使用线性dna载体的质体转化的制作方法

使用线性dna载体的质体转化的制作方法
【专利说明】
[0001] 相关申请的交叉参考
[0002] 依据35U.S.C. § 119(e)，本申请要求2012年10月24日提交的美国临时申请号 61/718,095的利益，其内容通过引用完全结合在本文中。
[0003] 序列表
[0004] 本申请包含序列表，该序列表通过EFS-Web以ASCII格式提交，并且通过引用完 全结合在本文中。所述ASCII副本在2013年3月12日产生，命名为034186-077150-PCT_ SL. txt，并且大小为20, 932字节。
[0005] 政府利益声明
[0006] 本发明是在美国农业部授予的合同号为2008-39211-19557的政府支持下进行 的。政府对本发明享有某些权利。
技术领域
[0007] 本公开内容涉及质体转化的方法，使用该方法产生的转质体植物 (transplastomic plant)和植物部分，以及所述转质体植物和植物部分的后代。
[0008] 相关领域描述
[0009] 与核转化相比，质体转化具有多种优点。其允许高的转基因表达水平，在单次转化 事件中的多基因改造，和通过母体遗传的转基因遏制（transgene containment)。另外，由 于有毒转基因产物的亚细胞区室化（subcellular compartmentalization)，质体转化缺少 多效效应。此外，这种技术避免与核转基因表达相关的其他问题，诸如由于转基因整合位点 导致的基因沉默和位置影响。尽管存在它的优点，质体转化局限于特定的双子叶植物。已 经证明单子叶植物，如玉蜀黍（maize)，小麦，和水稻，不受该技术影响。
[0010] 概述
[0011] 本文所述的方法和组合物涉及在任意植物中提供高效的质体转化的载体和转化 流程。在一些实施方案中，所述植物可以是曾经不受质体转化影响的单子叶植物。
[0012] 在一方面中，本公开内容提供质体转化的方法，所述方法包括：向植物组织的质体 中引入线性DNA载体，其中（i)所述质体包含基本上不降解的质体DNA，（ii)所述线性DNA 载体包含：（1)质体DNA靶向序列，和（2)目的转基因。
[0013] 在某些实施方案中，所述植物是谷物农作物。
[0014] 所述目的转基因可以选自由下述组成的组：编码治疗性或预防性多肽的基因，提 供或增强除草剂抗性、昆虫抗性、真菌抗性、细菌抗性和胁迫耐受性的基因，以及提高氮固 定、矿物质营养、植物产量、淀粉累积、脂肪酸累积、蛋白累积和光合作用的基因。
[0015] 在某些实施方案中，所述线性DNA载体还包括编码选择标记的基因，诸如提供针 对壮观霉素、链霉素、卡那霉素、潮霉素、氯霉素、草甘膦或双丙氨膦（bialaphos)抗性的基 因，提供甘露糖代谢机制的基因或编码荧光蛋白的基因。
[0016] 在某些实施方案中，所述质体DNA靶向序列包含质体染色体DNA分子的末端序列。 例如，所述质体末端序列与SEQ ID NO :1，8,15, 21，29, 35,41或47的一部分至少90%相同， 所述部分至少30个核苷酸长。
[0017] 在某些实施方案中，所述质体末端序列包含：当所述植物组织是玉蜀黍组织时，包 含 SEQ ID NO :2,9,16, 22, 27, 28, 30, 36,42,48, 53, 54, 55, 56 或 57 的至少 30 个连续的核 苷酸，当所述植物组织是小麦组织时，包含SEQ ID NO :3,10,17, 23, 31，37,43或49的至少 30个连续的核苷酸，当所述植物组织是水稻组织时，包含SEQ ID NO :4, 5,11，12,18,19, 24， 25, 32, 33, 38, 39,44,45, 50或51的至少30个连续的核苷酸，当所述植物组织是烟草组织 时，包含SEQ ID NO :6,13, 20, 26, 34,40或52的至少30个连续的核苷酸，或当所述植物组 织是苔类植物组织时，包含SEQ ID NO :7或46的至少30个连续的核苷酸。
[0018] 在一些实施方案中，所述线性DNA载体包含在Y端或:V端的单链突出端，可以 或可以不共价连接所述线性DNA载体的两条DNA链的单链环，或不是与5'端或3'端共价 连接的核苷酸的分子。
[0019] 在一些实施方案中，所述植物组织是非绿色组织，诸如成熟胚的一部分，暗处生长 的幼苗的一部分，种子或种子的一部分。
[0020] 在某些实施方案中，所述质体是前质体、黄化质体或其他非绿色质体。
[0021] 在某些实施方案中，通过用由所述线性DNA载体包被的微粒生物弹道轰击植物组 织进行步骤（a)。
[0022] 在某些实施方案中，质体转化的方法还包括（b)避光培养来自步骤（a)的植物组 织。
[0023] 在一些实施方案中，质体转化的方法还包括（c)由步骤（a)或步骤（b)的植物组 织再生转质体植物。
[0024] 在某些实施方案中，所述转质体植物是同质的。
