的绿色集落的数目来评估用苔类植物的转化效率 (表1)，并且通过PCR和与aadA基因的点印迹杂交来评估转基因的存在（表2)。与环形载 体相比，使用线性化的载体得到更高的转化效率（通常3-10倍，但是在一个情形中为200 倍；表1)。
[0149] 使用环形载体进行转基因整合的常规方法是通过所述载体与ptDNA内的同源区 域（LBS和RBS)之间的同源重组（HR)进行（图ID)。相比之下，线性载体可以通过HR，EJ (末 端结合；图IE)，或SI (链侵入；图IF)整合。在线性转基因盒（TCpCS31)的情形中，整合将 是通过EJ或SI进行的，而不是通过HR，原因在于其仅包含一个与ptDNA同源的区域（RBS) (图1)。用引物P3/P6得到的PCR扩增产物表示通过链侵入得到的阳性转化体，但是，如果 整合是通过EJ进行的，则不是。另一方面，aadA引物aL/aR将报道所有阳性转化体，而与 机制无关。因此，使用P3/P6引物（与aadA引物相比，用TCpCS31有较低的数量，表2)的 PCR数据暗示通过EJ整合，而不是SI整合。对于主要的TCpCS31，相对于aadA阳性转化体 的总数，21 %的整合是通过SI进行的，79%是通过EJ进行的（分别为4/19和15/19)。表 3显示了使用线性DNA载体进行转基因整合的机制。
[0150] 实施例2
[0151] 烟草中的质体转化
[0152] 烟草中的质体转化用幼小的刚展开的叶片和较老的完全展开的叶片使用壮观霉 素选择（aadA基因）和病毒标记gfp进行。使用aadA载体，阳性转化体评分为1，在叶节上 由一些愈伤组织样的生长。这样的组织是浅黄色的或绿色的，通常有毛状体从组织中伸出。 选择培养基包含应该允许芽生长的激素（除了壮观霉素选择之外）；然而，没有得到芽。使 用幼叶的质体转化比用较老的叶子号4至6倍（表4)。使用线性gfp载体也发现在质体中 具有GFP表达的阳性转化体（图像未显示）。
[0153] 烟草（Nicotiana tabacum) Petite Havana在连续光照下在控制温度的房间中在 RM无菌生长。采集不同龄的叶片，并且在将背轴侧放置到RMOP平板上之前测量。然后用 由环形或线性化PPRV111A (图2)或pPRV131B载体包被的0. 7 μ m钨微载体轰击（Lutz等， Plant Physiol (植物生理学）145 :1201-10, 2007)。将叶片放置过夜，并且次日切成5x5mm 的切片，并放置在含有500mg/L壮观霉素的RMOP选择平板上，背轴侧在培养基上。所用 的RMOP琼脂已经由促使生长技术浓度改变为包含0. 5mg/L NAA和0. 5mg/L BAP。三至四 周后，为叶片切片的再生评分（表4)。使用addA/壮观霉素选择烟草，具有选择"逃逸物 (escapes)"不是不常见的（Svab和Maliga，Proc Natl Acad Sci USA (美国国家科学院学 报）90 :913-7,1993)，如由具有无 DNA叶节的愈伤组织的存在所示的（表4)。还用显微镜 检查已经用赋予GFP表达的pPRV131B轰击的叶片的GFP荧光（图像未显示）。将PCR引 物aadA R1/L1加入到总组织DNA(ttDNA)中，并且在琼脂糖凝胶上以条带显现扩增的产物 (表 5)。
[0154] 使用线性载体的质体转化效率略高于环形载体。对于TCpPRVlllA，EcoRV/SacI 消化不完全（琼脂糖凝胶分析，数据未显示），产生LpPRVlllA(图2B)和TCpPRVlllA(图 2C)二者，但是没有环形载体。使用TCpPRVlllA得到比使用LpPRVlllA略高的转化，这表 明由仅一个PtDNA-靶向区域（RBS)加标记基因（aadA)组成的载体可以比具有RBS和LBS 二者的载体更好地整合到质体基因组中。此外，由于苔类植物质体转化表明通过EJ比通过 HR得到更好的整合，因此，对于TCpPRVlllA较高的烟草转化体数目可能是由于EJ导致的。 TCpPRVlllA中RBS的末端是在预测与Zm Endl/5类似的烟草ptDNA序列的~1500bp (表6 和7)。
