专利名称：螺旋式微通道聚合酶链式反应芯片的制作方法
技术领域：
本发明涉及的是一种聚合酶链式反应芯片，特别是一种螺旋式微通道聚合酶链式反应芯片。用于预防医学与卫生领域。
背景技术：
在分子生物学的化学分析系统中，聚合酶链式反应是至关重要的组成环节，微机电技术(MEMS)的发展使聚合酶链式反应可以在芯片上完成。一般的微通道式聚合酶链式反应芯片，用三个温度区分别控制变性、复性、延伸三个反应步骤，制作于芯片上的微流通道循环经过这三个温度区的反复变化，使使通道内参予反应的混合试剂中，脱氧核糖核酸(DNA)分子的片段在微流通道中流动时获得几何级数级扩增。微通道式聚合酶链式反应芯片是当前聚合酶链式反应芯片研究的热点，研究结果表明微通道式聚合酶链式反应芯片以其自身结构的特点克服了微室静态反应芯片加热缓慢、难以用于批量进样和交叉污染的困难，使分子化学分析中的效率大大提高，可以广泛应用于生物医学、预防医学与环境监测等领域。
聚合酶链式反应的效率与试剂在变性、复性、延伸三个环节的温度和时间密切相关，试剂经历的循环温度变化过程与聚合酶链式反应温度曲线吻合的程度在很大程度上影响产物的生成效率，但是，当前微通道式聚合酶链式反应芯片在微流路的设计上始终不尽合理，在多数的设计中，都会使微流体通道在经过三个温度区后返回过程中，不可避免的经过一段中间等待期，它不仅使试剂中的微量脱氧核糖核酸DNA分子片段在经历变性、复性、延伸三个温度变化时无法完整符合聚合酶链式反应温度曲线，也降低了聚合酶链式反应的速度，不利于扩增效率，。经文献检索发现，Ivonne Schneegaβ等人在《Reviews in MolecularBiotechnology》(《分子生物学评论》)2001，82101-121上发表的“Flow-throughpolymerase chain reactions in chip thermocyclers”(微通道式聚合酶链式反应芯片)，该文中提到的聚合酶链式反应芯片TC1997具有25个循环通道，采用减少中间等待期流体通道的截面积的设计，通道内流体流速得到了提高，然而，由于改变微流管道截面积，微通道内会产生阻碍聚合酶链式反应的气泡，另外，由于其流速的不均匀性，这种微通道式聚合酶链式反应芯片无法应用于批量进样的需要，事实上，这种设计无法用于实际应用中。文中还提到了几种结构的微通道式聚合酶链式反应芯片，虽然改进了热区的设计布局，利用特殊工艺和材料提高了扩增效率，但在流体通道和三个温度区的空间安排上与TC1997都存在相同的缺点，不利于高效率聚合酶链式反应需要。
发明内容
本发明的目的在于针对现有聚合酶链式反应芯片的温度区设计不足和微通道布局不合理的缺陷，提出一种螺旋式微通道聚合酶链式反应芯片，通过改变片上微流路布局和温度区布局，使试剂在芯片上流动时，经历的温度变化符合聚合酶链式反应的扩增曲线，从而提高扩增的产率，解决了背景技术中存在的问题。
本发明是通过以下技术方案来实现的。本发明芯片包括密封盖层，带有微流通道的基底层、试剂样品输出口、试剂样品输入口，螺旋式微流通道、绝缘层以及金属引线层、环形温度传感器、复性区散热区以及环形变性区加热器、环形延伸区加热器。其连接方式为带有微流通道的基底层上的微流通道为螺旋式微流通道，带有微流通道的基底层与密封盖层以键合技术密封在一起，在密封盖层设有试剂样品输入口、试剂样品输出口，试剂样品输入口、试剂样品输出口分别与通道起点、通道终端相对应，带有微流通道的基底层的另一侧设有环形变性区加热器、环形延伸区加热器以及环形温度传感器，另外金属薄膜形成的复性区散热区位于芯片右下方，在芯片的绝缘层和带有微流通道的基底层之间，负责在复性区温度区的过高时参予强制散热，带有微流通道的基底层上沉积绝缘层和金属引线层。
