orbia pulchernima) 及菊花。可用于实施本发明的针叶树包括例如松树如火炬松（Pinus taeda)，湿地松（Pinus elliotii)，西黄松（Pinus ponderosa)，美国黑松（Pinus contorta)及福射松（Pinus radiata);花旗松（Pseudotsuga menziesil);西部铁杉（Tsuga canadensis);西加云 杉（Picea glauca);红杉（Sequoia sempervirens);冷杉如银杉（Abies amabilis)和香 脂冷杉（Abies balsamea);以及雪松如西方红色雪松（Thuja plicata)和阿拉斯加黄桧 (Chamaecyparis nootkatensis)〇
[0070] 第三方面，本发明提供了包含核酸构建体的转基因植物。在一个实施方案中，所述 核酸构建体稳定整合在转基因植物的基因组中。转基因植物从本文所述转基因植物细胞再 生，使用本领域技术人员熟知的常规技术通过各种途径进行，包括体细胞胚发生和器官发 生。可以培养通过植物转化技术包括上述那些技术获得的转化的植物细胞，以再生具有转 化的基因型及希望的表型的完整植物。这种再生技术通常依赖于在组织培养生长培养基中 对某些植物激素的操纵，典型依赖于与希望的核苷酸序列一起导入的标记。见例如美国专 利7, 763, 773、美国专利申请公开2010/0199371和国际公开的申请WO 2008/094127及其中 引用的参考文献。在适于转基因植物中核酸表达的条件下生长转基因植物，使用本领域熟 知的生长条件。
[0071] 第四方面，本发明提供了一种在植物、植物组织或植物细胞中通过转录基因沉默 更有效地沉默感兴趣的基因的方法，如更有效地沉默内源基因表达。在一个实施方案中，所 述方法包括用核酸构建体转染植物细胞以产生本文所述的转基因植物细胞。所述方法进一 步包括在本文所述的转基因植物细胞中表达如本文所述核酸沉默子分子。本文所述的表达 的核酸沉默子分子在转基因植物细胞中被切割，产生一或多个小RNA (sRNA)，其诱导转录基 因沉默，以降低感兴趣的靶基因的表达。在一些实施方案中，核酸沉默子分子的表达产生初 始的单链RNA。这个单链RNA通过细胞机制或由于反向重复结构可以被转变为双链RNA，之 后加工产生sRNA。所述方法可任选包括制备编码本文所述的核酸的核酸构建体。在另一实 施方案中，所述方法包括从转基因植物细胞再生转基因植物。在这个实施方案中，核酸沉默 子分子在转基因植物中表达。表达的核酸在转基因植物细胞中被切割，产生一或多个sRNA， 其诱导转录基因沉默，以降低感兴趣的靶基因的表达。
[0072] 根据本发明插入植物中的包含本文所述的沉默增强子和本文所述的核酸沉默分 子的核酸分子（感兴趣的核酸分子）对于转化过程不是关键的。通常地，被导入植物中的 感兴趣的核酸分子是本文所述构建体的一部分。所述构建体典型地包括与感兴趣的核酸分 子的5'端和/或与感兴趣的核酸分子的3'端可操作地连接的调节区。含有所有这些元件 的盒在本文也称作表达盒。表达盒可另外含有在表达盒构建体中的5'前导序列。调节区 (即启动子、转录调节区和转录终止区）对于宿主细胞或彼此可以是天然的/类似的。或 者，调节区对宿主细胞或彼此可以是异源的。见美国专利7, 205, 453和7, 763, 773,及美国 专利申请公开2006/0218670、2006/0248616和20090100536,及其中引用的参考文献。
[0073] 在植物可操作启动子控制下的感兴趣的核酸分子可以是本文定义的任何核酸分 子，并可通过转录基因沉默机制以负调节靶基因而用于改变其导入的植物的任何特性或性 状。靶基因可编码调节蛋白如转录因子等、结合或相互作用蛋白，或者改变转基因植物细胞 或转基因植物的表型性状的蛋白质。靶基因的负调节可以增强、改变或修饰植物的性状，如 农业学性状。农业学性状可涉及植物形态学、生理学、生长和发育、产量、营养、疾病或有害 生物抗性，或者环境或化学耐受性。在一些方面，所述性状选自水分利用效率、耐热性、产 量、氮利用效率、种子蛋白质、种子油和生物量。产量可包括在非应激条件下增加的产量及 在环境应激条件下增加的产量。应激条件可包括例如干旱、遮阳、真菌疾病、病毒疾病、细菌 疾病、昆虫侵袭、线虫侵袭、极端温度暴露（冷或热）、渗透压、减低的氮营养利用度、减低的 磷营养利用度和高植物密度。在一些实施方案中，感兴趣的核酸分子可用于修饰代谢途径， 如种子中脂肪酸生物合成或者脂质生物合成途径，或者改变植物病原体抗性。
