0cm处铺设水肥管理管路，垄间设立宽25?30cm深7?1cm的区域便于排水和管理人员行走，培育园四周留下约50?60cm的空区；
2、应用适合高原的农业园艺栽培技术对高寒植物苗进行水肥管理，视当月降水量情况每年5?11月，每个月喷淋水一至四次，使15cm深度的土壤含水量保持在28?43 %，每个月在一次喷水中按水:尿体积比为100: 6?100: 18浓度加入牛羊尿或人尿；每年5月施放一次有机牛粪肥或羊粪肥，施放为干重每平方米160?240g ;
3、利用原生态温湿度及光照条件，促进培育园内原有的高寒植物苗旺盛生长；或者再将高寒植物苗培育园以外的钩蝠蛾幼虫食料植物和/或其种子移栽补充到培育园中栽培，或者再将快速扩繁的高寒植物组培苗移栽到高寒植物苗培育园中，使之与高寒植物苗培育园内原有植被一同旺盛生长获得高寒植物苗；
4、从冬虫夏草适生地采集新鲜冬虫夏草或其子囊孢子，采用合适嗜低温菌物的工业微生物方法进行分离纯化，经分子生物学方法或形态学方法鉴定为中国被毛孢(Hirsutellasinensis)，通过常规低温发酵法在13±5°C条件下发酵为冬虫夏草菌中国被毛孢菌丝体及分生孢子或芽生孢子，并进一步将菌丝体及分生孢子或芽生孢子按发酵物与水体积比1: 150?1: 900稀释成悬浮液，作为冬虫夏草菌源；或直接采用冬虫夏草的新鲜子囊孢子稀释制成每毫升含有150?900个子囊孢子的悬浮液，作为冬虫夏草菌源；
5、将制备的冬虫夏草菌源接种到培育园栽培的高寒植物苗组织上，每平方米喷施300?500ml菌悬液，连续喷施I?7天，每天喷施I?3次，喷施后遮阴，利用每年5?11月原生态温湿度条件，共生培育7?30天，增大高寒植物组织中中国被毛孢的共生量，激活冬虫夏草菌中国被毛孢的侵染活性；采用显微镜检查共培养的冬虫夏草菌中国被毛孢菌丝与高寒植物根、叶、茎组织缠绕形成共生体，经分子检验为中国被毛孢后，将共生体组织直接作为具有高侵染活性的冬虫夏草菌种；亦可是将获得的共生体组织切成5?20_小段，制备成具有高侵染活性的冬虫夏草菌种，用遮阴保水保鲜方法于2?4°C保存备用。
[0021]本发明方法获得的具有高侵染活性的冬虫夏草菌种可用于高效侵染钩蝠蛾幼虫。使用时，可直接冬虫夏草寄主钩蝠蛾幼虫投置到冬虫夏草菌中国被毛孢与高寒植物苗形成共生体的培育区，亦可将制备的高侵染活性冬虫夏草菌种投喂冬虫夏草寄主钩蝠蛾幼虫，使寄主幼虫取食并充分接触冬虫夏草菌种，从而被高效侵染。在寄主钩蝠蛾幼虫取食接触冬虫夏草菌种7?15天后，采用显微镜检查及分子生物方法检测钩蝠蛾幼虫血淋巴中的中国被毛孢虫菌体，经统计，钩蝠蛾幼虫被中国被毛孢侵染率约为86.1?95%。
[0022]所述采用合适嗜低温菌物的工业微生物方法进行分离纯化所用的分离培养基可以是察氏培养基、或马铃薯培养基、或肉汤培养基、或酵母浸出粉胨葡萄糖培养基、或高氏一号培养基中的一种。所述的常规低温发酵法可以是固体发酵，或是液体发酵，或是固液双相发酵。所述固体发酵可以是大麦、小麦、大米、玉米等常规农作谷物中的一种或多种作为固体培养基。所述液体发酵可以是普通肉汤、或蛋白胨水、或酵母提取物等常规底料中的一种或多种作为液体培养基。所述固液双相发酵可采用深层发酵产生菌丝或芽生孢子后，在固体培养基上再继续发酵的方法，其培养基可以是上述固体发酵培养基和液体发酵培养基中的一种。
