80cm左右，茎杆细硬，叶鞘基部紫色，株型紧凑，叶片挺直，长宽适中，分蘖力强，不早衰，抗倒伏，农艺性状优于亲本。
B1和亲本红410比较，大部分性状相同，35个性状中有29个一致，但有几个突出的可遗传变异
Ⅰ谷粒特征B1谷粒长园筒形，长宽比为2.7，而亲本红410谷粒较短、较扁。
Ⅱ米质悬殊B1垩白面积8.7%，亲本超过24%，蛋白质含量8.83%，米胶长度47mm，直链淀粉26%，B1米质显著变优。
Ⅲ叶片差异B1叶色较亲本深，叶片狭长，剑叶下第一叶长宽比值为27.32，红410为22.02。
②84年用水稻白叶枯病菌处理闽晚6号，均于M2或M3代获得了变异植株，频率在1.08-1.64%之间，主要变异表现在抗性，形态特征和生育期;其中M2代一变异株表现为早熟(早15天)、抗病、叶短、茎细、色淡、谷粒长形等。M3代出现分离，比例为42∶1。
1986年止已在湘矮早9号、珍龙13、合江18和四丰43及上述二个品种，共6品种上成功地获得了突变。
二、水稻稻瘟病菌诱发寄主水稻突变的程序基本与白叶枯病菌一致，其病原菌的准备是在当地第一次或第二次发病高峰期前后，从病叶的新鲜病斑上洗下梨形孢子配制成浓度为15-20孢子/视野(100X)的悬浮液，然后将悬浮液接种至处于分蘖始期的健壮秧苗的生长点及四周，接种后保温20小时左右，以促进孢子萌发，再移栽于观察病圃内;当气候条件对M1代发病不利时，可用医用注射器把孢子悬液注射于恢复旺盛生长的Ⅰ级M1植株，造成再度发病，以期获得Ⅱ、Ⅲ级植株。对M1代的诱变需要一定的湿度条件，叶面露珠保持12小时左右，一般在重病区可满足上述条件。
三、水稻黄矮病毒诱发寄主水稻突变的技术要点与上述二种病原相同，其接种是将饲毒并通过了循徊期的带毒介体叶蝉放入笼罩，而该笼罩内有待诱变的、处于近分蘖期的秧苗，叶蝉把病毒引入处理材料后，即移栽秧苗，成活后在M1代中淘汰不发病的植株。诱变处理时期掌握在使发病峰期与分蘖盛期相吻合。
四、小麦赤霉病菌对寄主小麦的诱变，其方法与水稻稻瘟病菌和白叶枯病菌诱变寄主水稻的方法基本相同。用子囊孢子或切成小段的菌丝悬浮液，也可用分生孢子悬浮液，浓度为20个左右/视野(100X)，接种分蘖期的小麦生长点及四周，在26℃温度条件下，保温(湿度80-100%)20小时左右，以完成寄生关系的建立，然后移栽于观察圃。诱变过程要在赤霉病流行期内完成，欲使小麦的分蘖期与赤霉病流行期吻合，须改小麦秋冬种为春播，因地制宜确定播种期，湖南地区可在2月初播种，3月上旬进行诱变处理。而冬性或半冬性小麦还应在播种前催芽并完成春化阶段(低温处理)。如当地赤霉病流行期短不足以完成诱变过程，则应采取相应的保湿措施。其余各程序同前述水稻的诱变处理。
实施本发明不需特殊的设备，而且所需的土地面积，以获得同样数量的正突变体计算，只是辐射诱变的1/10左右;对工作人员绝对安全，也不污染环境;技术简单，操作容易，只要稍具植物病理和育种知识的工作人员即可胜任此项工作;诱变效应显著，诱变谱广，包括抗性、丰产性、品质和其他多种农艺性状，正突变频率高出物理、化学诱变，一般可达百分之几以上，並且在突变后代中易出现超亲个体，本发明广泛实施，可以大大加速有价值的原始材料的创造，为培育人们所需的品种开拓了一个有效的途径。
权利要求
1.一种诱导作物性状变异的生物诱变技术，即把病原微生物引入另一生物诱发突变，本发明的特征为在适宜的温湿度条件下，在寄主作物的营养生长时期，将生物诱变因子-植物病原引入寄主作物植株的生长点及其四周，使之产生较高频率的性状变异，然后在经诱变处理的M1代淘汰未发病(O级)和轻度发病(Ⅰ级)的个体，选留发病重(Ⅱ级)和严重(Ⅲ级)的植株，再在M2代中选择变异体，以创造有价值的育种材料。
2.由权利要求
1所述的生物诱变技术，其特征为作生物诱变因子的植物病原有真菌性病原菌，细菌性病原菌和病毒性病原等。
3.由权利要求
1或2所述的生物诱变技术，其特征为作为生物诱变因子的真菌性病原菌和细菌性病原菌的制备，可直接获取作物感病部位的病原菌制成悬浮液，也可用当年或隔年分离培养的病原菌。
4.由权利要求
3所述的生物诱变技术，其特征为以当年分离的强毒菌株作诱变因子时，则需钝化处理或直接引入抗性材料。
5.由权利要求
1所述的生物诱变技术，其特征为生物诱变处理的适宜温湿度应选择在一个使病原导致寄主缓慢致死的范围内。
6.由权利要求
1所述的生物诱变技术，其特征为生物诱变因子的处理剂量应既能使病原接种上寄主材料，又要使发病过程的潜伏期尽可能延长。
专利摘要
生物诱变技术涉及使用诱变因子诱导植物产生突变，改良基因型。本发明使用植物病原作生物诱变因子，在适宜的温湿度条件下，在寄主作物的营养生长时期内，将一定浓度的生物诱变因子通过适当的方法引入寄主作物的生长点及四周，使之产生较高频率的性状变异，再经选择的方法培育出人们所需的品种。本技术经济有效，简单易行，安全可靠，既不需要特殊的设备条件，又不污染环境，突变频率高于物理、化学诱变。
文档编号A01H1/06GK87102015SQ87102015
公开日1988年10月26日 申请日期1987年4月16日
发明者黄河清 申请人:湖南省植物保护研究所导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan