双链的核酸分子，其分离 自天然发生的基因，或者其经修饰含有并非天然存在的核酸区段。当核酸构建体含有表达 本发明的序列所需的控制序列时，术语核酸构建体与术语"表达盒"同义。
[0044] 术语"控制序列"在本文定义为包含本发明多核苷酸表达所必需或有益的所有成 分。每个控制序列对于所述多核苷酸序列均可以是天然的或外源的。最低限度，控制序列 包括启动子和转录终止信号。控制序列可以具有接头，以导入特异的限制位点，促进控制序 列与核苷酸序列连接。
[0045] 术语"可操作地连接"在本文定义为这样的构型，其中控制序列被适当地置于相对 于核酸构建体的核苷酸序列的位置，由此控制序列指导本发明的多核苷酸表达。
[0046] 在本文中，术语"表达"包括多核苷酸的转录。在本文中，术语"表达载体"涵盖线 性或环形的DNA分子，其包含本发明的多核苷酸，并与供其转录的其它区段可操作地连接。
[0047] 术语"植物"包括完整植物、幼苗营养器官/结构（例如叶、茎和块茎）、根、花和花 器/结构（例如花苞、萼片、花瓣、雄蕊、心皮、花药和胚珠）、种子（包括胚芽、胚乳和种皮） 及果实（成熟子房）、植物组织（例如维管组织、基本组织等）和细胞（例如保卫细胞、卵细 胞、毛状体等）及其后代。可用于本发明方法的植物的类别通常与适应转化技术的高等植 物和低等植物一样广泛，包括被子植物（单子叶植物和双子叶植物）、裸子植物、蕨类植物 和多细胞藻类。其包括各种倍性水平的植物，包括非整倍体、多倍体、二倍体、单倍体和半合 子。
[0048] 如本文所用，术语"异源"描述了两或更多个元件之间的关系，表示所述元件通常 在天然彼此并不接近。因此，例如，如果一个多核苷酸序列源自外来物种，或者如果源自相 同物种但是从其最初形式加以修饰，则其与生物体或第二多核苷酸序列是"异源的"。例如， 启动子可操作地连接的异源编码序列是指来自与启动子衍生的物种不同的物种的编码序 列，或者如果衍生自相同物种，则编码序列与启动子不天然相关联（例如遗传工程化的编 码序列或者来自不同生态型或品种的等位基因）。异源多肽的实例是在转基因生物体中从 重组多核苷酸表达的多肽。异源多核苷酸和多肽是重组分子形式。
[0049] 如本文所用，术语"转染"是指将核酸有意导入细胞中。转染包括技术人员已知的 将核酸导入细胞中的任何方法，包括但不限于农杆菌感染、生物射弹、电穿孔、显微注射等。
[0050] 如本文所用，术语"沉默增强子"是指这样的核酸片段，当与核酸沉默子分子可操 作地连接时，发挥提供更有效地沉默核酸沉默子分子靶的功能。
[0051] 如本文所用，术语"核酸沉默子分子"是指根据本发明的核酸构建体的一部分，其 包含靶植物内源基因的启动子区域。核酸沉默子分子被转录，开始产生单链RNA，其在植物 细胞中被加工产生小RNA(sRNA)，诱导靶植物内源基因的转录基因沉默。核酸沉默子分子可 以置于相对于核酸构建体的植物可操作启动子的有义方向或反义方向，或者其可以置于相 对于核酸构建体的植物可操作启动子的反向重复结构中。
[0052] 如本文所用，术语"单链有义沉默子"或者"单链S沉默子"是指由相对于启动子 是有义方向的核酸沉默子分子产生的单链RNA。
[0053] 如本文所用，术语"单链反义沉默子"或"单链AS沉默子"是指由相对于启动子是 反义方向的核酸沉默子分子产生的单链RNA。
[0054] 如本文所用，术语"反向重复沉默子"或者" IR沉默子"是指由具有两个拷贝的靶 内源基因启动子序列的核酸沉默子分子产生的RNA分子，一个拷贝相对于另一个拷贝是反 向的，优选由间隔物分开。
[0055] "降低的基因表达"是指与不含有核酸沉默子分子的植物细胞或植物相比，在含有 稳定整合在其基因组中的核酸沉默子分子的转基因植物细胞或转基因植物中，植物内源基 因的表达降低。"降低的基因表达"可包括植物内源基因的表达降低至少10%、至少20%、 至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至 少90%、至少95%或100%。