[0025] 在另一方面中，本公开内容提供由本文公开的方法得到的转质体植物或植物部 分。
[0026] 在相关的方面中，本公开内容提供由本文公开的方法得到的转质体植物的植物或 或植物部分的后代。
[0027] 在另一方面中，本文公开内容提供用于植物中质体转化的线性DNA载体，所述载 体包含：（1)质体DNA革E向序列，其包含质体末端序列（plastid terminal sequence)，（2) 表达盒，其包含：(a)任选地，在要转化的植物的质体中有活性的启动子，（b)用于接纳目的 转基因的DNA插入位点，（c)任选地，一个或多个选择标记，（d)任选地，编码在要转化的植 物的质体中有活性的转录终止区的DNA序列。
[0028] 在某些实施方案中，所述线性DNA载体还包括在DNA插入位点插入的目的转基因。
[0029] 附图简述
[0030] 图1A-1F图示苔类植物质体转化载体和转基因整合。图IA图示载体pCS31的示意 图。图IB图示通过SacI消化线性化的载体LpCS31的示意图。图IC图示通过Notl/SacII 消化线性化的载体TCpCS31的示意图。aadA/RBS片段产生阳性转化体。图ID图示通过同 源重组整合到质体基因组中的示意图。图IE图示通过末端连接整合的示意图。图IF图示 通过链侵入（strand invasion)整合的示意图。LBS :左边界序列，RBS :右边界序列，aadA: 具有PEP启动子、5' -UTR和:V -UTR的转基因，P1，P4-P6:侧翼连接边界序列的PCR引 物，P2, P3 :在转基因盒内的PCR引物，aL，aR :用于aadA转基因的PCR引物。
[0031] 图2A-2C图示用于烟草质体转化的载体。图2A图示环形载体pPRVlllA的示意图， 所述载体包含烟草PtDNA LBS和RBS，侧翼连接烟草psbA启动子/psbA 5' -UTR和psbA 3' -UTR的用于壮观霉素选择的aadA基因。具有限制性位点的多接头位于LBS与启动子 区之间。转基因盒是登记号U12812。箭头表示16SrRNA和trnV基因的位置。图2B图示 通过EcoRV消化pPRVlllA产生的线性载体LpPRVlllA的示意图。图2C图示通过SacI消 化pPRVlllA产生的线性载体TCpPRVlllA的示意图。
[0032] 图3A-3G图示用于玉蜀黍质体转化的载体。图3A和3C图示环形载体pZMCP150和 PZMCP152的示意图，所述载体包含玉蜀黍ptDNALBS和RBS以及侧翼连接玉蜀黍16S rRNA 启动子/psbA 5' -UTR和 psbA3< -UTR 的 gfp 基因。箭头表示 16S rRNA、0RF85 和 trnV 基 因以及PCR引物的位置。在RBS中，End5分别对应IRb、pZMCP150和pZMCP152的Y和:V 端。图3B和3D图示通过Pstl/PvuII/Sfil消化产生的线性载体TCpZMCP150和TCpZMCP152 的示意图。包括PvuII酶以减少线性载体片段重新环化的机会。通过限制性消化产生另外 三种线性载体：图3E图示TC2pZMCP152的示意图，其包括具有End5的完整的LBS和最小的 RBS (27bp)区；图3F图示TC3pZMCP152的示意图，其包括完整的RBS和最小的LBS (172bp)， 没有End5 ;图3G图示TC4pZMCP152的示意图，其包括完整的LBS和RBS区，但是末端序列 由来自克隆质粒的113和205bp构成。
[0033] 图4A-4B图示用质体转化载体轰击的玉蜀黍胚组织的图像。对来源于用环形载体 PZMCP150粒子轰击后的成熟胚的单片愈伤组织成像：对于每对图像，白光在左侧，GFP在右 侦k在4A和4B中都可以看到植物细胞壁的自体荧光。图4A图示质体中没有GFP表达的 组织区域。图4B图示质体中具有GFP表达的组织区域。
[0034] 图5A-5D图示用质体转化载体轰击的玉蜀黍胚组织的图像。对来源于粒子轰击后 的成熟胚的单片愈伤组织成像：对于每对图像，白光在左侧，GFP在右侧。图5A图示没有DNA 的组织，图5B图示具有线性载体TCpZMCP150的组织，图5C图示具有环形载体pZMCP152的 组织，图图示具有线性载体TCpZMCP152的组织。用GFP滤光片可以观察到植物细胞壁 的自体荧光。
