以根为外植体的非洲菊不定芽诱导和植株再生方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及植物组织培养繁殖技术，更具体地，涉及一种以根为外植体的非洲菊不定芽诱导和植株再生方法。
【背景技术】
[0002]非洲菊Jamesonii Bolus)，别名扶郎花、太阳花、灯盏花等，是菊科大丁草属多年生常绿宿根草本花丼，原产于非洲，是世界5大切花之一。非洲菊色彩丰富，花朵硕大，是艺术插花的理想材料，具有重要的观赏价值，在适宜的栽培条件下能周年开花，可作为城市观赏花丼及盆栽装饰。但由于非洲菊是异花授粉植物，实生苗变异大，导致花梗变细、变软、花型变小等，不能保持良种特性，而分株繁殖方法繁殖系数低又不能满足市场需求，因此国际花丼市场上非洲菊花丼产业一直采用组织培养技术无性扩繁获得良种种苗。
[0003]我国处于非洲菊的推广阶段，品质高的良种非洲菊品种的研发为国外垄断技术，国内花丼公司的非洲菊良种原生种的种子和种苗全部从国外引进，成本非常高。同时，国内花丼公司高价买进的良种种苗经过多代的继代培养增殖扩繁后，会逐代出现品质退化现象，典型的现象就是非洲菊的花型变小，直接导致大批量生产出来的非洲菊不达标，无法销售，致使花丼公司必须每2 ~ 3年就要高价从国外引进新的良种种苗，成本极高。了解了国内主要生产非洲菊的花丼公司和研宄单位后，这种多世代增殖后花型退化的现象非常普遍，国内的非洲菊产业亟需解决这一问题。
[0004]不少研宄者对非洲菊不同器官外植体材料的培养效果进行比较研宄，已经从花萼、花托，叶片，茎段、花瓣、子房，花梗、花蕾、茎尖等多种外植体上获得了再生植株，其培养配方已经公布。专利申请号为200810025775.9、名称为“非洲菊离体高频再生繁殖方法”的发明专利，公开了一种以非洲菊试管苗叶柄作为外植体的不定芽诱导方法；专利申请号为200810014604.6、名称为“一种非洲菊组培快繁方法”，公开了一种以非洲菊花托为外植体的不定芽诱导方法。但在众多离体培养报道中，以根段作为外植体的非洲菊组织培养尚为空白。
[0005]考虑到花器官、茎、叶等器官均为地上部分器官，具有明显的成熟效应、年龄效应和位置效应，受这些效应影响，无性扩繁培养出来的植株退化是非常普遍的现象。而根系不存在阶段发育性，永远为幼年性，以根为起始材料繁殖得到的苗木，能够获得如同种子繁殖苗木同样的幼年性，从而实现衰退植株的返幼复壮效果，是恢复植株退化性状的理想材料。
【发明内容】
[0006]针对现有技术主要采用花器官、苗叶等地上部分器官作为外植体诱导中存在的植株退化现象，本发明提出一种以根为外植体的非洲菊不定芽诱导和植株再生方法。
[0007]本发明的以根为外植体的非洲菊不定芽诱导和植株再生方法，其特征在于按下列步骤实施:
(I)外植体的获得:以已退化的非洲菊无菌瓶苗为原始材料，将高约3 ~ 4 Cm的无菌苗切成单株苗，接种于培养基中，培养基配方为1/2MS + IBA 0.2 ~ 1.0 mg/L,pH 5.8 ~ 6.2，蔗糖20 ~ 30 g/L，琼脂4 ~ 7 g/L;培养温度为21±2°C，以光照强度为1600 ~ 1800 Lux的光照12 h/d;生长14 ~ 20 d后，根伸长至I ~ 2 cm时，截取0.5 ~ 1.5cm的根段作为外植体材料；
(2)启动培养:将截取的根段在蒸馏水下冲洗干净后，接种于不定芽诱导培养基中，培养基的配方为MS + 6-BA 0.5 ~ 1.5 mg/L+NAA 0.1 ~ 1.0 mg/L, pH 5.8 ~ 6.2，蔗糖 20 ~30 g/L，琼脂4 ~ 7 g/L;培养温度为21 ±2°C，以光照强度为1600 ~ 1800 Lux的光照12h/d，培养 25 -30 d ；