[0056] 如本文所用，"更有效的基因沉默"是指沉默增强子存在比不存在时靶基因的基因 沉默更有效。更有效的基因沉默可以通过测量基因表达降低的增加而测量。或者，更有效 的基因沉默可以通过来自核酸沉默子分子的sRNA产生的增加而测量。此外，更有效的基因 沉默可以通过核酸构建体的外显率（penetration rate)增加而测量。或者，更有效的基因 沉默可以通过脱靶效应降低而测量。技术人员也易于意识到其它可以测量的因子以确定更 有效的基因沉默。当与仅含有稳定整合在其基因组中的核酸沉默子分子的植物细胞或植物 相比，在含有包含与稳定整合在其基因组中的核酸沉默子分子可操作地连接的沉默增强子 的核酸构建体的植物或植物细胞中观测到由核酸沉默子分子导致更有效的基因沉默。在 基因表达降低增加的情况中，由与沉默增强子可操作地连接的核酸沉默分子所致的基因表 达降低大于至少5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至 少70%或更多。在由于与沉默增强子可操作地连接的核酸沉默分子所致的外显率增加的 情况中，增加至少100 %、至少150 %、至少200 %、至少250 %、至少300 %、至少350 %、至少 400%、至少450%、至少500%、至少550%、至少600 %或更多。
[0057] 因此，第一方面，本发明提供了包含本文所述的植物可操作启动子的核酸构建体， 所述植物可操作启动子与包含本文所述的沉默增强子的核酸分子可操作地连接，所述沉默 增强子与本文所述的核酸沉默子分子可操作地连接。所述核酸构建体可任选包含其它调节 序列，如3'调节序列，或者本文所述的其它序列。根据这个方面，本发明还提供了本文所述 的分离的沉默增强子和包含本文所述的植物可操作启动子的核酸构建体，所述植物可操作 启动子与包含本文所述的沉默增强子的核酸分子可操作地连接。在一些实施方案中，沉默 增强子是SUPPRESSOR OF ddc (SDC)的启动子区域。在一个实施方案中，沉默增强子包含 SEQ ID NO:6所示序列。在另一实施方案中，沉默增强子包含SEQ ID NO: 3所示序列。在进 一步的实施方案中，沉默增强子包含SEQ ID NO: 1所示序列的1-389位核苷酸及连续的并 且与第389位核苷酸在3'连续的任何数目的核苷酸。在一个实施方案中，沉默增强子包含 SEQ ID N0:1所示序列的1-390位核苷酸。在另一实施方案中，合成的启动子包含SEQ ID NO: 1所示序列的1-600位核苷酸。在另一个实施方案中，沉默增强子包含SEQ ID NO: 1所 示序列的1-709位核苷酸。在进一步的实施方案中，沉默增强子包含SEQ ID NO: 1所示序列 的1-810位核苷酸。在另一实施方案中，沉默增强子包含SEQ ID NO: 1所示序列的1-1000 位核苷酸。在另一个实施方案中，沉默增强子包含SEQ ID NO: 1所示序列的1-1120位核苷 酸。在进一步的实施方案中，沉默增强子包含SEQID NO: 1所示序列的1-1225位核苷酸。 在一个实施方案中，沉默增强子包含SEQ ID NO: 1所示序列的1-1346位核苷酸。在另一实 施方案中，沉默增强子包含SEQ ID NO: 1所示序列的1-1466位核苷酸。在另一个实施方案 中，沉默增强子包含SEQ ID NO: 1所示序列的1-1487位核苷酸。在进一步的实施方案中， 沉默增强子包含SEQ ID NO: 1所示序列的1-1592位核苷酸。在另一实施方案中，沉默增强 子包含SEQ ID NO: 1所示序列的1-1663位核苷酸。在进一步的实施方案中，沉默增强子包 含SEQ ID NO: 1所示序列的1-1730位核苷酸。在一些实施方案中，沉默阻抑基因包含SEQ IDN0:4、SEQIDN0 :5或SEQIDN0:18所示序列。