[0074] 通常地，表达盒可另外包含选择标记基因以选择转化的细胞。选择标记基因用于 选择转化的细胞或组织。通常地，植物选择标记基因编码抗生素抗性，合适的基因包括至 少一系列编码抗生素壮观霉素抗性的基因、编码链霉素抗性的链霉素磷酸转移酶（SPt)基 因、编码卡那霉素或遗传霉素抗性的新霉素磷酸转移酶（nptll)基因、编码潮霉素抗性的 潮霉素磷酸盐转移酶（hpt或aphiv)基因、乙酰乳酸合酶（als)基因。或者，植物选择标记 基因编码除草剂抗性如对磺脲类除草剂、草铵膦、草甘膦、铵、溴苯腈、咪唑啉酮和2, 4-二 氯苯氧乙酸盐（2, 4-D)抗性，包括编码除草剂抗性的基因，其抑制谷氨酰胺合成酶如草丁 膦或basta(例如bar基因）作用。通常见国际公开WO 02/36782、美国专利7,205, 453 和 7, 763, 773 及美国专利申请公开 2006/0218670、2006/0248616、2007/0143880 和 20090100536 以及其中的参考文献。也见 Jefferson et al. (1991) ;De Wet et al. (1987); Goff et al. (1990) ;Kain et al. (1995)和 Chiu et al. (1996)。这个选择标记基因列表 无限制之意。任何选择标记基因均可使用。选择标记基因也在被转化的植物物种中可操作 启动子的控制下。这种启动子包括在国际公开WO 2008/094127及其中引用的参考文献中 描述的那些。也见美国专利申请公开2008/0313773和2010/0199371举例的可用于本发明 中的另外的标记。
[0075] 许多启动子可用于实施本发明。启动子可以基于希望的结果选择。即核酸可以 与组成型、组织优选的或者其它启动子组合以在感兴趣的宿主细胞中表达。这种组成型 启动子包括例如1^7117核心启动子（10 99/48338和美国专利6,072,050);核心0&]\^353 启动子（Odell et al·，1985);水稻 actin(McElroy et al·，1990);泛素 （Christensen and Quail, 1989 ；Christensen et al. , 1992) ；pEMU(Last et al. , 1991) ；MAS(Velten et al.，1984) ;ALS启动子（美国专利5, 659, 026)等。其它组成型启动子包括例如在美国 专利 5, 608, 149、5, 608, 144、5, 604, 121、5, 569, 597、5, 466, 785、5, 399, 680、5, 268, 463 和 5, 608, 142中公开的那些启动子。
[0076] 其它启动子包括可诱导启动子。可诱导启动子应答内源性或外源性刺激如化学化 合物（化学诱导剂）的存在或者应答环境、激素、化学和/或发育信号而选择性表达可操作 地连接的DNA序列。可诱导或调节的启动子包括例如由光、热、应激、洪溃或干旱、植物激 素、创伤、或者化合物如乙醇、茉莉酮酸酯、水杨酸或者安全剂调节的启动子。病原体可诱导 的启动子包括来自致病相关蛋白质（PR蛋白质）的那些启动子，其在病原体感染后被诱导， 例如PR蛋白、SAR蛋白、β-1，3-葡聚糖酶、壳多糖酶等。其它启动子包括在病原体感染位 点局部或附近表达的那些启动子。在进一步的实施方案中，启动子可以是创伤可诱导的启 动子。在其它实施方案中，通过外源化学调节物的应用，化学调节的启动子可用于调节植物 中基因的表达。启动子可以是可化学诱导的启动子，化合物的应用诱导基因表达，或者是可 化学阻抑的启动子，化合物的应用抑制基因表达。此外，组织优选的启动子可用于在特定植 物组织内靶向增强感兴趣的多核苷酸的表达。每个这些启动子均在美国专利6, 506, 962、 6, 575, 814、6, 972, 349 和 7, 301，069 及美国专利申请公开 2007/0061917 和 2007/0143880 中描述。也见美国专利申请公开2008/0313773和2010/0199371举例的可用于本发明中的 其它启动子。技术人员已知的可用于植物中的其它启动子也可用于本发明中。
[0077] 用于本发明启动子可包括：RIP2、mLIP15、ZmC0Rl、Rabl7、CaMV35S、RD29A、B22E、 Zag2、SAM合成酶、泛素 、CaMV 19S、nos、Adh、蔗糖合酶、R-等位基因、维管组织优选的启 动子S2A(Genbank登录号EF030816)和S2B(Genbank登录号EF030817)，以及来自玉米 (Zea mays)的组成型启动子G0S2。其它启动子包括根优选的启动子，如玉米NAS2启动 子、玉米Cyclo启动子（美国专利申请公开2006/0156439)、玉米R00TMET2启动子（国际 公开W005/063998)、CR1BI0启动子（国际公开W006/055487)、CRWAQ81启动子（国际公开 W005/035770)和玉米 ZRP2. 47 启动子（NCBI 登录号：U38790 ;GI No. 1063664)。在一些实 施方案中，使用的启动子是双启动子，例如双CaMV 35S启动子。本文公开的任何启动子以 及本领域技术人员已知可用于植物中的其它启动子的双启动子均可用于本发明中。