(3)增殖培养:将根段基部得到的长势较好的I~ 2 cm不定芽转接到增殖培养基上，增值培养基的配方为:MS + 6-BA 0.5-2.0 mg/L + NAA 0.05 ~ 0.2 mg/L, pH 5.8 ~ 6.2，蔗糖20 ~ 30 g/L，琼脂4 ~ 7 g/L;培养温度为21 ±2°C，以光照强度为1600 ~ 1800 Lux的光照12 h/d，培养25 ~ 30 d，形成2 ~ 3cm高的丛生芽；将形成的丛生芽可以切成单芽，放在增殖培养基上进行增殖培养；
(4)生根培养:待增殖所获得的丛生芽植株长到2~ 3cm时，将继代的芽切成2 ~ 4片叶子为一株的单芽，接种到生根培养基上，生根培养基配方为:1/2MS + IBA 0.2 ~ 1.0mg/L，附加20 ~ 30 g/L蔗糖，4 ~ 7 g/L琼脂；培养温度为21 ±2°C，以光照强度为1600 ~1800 Lux的光照12 h/d ;培养25 ~ 30 d后，根长为1.5 ~ 2.5 cm，得到非洲菊生根苗。
[0008](5)炼苗与移栽:待生根苗的根长达2 cm后，在室温为25°C的室内炼苗2 ~ 4天，取出生根苗，洗净沾附在根部的培养基，之后移栽到基质配比为红土:腐殖土:珍珠岩=1:1:1的沙盘中，移栽后注意控制温室内的温度在25 ~ 30°C之间，湿度在75 ~ 80%之间，10 ~ 15天后成活。
[0009]本发明的突出优点在于:以花型变小的退化的不达标的非洲菊无菌瓶苗根段为外植体材料，经过无菌蒸馏水冲洗既可接种，减少了外植体消毒的环节；以无菌瓶苗的根段为外植体，具有取材方便，不受季节限制，诱导增殖系数高，通过以根段为外植体诱导成苗，增殖系数达到3.6 ~ 5.1倍，且组培周期为3个月，远低于其他以花器官等为外植体材料的6~ 7个月的组培周期，组培成本节省了二分之一。本发明所提供的非洲菊植株再生方法具有遗传性状稳定，培养过程简单，易生根，培养扩繁周期短，移栽容易成活的优点。因而，本发明对于加速非洲菊良种的无性繁殖具有积极作用，同时也达到了为退化非洲菊品种的性状恢复及再利用奠定基础的目的。
【具体实施方式】
[0010]实施例1:，非洲菊的不定芽诱导和植株再生在西南林业大学林学院实验室和格林温室进行，实施时间为2013年。
[0011](I)外植体的获得:以非洲菊花丝为外植体繁殖的无菌瓶苗(品种名为太阳风)为原始材料，该材料为花型变小的退化材料，不能达标进行售卖。在超净工作台上，将高约3 ~4 cm的无菌苗切成单株苗，接种于1/2MS + IBA 0.5 mg/L的培养基上用以生根取材。其中，PH 5.8，蔗糖20 g/L，琼脂4 g/L。培养条件:培养温度为21±2°C，以光照强度为1600~1800Lux的光照12 h/d。生长15 d后，根伸长到一定长度，截取0.8 cm长的根段作为外植体材料。
[0012](2)启动培养:超净工作台内将截取的根段在蒸馏水下冲洗干净后，接种于不定芽诱导培养基中。培养基的配方为:MS + 6-BA 1.0 mg/L + NAA 0.5 mg/L, pH 5.8，蔗糖20g/L，琼脂4 g/L?培养条件:培养温度为21 ±2°C，以光照强度为1600 ~ 1800 Lux的光照
12h/d，培养 25 do
[0013](3)增殖培养:将根段基部得到的长势较好的I ~ 2 cm不定芽转接到增殖培养基上，增殖培养基的配方为:MS + 6-BA 1.0 mg/L + NAA 0.1 mg/L, pH 5.8，蔗糖 30 g/L，琼脂4 g/Lo培养条件:培养温度为21 ±2°C，以光照强度为1600 ~ 1800 Lux的光照12 h/d，培养25 d，形成2 ~ 3cm高的丛生芽。反复将形成的丛生芽可以切成单芽，放在增殖培养基上进行增殖培养，可以使非洲菊进行快速大量的扩繁，其增值倍数为5.07倍。