这些沉默增强子的实例只是举例而言， 并例证了本发明人期望的包含具有SEQ ID NO: 1的1-389位核苷酸的389-1731个连续核 苷酸的任何沉默增强子。在一些实施方案中，沉默增强子包含SEQ ID NO: 1、SEQ ID N0:4、 SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 18所示序列。在其它实施方案中，沉默增强子由SEQ ID NO: 1、 SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO:6 或 SEQ ID NO: 18 所示序列组成。
[0058] 在一些实施方案中，沉默增强子是SUPPRESSOR OF ddc (SDC)的启动子区域。在 另一实施方案中，沉默增强子可包含与SEQ ID N0:l、3、4、5、6或18具有至少80%、81%、 82 %,83 %,84 %,85 %,86 %,87 %,88 %,89 %,90 %,91 %,92 %,93 %,94 %,95 %,96 %, 97 %、98%、99 %、或100 %序列相同性的核酸序列。沉默增强子可包含在严格条件下与包 含SEQ ID NO: 1、3、4、5、6或18的完全互补序列的DNA分子可杂交的核苷酸序列。沉默增 强子可包含核苷酸序列，其中所述核苷酸序列来自SEQ ID NO: 1、3、4、5、6或18,通过选自如 下的至少一种方法改变一或多个核苷酸：缺失、取代、添加和插入。沉默增强子可包含核苷 酸序列，其中所述核苷酸序列相应于SUPPRESSOR OF ddc(SDC)的启动子的等位基因。
[0059] 术语"在严格条件下"是指两个序列在中等或高度严格条件下杂交。更特别地， 中等严格条件可以由本领域技术人员例如根据DNA的长度确定。基本条件由Sambrook et al., Molecular Cloning:A Laboratory Manual, third edition,chapters 6and 7,Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001描述，包括使用针对硝化纤维滤膜的预洗绦溶液 5XSSC、0. 5% SDS、1. 0mMEDTA(pH 8. 0)，杂交条件为大约 50% 甲酰胺、2XSSC至 6XSSC，约 40-50°C (或者其它相似杂交溶液，如Stark' s溶液，大约50%甲酰胺，大约42°C )，以及 例如大约40-60°C、0. 5-6XSSC、0. 1% SDS的洗涤条件。优选地，中等严格条件包括在大约 50°C和6 X SSC杂交（和洗涤）。高度严格条件也可以由本领域技术人员例如根据DNA长度 确定。
[0060] 通常地，与中等严格条件相比，这个条件包括在较高温度和/或较低盐浓度下 杂交和/或洗涤（如在大约65°C、6XSSC至0. 2XSSC、优选6XSSC、更优选2XSSC、最 优选0. 2XSSC杂交）。例如，高度严格条件可包括如上所述的杂交，及在大约65-68°C、 0. 2XSSC、0. 1% SDS条件下洗涤。在杂交和洗涤缓冲液中，SSPE(1XSSPE是0. 15M NaCl、 10mMNaH2P04和l·25mMEDTA，pH7·4)可以代替SSC(lXSSC是0·15MNaCl和15mM柠檬 酸钠）；洗涤在完成杂交后进行15分钟。