螺旋式微流体通道，在布局上分内环带微流体通道和外环带微流体通道，内环带微流体通道在芯片中心区域，负责试剂预加热和反转录聚合酶链式反应时反转录酶的失活，外环带微流体通道与位于芯片底部的各个温度加热器相对应，分为变性区、复性区、延伸区。
带有微流通道的基底层和密封盖层组成芯片的基本结构，在芯片底部设有试剂预加热区加热器、变性区环形薄膜加热器、复性区散热区、延伸区环形薄膜加热器，试剂样品在螺旋式微流通道上运动时，稳定的流经预加热区、变性区、复性区、延伸区，其温度通过位于芯片下部的各区环形薄膜加热器和环形温度传感器监控，倍增产物样品由试剂样品输出口导出。为了平滑试剂样品流动，螺旋式微流通道在拐点区段的衔接处设计了圆角。
本发明中，基底上的螺旋式微流体通道在布局上分内环带和外环带，内环带微流体通道的作用是试剂在内环带微流体通道流动时，经过试剂预加热区加热器的作用，在进入循环前获得充分解链，提高产率，而对于另一种特别聚合酶链式反应-反转录聚合酶链式反应，在反应过程中，混入液态试剂样品中的反转录酶会抑制聚合酶链式反应，当试剂从内环带微流体通道流动时，利用试剂预加热区的加热过程可以令反转录酶失活，使其不至于进入扩增反应环节。而外环带微流体通道由变性区、复性区、延伸区构成，当试剂依次流过各区时，位于芯片下部的各区集成环形薄膜加热器会循环加热和冷却试剂，使聚合酶链式反应的循环过程得以进行。
螺旋式微流通道的中心区域即内环带微流体通道底部设有预加热区加热器，而与外环带微流体通道变性区、延伸区相对应的是环形变性区加热器、环形延伸区加热器和环形温度传感器，螺旋式微流通道的各个拐点区段的衔接处采用圆角平滑试剂样品流动，预加热区加热器和环形变性区加热器、环形延伸区加热器均为环形。
本发明将现有聚合酶链式反应芯片中运载试剂样品的逶迤式微管道变换成螺旋式微管道。试剂在预加热、变性区、复性区、延伸区的加热时间由热区面积、流体的流速和微通道在片上的形状来决定，螺旋式微通道在基底上的形状由系列渐开线参数决定，各热区的温度调节由位于芯片底部的各区集成环形薄膜加热器和环形传感器来实现，螺旋式微通道的内环周长小于外环，液态试剂样品从试剂样品输入口注入后，先进入内环带微流体通道，开始扩增进程，随着试剂内靶序列浓度的升高，试剂开始进入外环带微流体通道，在负责聚合酶链式反应的三个温度区的加热时间也随之延长，倍增后产物由位于螺旋微通道外环末端的试剂样品输出口流出。芯片下部的环形薄膜加热器和环形传感器由计算机进行精确控制保证芯片上聚合酶链式反应的进行。本发明可以进一步减小芯片体积，从而使其更容易整合进入拥有综合分析处理能力的芯片集总分析系统内。
本发明用玻璃和聚二甲基硅氧烷(PDMS)两种材质制作封装成形，利用软光刻工艺在PDMS上制作出具有螺旋式微流体通道的基底，与玻璃封盖封装后使其密闭，玻璃封盖上的试剂样品输入口、试剂样品输出口负责试剂的输入和产物的输出，微通道层的基底下即芯片下部集成了环形薄膜加热器和环形传感器控制温度，薄膜加热器和传感器采用溅射铂金属(Pt)或铟锡氧化物(ITO)薄膜来实现。在集成环形薄膜加热器和环形温度传感器上再形成绝缘层，最后布引线和电极。
本发明具有实质性的特点和进步，本发明改变了已有微通道聚合酶链式反应芯片的流体通道布局，使热区的分布更趋合理，样品试剂得温度循环更接近扩增温度曲线，因而提高了扩增效率。通过设计内环预加热区流体通道，和芯片下部与内环通道相应薄膜加热器和传感器，扩大了本芯片的使用范围，增强芯片的效率，同时缩小了芯片体积，提高了芯片的兼容性和可集成性。
图1本发明结构示意2本发明左视图分解示意3本发明右视图分解示意4本发明螺旋式微流路通道结构示意5本发明环形薄膜加热器结构示意图具体实施方式
