专利名称：冬虫夏草无性世代菌种发酵滤液、发酵物及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种中国冬虫夏草无性世代菌种发酵产物，特别涉及一种中国冬虫夏草无性世代菌种发酵物及其中的发酵滤液、以及其在制备保健食品和药品中的应用。
背景技术：
中药——中国冬虫夏草(Cordyceps sinensis(Berk.)Sacc.)，又名冬虫草，民间通常又简称虫草，是中国冬虫夏草无性世代菌种——蝙蝠蛾被(多)毛孢(Hirsutella hepiali Chen et Shen sp.Nov)，寄生在蝙蝠蛾幼虫体上而形成的真菌门Eumycota、子囊菌亚门Ascomycotina、核菌纲Pyrenomycetes、麦角菌目Clavicipitales、麦角菌科Clavicinitaccae虫草属Cordyceps一个种。冬虫夏草为我国独有，仅分布于我国青藏高原海拔3000-5000米之间的高山草甸和高山灌丛带。因其生态习性的特殊性使其稀少而珍贵。
冬虫夏草是虫草属的一个种。全世界已报道虫草属真菌300种以上，我国报道近90种。虫草属的真菌可寄生在各种昆虫的幼虫、蛹、成虫甚至茧上，虫草形态呈现千姿百态。因此“虫草”只是虫草属广义的统称，除冬虫夏草外，其它所有虫草均不能称之为冬虫夏草。
中华民族把冬虫夏草作为保健食品和药品已有一千多年的历史，冬虫夏草与人参、鹿茸同被誉为中国中药三大“宝”，被历代医家称为“理诸虚百损”的上品。近一千年来，中国的中医药文献都记载了冬虫夏草的功效归经。《中华人民共和国药典》记载其功效为“补肺益肾、止血化痰。用于久咳虚喘、劳嗽咳血、阳痿遗精、腰膝酸痛。”随着现代医药研究的深入，冬虫夏草的功效和药理作用机理正在被揭开。尤其是通过对免疫异常(免疫变态反应)状态下调节，在不同状态下体现的免疫增强或免疫抑制作用。
因此，利用通过生物学鉴定(即在人工合成培养基上可以长出与天然冬虫夏草一样的子座、子囊孢子的鉴定)的中国冬虫夏草无性世代菌种，如中国冬虫夏草无性世代菌种蝙蝠蛾被(多)毛孢(Hirsutella hepiali Chen et Shensp.Nov.)，经微生物发酵培养所产生的发酵产物，提供一种与天然冬虫夏草相似甚至更强作用的产品，用于替代天然冬虫夏草在保健、预防和治疗上使用，将具有十分重要的意义(参见中国专利97110448.4)。
二十世纪八十年代，本发明人之一完成了该菌种的微生物液体发酵培养，并利用了菌丝体，经干燥制成药品，能够部分地替代了冬虫夏草，其药品——百令胶囊(批准文号国药准字Z10910036)，已经在临床上广泛使用。但那时候由于条件的限制，没有对发酵滤液和其中的有效成分进行进一步的研究，发酵滤液被弃去不用，浪费了大量的资源，同时又污染了环境。因此，通过本发明对中国冬虫夏草无性世代菌种发酵滤液进行开发利用，对资源的有效利用和环境的保护将有非常积极的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的中国冬虫夏草无性世代菌种发酵物及其中的发酵滤液，以及其临床应用。
本发明的目的是通过下列技术方案来实现的一种中国冬虫夏草无性世代菌种的发酵滤液，其由下列方法制得，该方法包括步骤1)中国冬虫夏草无性世代菌种蝙蝠蛾被(多)毛孢在培养基上发酵，获得菌丝体、以及含有发酵上清液和其中的各种代谢产物的发酵滤液的；其特征在于该方法还包括下列步骤2)将步骤1)中的发酵产物经固液分离和/或膜分离出菌丝体后得到该发酵滤液。
在膜分离之后还可进一步进行溶媒分离和色层柱分离得到本发明发酵滤液的有效成分。
将上述各方法步骤制得的发酵滤液与分离出的菌丝体混合匀浆，并喷雾干燥而制成本发明的发酵物。
本发明的发酵物、发酵滤液可以应用于调节免疫方面。具体而言，可以制备用于免疫变态反应性疾病(IV、III、II、I型)如移植排斥反应、系统性红斑狼疮、特发性血小板减少症紫癜、过敏性鼻炎和哮喘等免疫变态反应性等疾病，及呼吸系统、肾脏、肝脏、器官移植后的排异反应等免疫异常疾病及术后恢复、疲劳综合症的预防、治疗和保健产品，也可用于制备补肺益肾，止血化痰，久咳虚喘，劳嗽咯血，阳痿遗精，腰膝酸痛，诸虚百损的预防、治疗和保健产品。