[0061] 在一个实施方案中，本发明的核酸沉默子分子包含植物内源基因靶，即通过TGS 被负调节的植物内源基因的启动子区域。这个实施方案的核酸沉默子分子编码单链沉默子 或反向重复（IR)沉默子，其任一最初是从核酸构建体转录的RNA分子。单链沉默子和IR 沉默子在植物、植物组织和植物细胞中提供内源基因的TGS。在一个实施方案中，单链沉默 子是从植物内源基因靶（即核酸沉默子分子）的启动子区域产生的RNA分子，其相对于核 酸构建体中的植物可操作启动子是反义方向。在另一实施方案中，单链沉默子是从植物内 源基因靶（即核酸沉默子分子）的启动子区域产生的RNA分子，其相对于核酸构建体中的 植物可操作启动子是有义方向。在每个这些单链沉默子的实施方案中，构建体、核酸沉默子 分子和单链沉默子没有反向重复结构，即无反向重复结构或反向重复存在于所述核酸构建 体及由其产生的产物中。或者，在另一实施方案中，核酸沉默子分子是反向重复沉默子，并 且是从植物内源基因靶的启动子区域产生的RNA分子，其中RNA分子以一式两份提供，并排 列在核酸构建体的反向构型中。在一个实施方案中，在反向重复结构中的靶序列的一式两 份的拷贝由间隔物分开。在一个实施方案中，间隔物含有在植物细胞中起作用的内含子。 在另一实施方案中，间隔物是来自大豆7S启动子的片段。然而，可以预见间隔物不限于这 些特征，其可以是适于允许反向重复序列杂交的任何序列。这种间隔物序列例如是SEQ ID NO: 15。在一些实施方案中，核酸沉默子分子的表达产生初始的单链RNA。这个单链RNA通 过细胞机制或由于反向重复结构可以被转变为双链RNA。
[0062] 在一个实施方案中，启动子区域包含位于靶基因转录起始位点上游的核苷酸。在 另一实施方案中，启动子区域包含位于靶基因的转录起始位点上游的核苷酸及转录起始位 点下游的核苷酸。在一些实施方案中，启动子区域包含大约300至大约1500个核苷酸。在 其它实施方案中，启动子区域包含大约400至大约1200个核苷酸。在另外的实施方案中，启 动子区域包含大约425至大约1100个核苷酸。在进一步的实施方案中，启动子区域包含大 约425至大约1075个核苷酸。见2012年9月7日提交的美国临时专利申请61/698, 203， 所述专利申请以其全部内容并入本文作参考。
[0063] 在一个实施方案中，本发明的核酸沉默子分子包含植物内源基因靶，即通过TGS 被负调节的植物内源基因的启动子区域。在另一实施方案中，核酸沉默子分子包含在被负 调节的内源基因转录起始位点5'紧邻的2000个核苷酸，或者该2000个核苷酸的区域的片 段。所述片段可包含该区域的至少 100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、 1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900或2000个连续核苷酸，所述区域是被负调节 的内源基因的转录起始位点5'紧邻的2000个核苷酸。
[0064] 在一个实施方案中，sRNA在含有核酸沉默子分子的细胞中从表达的核酸沉默子分 子产生。在另一实施方案中，沉默增强子在含有与核酸沉默子分子可操作地连接的沉默增 强子的细胞中增强从表达的核酸沉默子分子产生sRNA。
[0065] 在植物中可操作的任何启动子均可用于核酸构建体中。在一些实施方案中，启动 子是植物可操作启动子的单一拷贝，包括本文所述的那些。在其它实施方案中，启动子是植 物可操作启动子的双拷贝，以产生同源双启动子。在进一步的实施方案中，启动子是两个不 同启动子的组合以产生异源双启动子。在一个实施方案中，植物可操作启动子是双35S CMV 启动子。在另一个实施方案中，植物可操作启动子是单一 35S CMV启动子。双35SCMV启动 子的序列在SEQ ID N0:16中示出。所述核酸构建体可进一步包含使得可以克隆核酸构建 体的序列或者促进剪切的序列。在一个实施方案中，另外的序列可以是3'序列，其在植物 中是可操作的。在另一实施方案中，3'序列衍生自TRV2(烟草脆裂病毒2)，其位于核酸沉 默子分子的下游。TRV23'序列的序列在SEQ ID NO: 17中示出。
[0066] 核酸构建体也可以包含植物可操作的3'调节序列。在一个实施方案中，植物可操 作的3'调节序列是polyA添加序列。在另一个实施方案中，polyA添加序列是NOS polyA 序列。