[0023]所述的尚寒植物苗可以是尚寒植物培育园内尚寒草甸原有植被，亦可是将米集的高寒植物和/或种子移栽在培育园内；所述高寒植物的种类包括青绿苔草、膨囊苔草、东俄洛紫菀、黑褐苔草、一岁苔草、发草、裂叶蓝钟花、大萼蓝钟花、舌叶垂头菊、高山嵩草、大花嵩草、西藏嵩草、矮生嵩草、线叶嵩草、西藏厚棱芹、斑唇马先蒿、草甸马先蒿、西藏糙苏、长果车前、细茎寥、叉枝寥、珠芽寥、圆穗寥、狭叶圆穗寥、头花寥、穆坪耳蕨、楔叶委陵菜、纤细委陵菜、多头委陵菜、大萼委陵菜、多裂委陵菜、西藏委陵菜、杂色钟报春、高原毛茛、云生毛茛、西藏大黄、小大黄、双齿风毛菊、禾叶风毛菊、星状凤毛菊、卵叶风毛菊、钩柱唐松草、柔软点地梅、高山唐松草和长果婆婆娜中的一种或多种。
[0024]本发明所述冬虫夏草寄主钩蝠蛾包括曲线钩蝠蛾、赭褐钩蝠蛾、白线钩蝠蛾、德氏钩虫留蛾、虫草钩幅蛾、斜脉钩幅蛾、棒木钩幅蛾、康姬钩幅蛾、白马钩幅蛾、贝卩戛钩幅蛾、人支钩蝠蛾、芒康钩蝠蛾、草地钩蝠蛾、锈色钩蝠蛾、白纹钩蝠蛾、甲郎钩蝠蛾、中支钩蝠蛾、美丽钩蝠蛾、循化钩蝠蛾、白带钩蝠蛾、巴青钩蝠蛾、当雄钩蝠蛾、玉树钩蝠蛾、宽兜钩蝠蛾、双带钩蝠蛾、拉脊蝠蛾、比如钩蝠蛾、纳木钩蝠蛾、日喀则钩蝠蛾、永胜钩蝠蛾、定结钩蝠蛾、南木林钩蝠蛾、亚东钩蝠蛾、蒲氏钩蝠蛾、小金钩蝠蛾、色季拉钩蝠蛾、加查钩蝠蛾中的一种或多种。
[0025]以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化，均落入本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种在高寒草甸原生态条件下制备冬虫夏草菌种的方法，其特征在于:在那曲地区羌塘草原冬虫夏草适生地区域的高寒草甸及生态环境下，利用其原有高寒植被植株，以10?20mX10?20m大小为建设单位，建立高寒植物苗培育园，利用原生态温湿度及光照条件，通过适合高原的农业园艺栽培技术进行水肥管理，栽培并获得冬虫夏草寄主钩蝠蛾幼虫取食的高寒植物苗；将冬虫夏草菌源接种到培育园栽培的高寒植物苗组织上，利用每年5?11月原生态温湿度条件，遮阴使冬虫夏草菌中国被毛孢与活体高寒植物共生培育，形成菌物-植物共生体，将菌丝检测结果为中国被毛孢的菌物-植物共生体作为对寄主钩蝠蛾幼虫具有高侵染活性的冬虫夏草菌种。2.根据权利要求1所述的一种在高寒草甸原生态条件下制备冬虫夏草菌种的方法，其特征在于:所述高寒植物苗培育园内采用通常农业园艺规划方法进行分区建垄，垄面大小为50?90cmX500?1900cm，在垄面中间上方高40?90cm处铺设水肥管理管路，垄间设立宽25?30cm深7?1cm的区域便于排水和管理人员行走，培育园四周留下约50?60cm的空区。3.