为了便于应用，可以将上述的发酵物、发酵滤液经纯化、干燥成复合制品或单一制品，采用公知的方法，制成各种剂型，如片剂、胶囊剂、丸剂、散剂、颗粒剂、锭剂、膏剂、贴剂、糖浆剂、合剂或气雾剂。
图1显示受试样品及地塞米松对Sephadex(塞发待克思)G 200诱导小鼠腹腔嗜酸性和中性粒细胞聚集反应的抑制作用。
图2显示受试样品及地塞米松对小鼠腹腔白细胞总数的抑制作用。
具体实施例方式
实施例1本发明的发酵滤液的制备中国冬虫夏草无性世代菌种蝙蝠蛾被(多)毛孢在液体培养基上发酵，获得发酵上清液、菌丝体及其中的各种代谢产物；发酵方法为斜面菌种培养、摇瓶种子培养、一级、二级种子罐培养、液体发酵罐发酵中通气培养，10-18℃，pH6.0-7.5分别培养30-60、10、6、6、6-12天。分离方法为发酵产物经(或未经)固液分离，运用方法包括但不限于板框离心机、压滤等手段，也可以运用膜分离替代前者或在其之后再进行膜分离等方法制得本发明的发酵滤液。获得的发酵滤液为棕黄色透明液体，pH值5.0-7.0，其中所有的干物质量为0.1-2.0％，包括多糖和有机化合物等物质。
上述中国冬虫夏草无性世代菌种蝙蝠蛾被(多)毛孢的发酵过程请参见中国专利97110448.4。
实施例2本发明的发酵滤液的制备在实施例1基础上运用常规的溶媒分离和等色层柱分离(含膜分离)得到本发明富含有效成分的发酵滤液。
实施例3本发明的发酵物的制备将上述实施例1及2的本发明的发酵滤液浓缩，浓缩液与菌丝体混合、匀浆、喷雾干燥成中国冬虫夏草无性世代菌种发酵物。
实施例4含本发明的发酵滤液、发酵物的药物的制备将上述实施例1、2、3中获得的产品，经纯化、干燥成复合制品或单一制品，采用公知的方法，加入适当的辅助成分，制成各种剂型，如片剂、胶囊剂、丸剂、散剂、颗粒剂、锭剂、膏剂、贴剂、糖浆剂、合剂、气雾剂或注射剂。
试验实施例1取ICR小鼠50只，雌雄各半，体重20±2克，共分5组，分别为空白组、模型组、样品1、2组和阳性对照药地塞米松组(DXM)。
样品制备受试样品1、2分别为中国冬虫夏草无性世代菌种蝙蝠蛾被(多)毛孢(Hirsutella hepiali Chen et Shen sp.Nov)的发酵菌丝体粉和发酵液，样品1口服剂量为3g/kg/d，与中药冬虫夏草记载的最低有效剂量3g/d一致，实验结果显示口服中国冬虫夏草无性世代菌种的发酵菌丝体干粉3g/d时，具有抗炎、抗过敏作用；样品2口服该菌种的发酵滤液22.2ml/kg/d，即本批次生产3g该菌种的发酵菌粉时，同时产生22.2ml的该菌种的发酵液的浓缩液(计算如下本批发酵菌粉得率0.54％，即由555毫升的冬虫夏草发酵液中得到的，扣去20％的菌丝体体积，发酵液体积为444毫升，然后浓缩至1/20，即22.2ml)所以，每公斤口服给冬虫夏草菌粉3g与给22.2ml是指在同一发酵液体积中的两个部分产物的比较，其生物活性具有可比性。
给药剂量与途径样品1(3g/kg/d)；样品2(22.2ml/kg/d)。致炎前每天灌胃给药1次，连续3天。致炎后每天灌胃给药1次，连续2天。灌胃给药的容积均为0.5ml/10g。空白组不作处理；模型组生理盐水0.5ml/10g灌胃，每天1次，连续5天；阳性对照药地塞米松(DXM，1mg/kg/d)腹腔注射，每天1次，连续5天。
动物致炎第4次给药前致炎。空白组不作处理。模型组、给药组及阳性对照药组，均用Sephadex G 200(0.1mg/ml)腹腔注射，每只小鼠2mg/kg。
腹腔灌洗于腹腔致炎48h后采用颈椎脱臼法处死小鼠。每只小鼠腹腔注射灌洗液5ml，轻揉片刻后吸出腹腔灌洗液。
白细胞计数将腹腔灌洗液摇匀后取出40μl，用白细胞稀释液稀释8倍，取少量滴于细胞计数板上，在显微镜下计数白细胞总数。
白细胞分类计数将腹腔灌洗液低温2000rpm离心10min后，弃去上清液，用移液器打匀后涂片。待涂片在室温下干后，Wright染色5～6min。用自来水小心将染料冲洗干净，在光学显微镜40倍镜下进行白细胞分类计数。
图1显示受试样品及地塞米松对Sephadex G 200诱导小鼠腹腔嗜酸性和中性粒细胞聚集反应的抑制作用。统计学处理x±SD；与空白组比较###P＜0.001，与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01。