[0035] 图 6A-6B 图示 SEQ ID NOS :1-14 ;-部分玉蜀黍 End5(SEQ ID NOS :2 和 9)与来 自小麦（SEQ ID NOS :3 和 10)、水稻（SEQ ID NOS :4,5,11 和 12)、烟草（SEQ ID NOS :6 和 13)和苔类植物（SEQ ID NO :7和14)的ptDNA的ptDNA序列比对。共有序列以SEQ ID NOS :1和8显示。在五个测序的质体基因组中评估线性ptDNA的末端序列的同源性，该 末端序列本图中和在图3中指定为End5,在表6中指定为Endl/5,所述五个测序的质体 基因组为：小麦（Ta，小麦（Triticum aestivum)，NC_02782)，水稻（Osj，日本水稻（Oryza 8已1：；[￥3]_3卩011；^3)，父15901;〇8；[，印度水稻（(^5^3 831：；[￥3；[11(1；^3)，六￥522329)，烟草（财， 烟草（Nicotiana tabacum)，NC_00189)，和苔类植物（Mp，地钱（Marchantia polymorpha)， X04665)。完整Endl/5序列比对跨越对应玉蜀黍质体基因组X86563的nt 94920 :96198(图 11)的1278bp区域。数据最佳适配位于IRb中nt 96976±60和IRa中127767±60的末端 (见表6)。图6A图示End5序列的5'端120bp(nt 94976至nt 95095)与其他植物ptDNAs 的比较。图6B图示End5序列的Y端120bp(nt 94857至nt 94976)与其他植物ptDNAs 的比较。点表示每种植物中相同的核苷酸（A/G/C/T)，大写字母表示高度同源性区域内的碱 基改变，小写字母表示在高度同源区域外的非同源性。
[0036] 图 7A-7B 图示 SEQ ID NOS :15-26 ;-部分玉蜀黍End2(SEQ ID NOS :16 和 22)与图 6中相同的植物ptDNAs的ptDNA序列比对。图7A图示End2序列的Y端120bp(nt 94143 至nt 94262)与其他植物ptDNAs的比较。图7B图示End2序列的3'端120bp(nt 94924 至nt 94143)与其他植物ptDNAs的比较。对于Mp没有发现相似的序列。
[0037] 图8A-8B图示SEQ ID NOS :27和28 ;-部分玉蜀黍End3的5'末端序列（SEQ ID NO :27和28)与图6中相同的植物ptDNAs进行比较，尽管对于其他五种ptDNA序列中的任 一种都没有发现相似的序列。图8A图示End3序列Y端120bp(nt 87402至nt 87521)。 图 8B 图示 End3 序列 3'端 120bp (nt 87283 至 nt 87402)。
[0038] 图9A-9B. SEQ ID NOS :29-40 ;-部分玉蜀黍End4(SEQ ID NO :30和36)与图6A-6B 中相同的植物PtDNAs的ptDNA序列比对。图9A图示End4序列的Y端120bp(nt 84555 至nt 84674)与其他植物ptDNAs的比较。图9B图示End4序列的Υ端120bp(nt 84436 至nt 84555)与其他植物ptDNAs的比较。对于Mp没有发现相似的序列。
[0039] 图 10A-10B 图示SEQ ID NOS :41-52 ;-部分玉蜀黍End6(SEQ ID NOS :42和48)与 图6A-6B中相同的植物ptDNAs的ptDNA序列比对。图IOA图示End6序列的Y端120bp (nt 93863至nt 93982)与其他植物ptDNAs的比较。对于Nt没有发现相似的序列。图IOB图 示End6序列的Y端120bp(nt 93744至nt 93863)与其他植物ptDNAs的比较。对于Mp 没有发现相似的序列。
[0040] 图11图示SEQ ID NO :53 ;完整的Endl/5序列是利用测序数据由ClustalW比对确 定的。将在所有个体测序输出中发现最大重叠程度的第一个核苷酸指定为"真正的末端"。
[0041] 图12图示SEQ ID NO :54 ;完整的End2序列是利用测序数据由ClustalW比对确 定的。将在所有个体测序输出中发现最大重叠程度的第一个核苷酸指定为"真正的末端"。
[0042] 图13图示SEQ ID NO :55 ;完整的End3序列是利用测序数据由ClustalW比对确 定的。将在所有个体测序输出中发现最大重叠程度的第一个核苷酸指定为"真正的末端"。
[0043] 图14图示SEQ ID NO :56 ;完整的End4序列是利用测序数据由ClustalW比对确 定的。将在所有个体测序输出中发现最大重叠程度的第一个核苷酸指定为"真正的末端"。
[0044] 图15图示SEQ ID NO :57 ;完整的End6序列是利用测序数据由ClustalW比对确 定的。将在所有个体测序输出中发现最大重叠程度的第一个核苷酸指定为"真正的末端"。
[0045] 详述
[0046] 本公开内容提供质体转化的方法，用于所述方法的线性DNA载体，通过所述方法 得到的转质体植物或植物部分，以及这些植物和植物部分的后代。
[0047] 标准的质体转化方法使用环形载体，使用在光照下生长的绿色植物组织通过同源 重组发生转基因向质体基因组中的整合。仅在某些双子叶物种中观察到使用所述方法成功 获得了质体转化，而在谷类植物（单子叶植物），如玉蜀黍（maize)、小麦和水