根据权利要求1所述的一种在高寒草甸原生态条件下制备冬虫夏草菌种的方法，其特征在于:所述通过适合高原的农业园艺栽培技术进行水肥管理是:每年5?11月，每个月喷淋水一至四次，使15cm深度的土壤含水量保持在28?43%，每个月在一次喷水中按水:尿体积比为100: 6?100: 18浓度加入牛羊尿或人尿；每年5月施放一次有机牛粪肥或羊粪肥，施放为干重每平方米160?240g。4.根据权利要求1所述的一种在高寒草甸原生态条件下制备冬虫夏草菌种的方法，其特征在于:从冬虫夏草适生地采集新鲜冬虫夏草或其子囊孢子，采用合适嗜低温菌物的工业微生物方法进行分离纯化，经分子生物学方法或形态学方法鉴定为中国被毛孢，通过常规低温发酵法在13±5°C条件下发酵为冬虫夏草菌中国被毛孢菌丝体及分生孢子或芽生孢子，并进一步将菌丝体及分生孢子或芽生孢子按发酵物与水体积比1: 150?1: 900稀释成悬浮液，作为冬虫夏草菌源；或直接采用冬虫夏草的新鲜子囊孢子稀释制成每毫升含有150?900个子囊孢子的悬浮液，作为冬虫夏草菌源。5.根据权利要求1所述的一种在高寒草甸原生态条件下制备冬虫夏草菌种的方法，其特征在于:所述栽培并获得冬虫夏草寄主钩蝠蛾幼虫取食的高寒植物苗的方法为:利用原生态温湿度及光照条件，促进培育园内原有的高寒植物苗旺盛生长；或者再将高寒植物苗培育园以外的钩蝠蛾幼虫食料植物和/或其种子移栽补充到培育园中栽培，或者再将快速扩繁的高寒植物组培苗移栽到高寒植物苗培育园中，使之与高寒植物苗培育园内原有植被一同旺盛生长获得高寒植物苗。6.根据权利要求1所述的一种在高寒草甸原生态条件下制备冬虫夏草菌种的方法，其特征在于:所述“将冬虫夏草菌源接种到培育园栽培的高寒植物苗组织上，利用每年5?11月原生态温湿度条件，遮阴使冬虫夏草菌中国被毛孢与活体高寒植物共生培育”的接种及共生培育的方法是:将制备的冬虫夏草菌源喷淋接种到高寒植物苗培育园栽培的高寒植物苗上，每平方米喷施300?500ml菌悬液，连续喷施I?7天，每天喷施I?3次，共生培育的时间为7?30天，温湿度条件为当地青藏高原5?11月自然温湿度值，共生培育时遮阴培育。
【专利摘要】本发明公开了一种在高寒草甸原生态条件下制备冬虫夏草菌种的方法,利用那曲地区羌塘草原高寒草甸原有植被及生态条件，通过构建冬虫夏草菌中国被毛孢与活体高寒植物组织的共生体，增大高寒植物组织中国被毛孢的共生量，激活中国被毛孢的侵染活性，得到对寄主钩蝠蛾幼虫具有高侵染活性的冬虫夏草菌种，达到高效侵染寄主钩蝠蛾幼虫的目的，将冬虫夏草菌源接种到培育园栽培的高寒植物苗组织上，利用每年5～11月原生态温湿度条件，遮阴使冬虫夏草菌中国被毛孢与活体高寒植物共生培育，形成菌物-植物共生体，将菌丝检测结果为中国被毛孢的菌物-植物共生体作为对寄主钩蝠蛾幼虫具有高侵染活性的冬虫夏草菌种。
【IPC分类】A01G1/04
【公开号】CN105009938
【申请号】CN201510396355
【发明人】周洁
【申请人】成都易创思生物科技有限公司
【公开日】2015年11月4日
【申请日】2015年7月8日