[0078] 在制备表达盒时，各种DNA片段可以经处理以提供处于适当方向及适当阅读框中 (酌情）的DNA序列。为此，可以应用衔接子（adapter)或接头以连接DNA片段，或者可以 包括其它处理以提供方便的限制位点，除去过多的DNA，除去限制位点等。为此，可以包括体 外诱变、引物修复、限制、退火、重取代，例如可以包括转换和颠换。
[0079] -旦已经将核酸克隆进表达载体中，可以使用常规转化（或转染）程序将其导入 植物细胞中。术语"植物细胞"意在涵盖来自植物的任何细胞，所述植物包括未分化的组织 如愈伤组织和悬浮培养物，以及植物种子、花粉或者植物胚胎。适于转化的植物组织包括叶 组织、根组织、分生组织、原生质体、胚轴、子叶、盾片、苗端、根、未成熟胚、花粉和花药。"转 化"是指通过外部应用重组DNA直接修饰细胞基因组，导致其摄取并整合进对象细胞基因组 中。以此方式，可以获得遗传修饰的植物、植物细胞、植物组织、种子等。
[0080] 本发明的DNA构建体可用于转化任何植物。构建体可以通过各种常规技术导入希 望的植物宿主的基因组中。转化各种高等植物物种的技术为本领域熟知，并在科技文献中 描述。转化方案可以根据靶向转化的植物或植物细胞的类型（即单子叶植物或双子叶植 物）而不同，这为本领域技术人员熟知。例如，DNA构建体可以使用如电穿孔和显微注射植 物细胞原生质体等技术直接导入植物细胞的基因组DNA中，或者DNA构建体可以使用生物 射弹方法，如DNA粒子轰击直接导入植物组织中。或者，DNA构建体可以与合适的T-DNA侧翼 区组合并导入常规的根瘤土壤杆菌（Agrobacterium tumefaciens)宿主载体中。当细胞感 染细菌根瘤土壤杆菌时，根瘤土壤杆菌宿主的毒力作用将指导构建体及相邻标记插入植物 细胞DNA中。因此，可以应用提供有效转化/转染的任何方法。见例如美国专利7, 241，937、 7, 273, 966和7, 291，765及美国专利申请公开2007/0231905和2008/0010704及其中引用 的参考文献。也见国际公开申请WO 2005/103271和W02008/094127及其中引用的参考文 献。也见美国专利申请公开2008/0313773和2010/0199371举例的针对可用于本发明中的 各种植物物种的转化方案。
[0081] 可以培养通过上述任何转化技术衍生的转化植物细胞以再生具有转化的基因型 及希望的表型的完整植物，例如转基因植物。"转基因植物"是其中已导入外来DNA的植物。 "转基因植物"包含有性或无性繁殖的其所有后代、杂种和杂交体（cross)，并且其继续携带 所述外来DNA。再生技术依赖于在组织培养生长培养基中一些植物激素的操作，典型地依赖 于与希望的核苷酸序列一起导入的杀生物剂和/或除草剂标记。参见，例如国际申请公开 WO 2008/094127及其引用的参考文献，和美国专利申请公开2010/0199371。
[0082] 前述转化方法典型用于产生转基因品种，其中表达盒被稳定掺入。在表达盒被稳 定掺入转基因植物中之后，其可以通过有性杂交转移到其它植物中。在一个实施方案中，转 基因品种可以然后与另一个（非转化或转化）品种杂交，以产生新的转基因品种。或者，已 使用前述转化技术工程化到特定棉花品系中的遗传性状可以用植物育种领域熟知的传统 回交技术移到另一品系中。例如，回交途径可以用于将工程化性状从公共非良种移到良种 中，或者从基因组中含有外来基因的品种移到不含有该基因的一或多个品种中。如本文所 用，"杂交"根据上下文可以指简单的X和Y杂交，或者回交过程。根据杂交物种，可以使用 任何标准育种技术。
[0083] -旦产生这种类型的转基因植物，植物本身可以根据常规程序栽培。转基因种子 当然可以从转基因植物中回收。这些种子然后可以种植在土壤中并用常规程序栽培以产生 转基因植物。栽培的转基因植物会表达本文描述的核酸，并且其被切割产生sRNA。
[0084] 在第五方面，本发明提供了鉴别和获得植物TGS的其它沉默增强子的核酸构建体 和方法。根据这个方面，所述核酸构建体是适合转化希望鉴别沉默增强子的植物物种的核 酸构建体。在一个实施方案中，所述核酸构建体可以包括在载体中。在一些实施方案中，载 体适合农杆菌介导的转化。在其它实施方案中，载体可以适合于生物射弹介导的转化。其 它用于植物转化的合适载体是本领域技术人员熟知的。在另一个实施方案中，所述核酸构 建体可以根据本领域技术人员熟知的技术直接用于转化植物。所述核酸构建体包含植物可 操作启动子，所述植物可操作启动子可操作地连接于推测的沉默增强子，所述推测的沉默 增强子可操作地连接于本文所述的核酸沉默子分子，所述核酸沉默子分子可操作连接于植 物可操作3'调节区。