[0067] 第二方面，本发明提供了包含核酸构建体的转基因植物细胞。在一个实施方案中， 核酸构建体稳定整合在转基因植物细胞的基因组中。转基因植物细胞是通过用核酸构建体 转染植物细胞而制备的，使用本领域熟知的方法进行，包括但不限于本文所述的那些方法。 各种植物物种的植物细胞均可以用本发明的核酸构建体转染。含有所述核酸构建体的植物 细胞根据常规技术选择，包括但不限于本文所述的那些技术。使用本领域熟知的生长条件， 在适于核酸在转染的植物细胞中表达的条件下生长植物细胞。
[0068] 本发明可用于转染各种植物物种的植物细胞，包括但不限于单子叶植物和双子 叶植物D感兴趣的植物的实例包括但不限于玉米（Zea mays)，芸苔属（例如欧洲油菜 (B. napus)、芫菁（B. rapa)、芥菜（B. juncea))，特别是可用作种子油来源的那些芸苔属，紫 苜蓿（Medicago sativa)，水稻（Oryza sativa)，黑麦（Secale cereale)，高粱（Sorghum bicolor，Sorghum vulgare)，小米（例如黑粟（Pennisetum glaucum)，泰子（Panicum miliaceum)，粟（Setara italica)，龙爪稷（Eleusine coracana)，向日葵（Helianthus annuus)，红花（Carthamus tinctorius)，小麦（Triticum aestivum)，大豆（Glycine max)， 烟草（Nicotiana tabacum)，马铃薯（Solanum tuberosum)，花生（Arachis hypogaea)， 棉花(Gossypium barbadense, Gossypium hirsutum)，番暮(Ipomoea batatus)，木 薯（Manihot esculenta)，咖啡（Coffea spp·)，挪子（Cocos nucifera)，菠萝（Ananas comosus)，柑橘树（Citrus spp.)，可可（Theobroma cacao)，茶（Camellia sinensis)， 香蕉（Musa spp·)，鳄梨（Persea americana)，无花果（Ficus casica)，番石權（Psidium guajava)，芒果（Mangifera indica)，概榄（Olea europaea)，番木瓜（Carica papaya)， 腰果（Anacardium occidentale)，澳洲坚果（Macadamia integrifolia)，杏仁（Prunus amygdalus)，甜菜（Beta vulgaris)，甘薦（Saccharum spp.)，燕麦（Avena sativa),大麦 (Hordeum vulgare)，柳枝稷（Panicum virgatum)，蔬菜，观赏植物和针叶树^见美国专利 No. 7, 763, 773列举的可用于本发明中的另外的植物物种。
[0069] 蔬菜包括番前（Lycopersicon esculentum)，萬苣（例如 Lactuca sativa)，绿 豆(Phaseolus vulgaris)，利马豆(Phaseolus Iimensis)，豆宛豆(Lathyrus spp.)及 香瓜属成员如黄瓜（C. sativus)，香瓜（C. cantalupensis)，及甜瓜（C. melo) D观赏植 物包括杜 1$ (Rhododendron spp·)，绣球花（Macrophylla hydrangea)，木權（Hibiscus rosasanensis)，玫瑰（Rosa spp·)，郁金香（Tulipa spp·)，水仙（Narcissus spp·)，牵牛花 (Petunia hybrida)，康乃馨（Dianthus caryophyllus)，一品红（Euph