[0014](4)生根培养:待增殖所获得的丛生芽植株长到2 ~ 3cm时，将继代的芽切成2 ~4片叶子为一株的单芽，接种到生根培养基上，生根培养基配方为:1/2MS + IBA 0.5 mg/L,附加20 g/L蔗糖，4 g/L琼脂。培养条件:培养温度为21±2°C，以光照强度为1600 ~ 1800Lux的光照12 h/d。培养25 d后，根长为1.5 ~ 2.5 cm，得到非洲菊生根苗。
[0015](5)炼苗与移栽:待生根苗的根长达2 cm后，在室温为25°C的室内打开瓶盖，炼苗2 ~ 4天后，取出生根苗，洗净沾附在根部的培养基，之后移栽到基质配比为红土:腐殖土:珍珠岩=1:1:1的沙盘中，移栽后注意控制温室内的温度在25 ~ 30°C之间，湿度在75 ~80%之间，10 ~ 15天后成活，移至杯口直径为10 cm的营养袋中，移栽基质配比同沙盘。再通过养护2个月，苗高达10-15 cm时，可以售卖。
【主权项】
1.本发明的以根为外植体的非洲菊不定芽诱导和植株再生方法，其特征在于按下列步骤实施: (1)外植体的获得:以已退化的非洲菊无菌瓶苗为原始材料，将高约3~ 4 Cm的无菌苗切成单株苗，接种于培养基中，培养基配方为1/2MS + IBA 0.2 ~ 1.0 mg/L,pH 5.8 ~ 6.2，蔗糖20 ~ 30 g/L，琼脂4 ~ 7 g/L;培养温度为21±2°C，以光照强度为1600 ~ 1800 Lux的光照12 h/d;生长14 ~ 20 d后，根伸长至I ~ 2 cm时，截取0.5 ~ 1.5cm的根段作为外植体材料； (2)启动培养:将截取的根段在蒸馏水下冲洗干净后，接种于不定芽诱导培养基中，培养基的配方为MS + 6-BA 0.5 ~ 1.5 mg/L+NAA 0.1 ~ 1.0 mg/L, pH 5.8 ~ 6.2，蔗糖 20 ~30 g/L，琼脂4 ~ 7 g/L;培养温度为21 ±2°C，以光照强度为1600 ~ 1800 Lux的光照12h/d，培养 25 -30 d ； (3)增殖培养:将根段基部得到的长势较好的I~ 2 cm不定芽转接到增殖培养基上，增值培养基的配方为:MS + 6-BA 0.5-2.0 mg/L + NAA 0.05 ~ 0.2 mg/L, pH 5.8 ~ 6.2，蔗糖20 ~ 30 g/L，琼脂4 ~ 7 g/L;培养温度为21 ±2°C，以光照强度为1600 ~ 1800 Lux的光照12 h/d，培养25 ~ 30 d，形成2 ~ 3cm高的丛生芽；将形成的丛生芽可以切成单芽，放在增殖培养基上进行增殖培养； (4)生根培养:待增殖所获得的丛生芽植株长到2~ 3cm时，将继代的芽切成2 ~ 4片叶子为一株的单芽，接种到生根培养基上，生根培养基配方为:1/2MS + IBA 0.2 ~ 1.0mg/L，附加20 ~ 30 g/L蔗糖，4 ~ 7 g/L琼脂；培养温度为21 ±2°C，以光照强度为1600 ~1800 Lux的光照12 h/d ;培养25 ~ 30 d后，根长为1.5 ~ 2.5 cm，得到非洲菊生根苗； (5)炼苗与移栽:待生根苗的根长达2cm后，在室温为25°C的室内炼苗2 ~ 4天，取出生根苗，洗净沾附在根部的培养基，之后移栽到基质配比为红土:腐殖土:珍珠岩=1:1:1的沙盘中，移栽后注意控制温室内的温度在25 ~ 30°C之间，湿度在75 ~ 80%之间，10 ~ 15天后成活。
【专利摘要】本发明涉及植物组织培养繁殖技术，更具体地，涉及一种以根为外植体的非洲菊不定芽诱导和植株再生方法，其特征在于以退化的非洲菊根作为外植体，进行增殖、生根培养，得到非洲菊生根苗。本发明具有遗传性状稳定、培养过程简单、易生根，培养扩繁周期短，移栽容易成活的优点。
【IPC分类】A01H4-00
【公开号】CN104642141
【申请号】CN201510110573
【发明人】何承忠, 赵雁鸣, 李旦, 许昌慧, 吴英英, 辛培尧, 张斌
【申请人】西南林业大学
【公开日】2015年5月27日
【申请日】2015年3月13日