[0155] 实施例3
[0156] 在玉蜀黍、小麦和水稻中的质体转化
[0157] 构建包含ptDNA末端序列和标记转基因（gfp)的用于玉蜀黍的质体转化载体（图 3)。所用的方法和在玉蜀黍质体基因组内的末端序列的位置记述在下文中。非绿色玉蜀黍 组织（成熟的胚和暗处生长的幼苗的茎杆）以及小麦和水稻组织（完整的或裂开暴露胚的 种子）用于使用环形和线性化的载体通过粒子轰击进行质体转化。在轰击后数天，评价愈 伤组织和发育中的芽组织的gfp表达，并且收集组织样品用于总组织DNA(ttDNA)制备、PCR 和印迹杂交分析。
[0158] 1.确定玉蜀黍ptDNA的末端序列。
[0159] 在玉蜀黍中，质体基因组的尺寸为140, 387bp (Maier等，J Mol Biol (分子生物学 杂志）251 :614-28，1995)。质体染色体DNA分子作为单位基因组尺寸的线性异构体（单 体和多联体）和多基因组、分支的复合分子的集合存在（Oldenburg和Bendich，J Mol Biol (分子生物学杂志）335 :953-70, 2004)。玉蜀黍以及大部分（而不是全部）植物中的质 体基因组具有四个确定的区域：大的单拷贝区（LSC)，小的单拷贝区（SSC)和两个反向重复 区（IRs ;IRa和IRb)。对于测序的质体基因组，第一个核苷酸（nt = 1)定义为不具有IRs 的基因组中LSC或其等价物的起点。末端序列是与Ends(nts)相邻的区域（5'下游或3' 上游），如下文所述。
[0160] 使用三种方法确定用于玉蜀黍ptDNA的末端序列：（1)单位点或两位点限制性消 化，然后脉冲场凝胶电泳（PFGE)和印迹杂交，（2)与克隆质粒末端连接，然后对ptDNA插入 物PCR扩增并测序，（3)与克隆质粒末端连接，然后是亚克隆到大肠杆菌中，质粒选择/制 备和测序。
[0161] 使用第一种方法，通过限制性酶消化和印迹杂交鉴定三个用于玉蜀黍ptDNA的 离散的末端（Oldenburg 和 Bendich，J Mol Biol (分子生物学杂志）335:953-70, 2004)。 使用相同的方法，还已经鉴定了用于漢藜苜蓿（Medicago truncatula) (Shaver等，Plant Physiol (植物生理学）146 :1064-74, 2008)和烟草（Scharff 和 Koop，Plant Mol Biol (植 物分子生物学）62 :611-21，2006)的ptDNA的末端。这种方法表明在玉蜀黍IRb中的末端 大约位于nts 78, 000,88, 000和100, 000,标准偏差为±5, OOObp (末端也在IRa中）。
[0162] 对于其他方法，将线性化的质粒，如pBluescript，连接到通过标准方法制备的玉 蜀黍 ptDNA 的末端（Oldenburg 和 Bendich，J Mol Biol (分子生物学杂志）335 :953_70， 2004)。通过PFGE将凝胶内质粒-连接的-ptDNA分开，并且将充分结合的级分（多基因组、 分支的线性形式）和限定单体级分从凝胶上切下。下一步是用限制酶（如BamHI)消化该 质粒-连接的-PtDNA，以产生在质粒多接头和ptDNA中相容的末端，然后连接所述相容的末 端。然后，使用通用引物（M13正向和反向）利用两种方法测序与质粒相邻的末端。