图2显示受试样品及地塞米松对小鼠腹腔白细胞总数的抑制作用。统计学处理x±SD；与空白组比较##P＜0.01，与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01。
结果Sephadex G 200(2mg/kg)腹腔注射引起小鼠腹腔炎症细胞聚集，与空白对照组比较白细胞总数约升高2.5倍，其中嗜酸性和中性粒细胞比例大幅上升，与空白对照组比较约30倍。这些结果表明，Sephadex G 200主要诱导嗜酸性和中性粒细胞聚集。这种聚集反应均可被受试样品明显抑制。受试样品的抑制嗜酸性和中性粒细胞聚集作用强度为样品2＞1，与模型组比较均有显著性差异(P＜0.05～0.01)，见图1。受试样品抑制白细胞总数的作用强度为样品2＞1，其中样品2与模型组比较均有显著性差异(P＜0.01)，见图2。阳性对照药地塞米松腹腔注射对嗜酸性和中性粒细胞聚集以及白细胞总数均有显著抑制作用。
结论1、受试样品的抑制嗜酸性和中性粒细胞聚集作用强度与模型组比较均有显著性差异，样品2(P＜0.01)＞1(P＜0.05)。
2、受试样品2抑制白细胞总数的作用强度与模型组比较呈显著性差异，样品1抑制白细胞总数的作用强度与模型组比较无显著性差异，作用强度，样品2(P＜0.05)＞样品1(P＞0.05)。
试验实施例2大鼠同种异体皮肤移植实验也证明中国冬虫夏草无性世代菌种蝙蝠蛾被(多)毛孢的发酵滤液的抗排斥的活性大于发酵菌丝体，移植皮肤没有出现变硬、结痂、青黑现象。
试验实施例3发酵产物小鼠急性毒性试验昆明种小鼠10只，中国冬虫夏草无性世代菌种发酵物及发酵滤液以20g/kg的剂量，一天三次灌胃给药，给药前禁食12小时，结果动物死亡率为0，未见其它毒性反应，小鼠的最大耐受量(MTD)为20g/kg。
由上述公开的内容可见，本发明的中国冬虫夏草无性世代菌种发酵产物对免疫异常疾病显著的调节和治疗作用，且无毒副作用，制备方法简单，易于大规模工业化生产，可望解决中国冬虫夏草这一药用资源从自然界获取所受到限制的问题。
权利要求
1.一种中国冬虫夏草无性世代菌种的发酵滤液，其由下列方法制得，该方法包括步骤1)中国冬虫夏草无性世代菌种蝙蝠蛾被(多)毛孢在培养基上发酵，获得菌丝体、以及含有发酵上清液和其中的各种代谢产物的发酵滤液；其特征在于该方法还包括下列步骤2)将步骤1)中的发酵产物经固液分离和/或膜分离出菌丝体后得到该发酵滤液。
2.根据权利要求1所述的发酵滤液，其特征在于在膜分离之后还进行溶媒分离和色层柱分离。
3.一种中国冬虫夏草无性世代菌种的发酵物，其由根据权利要求1或2的发酵滤液与分离出的菌丝体混合匀浆，并喷雾干燥而制成。
4.根据权利要求1或2所述的中国冬虫夏草无性世代菌种的发酵滤液在制备免疫调节药物或保健品中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于该药物或保健品为片剂、胶囊剂、注射剂、丸剂、散剂、颗粒剂、锭剂、膏剂、贴剂、糖浆剂、合剂或气雾剂型。
6.根据权利要求3所述的中国冬虫夏草无性世代菌种的发酵物在制备免疫调节药物或保健品中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于该药物或保健品为片剂、胶囊剂、注射剂、丸剂、散剂、颗粒剂、锭剂、膏剂、贴剂、糖浆剂、合剂或气雾剂型。
全文摘要
本发明提供了一种中国冬虫夏草无性世代菌种的发酵物及其中的发酵滤液、以及其临床应用。本发明将现有中国冬虫夏草无性世代菌种蝙蝠蛾被(多)毛孢经发酵获得的发酵产物，包括菌丝体、发酵滤液和其中的各种代谢产物，经(或未经)固液分离、膜分离、固液混合匀浆、喷雾干燥得本发明的发酵物，或经溶媒分离和色层柱分离(含膜分离)得到本发明发酵滤液的有效成分，纯化、干燥成复合制品或单一化合物，可制备成各种剂型。用于呼吸系统、肾脏、肝脏、器官移植后的排异反应等免疫异常疾病、术后恢复、疲劳综合症的预防、治疗和保健，也可用于补肺益肾，止血化痰，久咳虚喘，劳嗽咯血，阳痿遗精，腰膝酸痛，诸虚百损的预防、治疗和保健。
文档编号C12N1/14GK1712517SQ20041002551
公开日2005年12月28日 申请日期2004年6月25日 优先权日2004年6月25日
发明者柯传奎, 郭新军, 谢强敏, 陈黎, 张泳华 申请人:柯传奎, 郭新军