[0085] 在一个实施方案中，被测试沉默增强子活性的多核苷酸是来自非拟南芥物种的 SUPPRESSOR OF ddc (SDC)的同系物的启动子区。SDC同系物可以来自单子叶或双子叶植物。 SDC的同系物可以选自：玉米、大豆、向日葵、高粱、芸苔、小麦、紫花苜蓿（alfalfa)、棉花、 水稻、大麦、粟、甘蔗和柳枝稷（switchgrass)。在另一个实施方案中，推测的沉默增强子或 待被测试增强转录基因沉默的多核苷酸是被高水平内源性24nt SiRNA沉默的并且高度甲 基化的基因座的启动子区。在一个实施方案中，植物可操作启动子是单个启动子、双同源性 启动子或者双异源性启动子。在一个实施方案中，植物可操作启动子是单或双35S CMV启动 子。在一个实施方案中，3'序列是TRV23'序列。在另一个实施方案中，3'调节区是polyA 添加序列。在一个实施方案中，PolyA序列是NOS poly A序列。测试更有效沉默可以根据 本领域熟知方法进行。这些方法包括但不限于RT_PCR、PCR、northern印迹分析、免疫学测 定和酶学测定。在一些实施方案中，靶启动子的甲基化状态可以通过McrBc酶消化测定。在 其它实施方案中，染色质修饰状态通过利用针对组蛋白甲基化或乙酰化位点的抗体的免疫 学测定进行测试。在进一步的实施方案中，基因产物的量被确定。待被测试更有效沉默感 兴趣基因的启动子区的片段的测试可以根据本发明描述的方法进行。
[0086] 进一步根据这个方面，合适的沉默增强子通过包括以下步骤的方法鉴别：制备核 酸构建体，所述核酸构建体包含本文所述的推测的沉默增强子和核酸沉默子分子，用所述 核酸构建体转化感兴趣植物物种的细胞或组织，及确定推测的沉默增强子是否更有效地沉 默测试的内源基因。如果测试的内源基因被更有效地沉默，则所述推测的沉默增强子被鉴 别为TGS的沉默增强子。在一个实施方案中，所述确定是通过培养转化的植物细胞表达核 酸沉默子分子及测试培养的转化植物细胞或组织中的转录基因沉默而进行。在另一个实施 方案中，所述确定是通过从转化的植物细胞或组织再生植物并测试转化植物中的转录基因 沉默而进行的。转化植物的再生是根据本领域技术人员熟知的技术进行。测试沉默可以根 据本领域熟知方法进行。这些方法包括但不限于RT_PCR、PCR、northern印迹分析、免疫学 测定和酶学测定，以及本文所述的其它方法。
[0087] 除非另有说明，本发明的实施采用化学、分子生物学、微生物学、重组DNA、 遗传学、免疫学、细胞生物学、细胞培养和转基因生物学的传统技术，其属于本 领域技术范围内，参见例如 Maniatis et al.，1982，Molecular Cloning(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York) ;Sambrook et al.，1989,Molecular Cloning, 2nd Ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York) ；Sambrook and Russell，2001，Molecular Cloning, 3rd Ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor, New York)； Green and Sambrook，2012,Molecular Cloning,4th Ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor, New York) ；Ausubel et al.,1992), Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley&Sons, including periodic updates)； Glover， 1985,DNA Cloning(IRL Press，Oxford) ;Russell， 1984,Molecular biology of plants: a laboratory course manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor, N. Y. ) ;Anand，Techniques for the Analysis of Complex Genomes, (Academic Press, New York, 1992) ；Guthrie and Fink, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology(Academic Press,New York,1991)； Harlow and Lane， 1988,Ant