第一种 是使用M13引物的PCR，以扩增包含末端区域的ptDNA插入物。利用琼脂糖凝胶电泳来分开 PCR产物，然后切下DNA条带并测序。第二种方法是用质粒-ptDNA进行大肠杆菌转化，选 择克隆，质粒小量制备，并且对具有包含末端序列的PtDNA插入物的质粒进行测序。这些方 法使用来自几种不同玉蜀黍PtDNA制备物的ptDNA进行并且在分支的线性（充分结合的） 和线性的单体分子上进行。利用这两种方法确定五种末端序列的位置（表6和图11-15)。 End3的末端是在nt 87, 402,并且可能对应于之前通过限制性消化和印迹杂交鉴定的末端 (nt 88, 000)。Endl/5用来构建用于玉蜀黍、小麦和水稻质体转化的载体（见下；图3)。
[0163] 对于苔类植物和烟草，评估质体基因组和转化载体与玉蜀黍ptDNA末端的序列相 似性（表6和7)。对于所有的玉蜀黍末端存在序列同源性，在烟草中对于五种玉蜀黍末端 中的三种以及对于苔类植物与五种中的两种具有近乎精确的末端序列（>90%的同一性） (尽管这些中的一种是在LSC中而不是在IRs中）。如更详细地显示地，在小麦、水稻和烟 草的PtDNAs中存在与玉蜀黍ptDNA Endl/5的实质上的序列同源性，在苔类植物ptDNA中 具有较短的同源性区域（约40bp)(图6)。有趣地，用于苔类植物和烟草质体转化的线性化 载体的末端接近推定的末端序列，所述推定的末端序列是通过与玉蜀黍末端进行比较而确 定的（表6和7)。
[0164] 2.用于玉蜀黍、小麦和水稻的质体转化的载体构建。构建并检测两种载体用于玉 蜀黍、小麦和水稻中的质体转化（图3，A-D)。载体由插入到克隆质粒pBluescript II KS+ 中的LBS和RBS区域、标记转基因和表达控制区构成（表8)。用这三种区域中的每一种单 独地和与独特的限制性位点构建质粒，以允许模块组装和多重质体转化载体的检测。另外， 优化密码子用于在玉蜀黍质体中表达。质粒PZMCP120包含标记转基因 gfp (pzmcpGFP)，其 侧翼连接用于PsbA的16S rRNA启动子+5' -UTR(分别为：IRb中nts 94976 :95095和 LSC中1151 :1311)和psbA的3' -UTR(LSC中nts 1 :88)的玉蜀黍ptDNA表达调控序列 (pZmPrrnpsbA53)。质粒 pZMCP112 包含对应于 IRb 的 nts 94976 :96740 的 LBS1/RBS1 序列， 并且在End5的Y下游处（pZMCP112)。对于质体转化载体pZMCP150,调节/标记序列插入 在PZMCP112的Sail限制性位点处。质粒pZMCP113包含对应于IRb的nts 93476 :94976 的LBS2/RBS2序列，并且在End5的:V上游处。对于质体转化载体pZMCP152,，调节/标记 序列插入在PZMCP113的Sail限制性位点处。
[0165] 还通过限制性消化产生四种另外的线性在载体，并且检测在玉蜀黍、小麦和水稻 中的质体转化（图3, E-G)。TC2pZMCP152包含具有End5和最小RBS(27bp的区域）的 完整的LBS(图3E)。T3pZMCP152包含完整的RBS和最小的LBS(172bp)，没有End5(图 3F)。TC4pZMCP152包含完整的LBS和RBS区域，但是末端序列包含来自克隆质粒的113和 205bp (图3G)，由此模糊或"封闭" ptDNA的"真正的末端"。
[0166] 3.用于载体递送、玉蜀黍、小麦和水稻组织培养和质体转化的方法。将种子（玉米 (Zea mays)自交种B73,小麦（Triticum aestivum)品种中国春小麦，或日本水稻（Oryza sativajaponica)品种M104)在20%漂白剂（+1滴吐温20)中消毒30分钟，然后用无菌水 润洗几次。将种子浸泡2-5天，并且切下玉蜀黍胚。将完整的胚或3-4mm的玉蜀黍片放置 在含有lmg/L 2,4-D和0. 5mg/L BAP的N6琼脂板的中央并且放置在暗处。对于小麦和水 稻，将完好的或裂开露出胚的整个种子放置在N6平板上。在放置完好的胚后一天或在放置 胚片后3-10天（此时已经发育愈伤组织和/或芽），使用由环形或线性化载体包被的0. 3 或0. 4 μ m的金微载体进行粒子轰击。
[0167] 对于暗处生长的玉蜀黍的幼苗，将种子放置在含有MS琼脂的Magenta盒中，并且 在暗处生长1-3周。将茎杆（从基底分生组织节到第一片叶片的舌叶，LI)切成3-4_的 切片，并且放置在含有lmg/L 2,4-D和0. 5mg/L BAP的N6琼脂板上，并在暗处保持约1周。 然后，用具有环形或线性载体的〇. 3 μπι的金微载体进行生物弹道学。将平板和茎杆组织保 持在暗处，并且辨别愈伤组织、茎、和芽组织的生长。
[0168] 4.质体转化结果。关于GFP表达评估玉蜀黍组织的质体转化。通过手持激光器 (ex 405nm)和配有SYBR绿色滤光器（em 520nm)的解剖显微镜通过目测评估初始GFP表 达。在生物弹道学后3天内，在一些平板上辨别出具有推定的GFP-质体细胞的扇形叶片。 一般地，在生物弹道学后5-10天进行GFP表达的检查（表9和10)，并在平板的底部上标 记阳性组织的位置。选择单片的组织（通过激光器对GFP阳性的和阴性的两种）通过荧光 显微镜检查。在用环形和线性载体转化的玉蜀黍组织中观察到具有GFP-质体的细胞（表 10,图4和5)。为了进一步评估转化效率，将来自每个转化平板的一些组织片进行处理得到 ttDNA，并且通过用gfp-特异性引物进行的PCR扩增和与DIG-gfp探针的点印记杂交进行 评价（表9)。
[0169] 对于具有"真正的末端"的线性载体（图3D)和其中末端序列被"非真正的末 端" "封闭"的线性载体（在这种情形中，为克隆质粒的一部分）（图3G)评估质体转化的效 率。从载体转化的玉蜀黍组织制备原生质体，并且通过荧光显微镜评估GFP表达（表11)。 与环形和"非真正的末端"的线性载体相比，使用具有"真正的末端"的线性载体得到约2倍 更高的转化效率。转基因的整合可以通过对"真正的末端"、"非真正的末端"线性的和环形 的载体的双重相互性同源重组进行。然而，所述"真正的末端"的线性载体还能够通过末端 结合或链侵入进行整合。
[0170] 如上文关于玉蜀黍所述，通过小麦ttDNA的GFP荧光成像和DIG-gfp点印迹杂交 (表12)显示小麦和水稻（表12)的阳性转化。
[0171] 表1苔类植物细胞的质体转化
[0173] 3总轰击数：用于粒子轰击的具有苔类植物细胞的平板数。
[0174] bl°选择后的阳性转化体数：给出来自所有平板的绿色集落的平均数和单个平板 的范围。
[0175] ε转化效率：给出来自所有平板的每克细胞的绿色集落的平均数（转化体数目/~ 0. 2-0. 3g细胞）和单个平板的范围。
[0176] 表2苔类植物质体转基因整合的PCR和印迹杂交评估
[0178] a用于来自推定的转化体的总组织DNA的PCR扩增的引物组（见图1)。
[0179] 自推定的苔类植物转化体的总组织DNA与aadA基因探针的点印迹杂交。
[0180] ^所用的载体。来自一级（Γ )和二级（2° )选择的转化体。
[0181] dPCR扩增或aadA杂交为阳性的转化体数目/所检测的绿色集落的数目。
[0182] 6阳性转化体的百分数。
[0183] 表3使用TCpCS31 (aadA-RBS)进行苔类植物质体转化的PCR产物和基因整合的机 制