如图1、2、3、4、5所示，本发明包括密封盖层1，带有微流通道的基底层2、螺旋式微流通道4、试剂样品输出口6、试剂样品输入口7、绝缘层12以及金属引线层13、环形温度传感器18、复性区散热区19以及环形变性区加热器21、环形延伸区加热器22，其连接方式为带有微流通道的基底层2上的微流通道为螺旋式微流通道4，带有微流通道的基底层2与密封盖层1封装为一体，在密封盖层1设有试剂样品输入口7、试剂样品输出口6，试剂样品输入口7、试剂样品输出口6分别与通道起点14、通道终端16相对应，带有微流通道的基底层2的另一侧设有环形变性区加热器21、环形延伸区加热器22以及环形温度传感器18，另外金属薄膜形成的复性区散热区19位于芯片右下方，如图3，在芯片的绝缘层12和带有微流通道的基底层2之间，负责在复性区温度区的过高时参予强制散热，带有微流通道的基底层2上沉积绝缘层12和金属引线层13。
如图2、4，螺旋式微流体通道4，在布局上分内环带微流体通道和外环带微流体通道，内环带微流体通道在芯片中心区域，负责试剂预加热和反转录聚合酶链式反应时反转录酶的失活，外环带微流体通道与位于芯片底部的各个温度加热器相对应，分为变性区、复性区、延伸区。
螺旋式微流通道4的中心区域即内环带微流体通道底部设有预加热区加热器20，而与外环带微流体通道变性区、延伸区相对应的是环形变性区加热器21、环形延伸区加热器22和环形温度传感器18。预加热区加热器20和环形变性区加热器21、环形延伸区加热器22均为环形。螺旋式微流通道4的各个区段的拐点区段的衔接处采用圆角5、15、17设计以平滑试剂样品流动。
本发明采用了多层结构模式，带有微流通道的基底层2和密封盖层1形成芯片的基本结构，芯片下部为试剂预加热区加热器10和控制变性区温度的环形薄膜加热器9、控制复性区散热的薄膜加热器11、控制延伸区温度的薄膜加热器8，试剂样品在螺旋式微流通道4上运动时，依次流过变性、复性、延伸区，位于芯片下部的相应加热器和传感器控制温度，最终的倍增产物样品由试剂样品输出口6导出。
权利要求
1.一种螺旋式微通道聚合酶链式反应芯片，包括密封盖层(1)，带有微流通道的基底层(2)、螺旋式微流通道(4)、试剂样品输出口(6)、试剂样品输入口(7)、绝缘层(12)以及金属引线层(13)、环形温度传感器(18)、复性区散热区(19)以及环形变性区加热器(21)、环形延伸区加热器(22)，其特征在于，带有微流通道的基底层(2)上的微流通道为螺旋式微流通道(4)，带有微流通道的基底层(2)与密封盖层(1)封装为一体，在密封盖层(1)设有试剂样品输入口(7)、试剂样品输出口(6)，试剂样品输入口(7)、试剂样品输出口(6)分别与通道起点(14)、通道终端(16)相对应，带有微流通道的基底层(2)的另一侧设有环形变性区加热器(21)、环形延伸区加热器(22)以及环形温度传感器(18)，另外金属薄膜形成的复性区散热区(19)位于芯片右下方绝缘层(12)和带有微流通道的基底层(2)之间，带有微流通道的基底层(2)上沉积绝缘层(12)和金属引线层(13)。
2.根据权利要求1所述的螺旋式微通道聚合酶链式反应芯片，其特征是，采用了多层结构模式，带有微流通道的基底层(2)和密封盖层(1)形成芯片的基本结构，芯片下部为试剂预加热区加热器(10)和控制变性区温度的环形薄膜加热器(9)、控制复性区散热的薄膜加热器(11)、控制延伸区温度的薄膜加热器(8)。
3.根据权利要求1所述的螺旋式微通道聚合酶链式反应芯片，其特征是，所述的螺旋式微流体通道(4)，在布局上分内环带微流体通道和外环带微流体通道，内环带微流体通道在芯片中心区域，负责试剂预加热和反转录聚合酶链式反应时反转录酶的失活，外环带微流体通道与位于芯片底部的各个温度加热器相对应，分为变性区、复性区、延伸区。
4.根据权利要求1或3所述的螺旋式微通道聚合酶链式反应芯片，其特征是，所述的螺旋式微流通道(4)的内环带微流体通道底部设有预加热区加热器(20)，与外环带微流体通道变性区、延伸区相对应的是环形变性区加热器(21)、环形延伸区加热器(22)和环形温度传感器(18)，预加热区加热器(20)和环形变性区加热器(21)、环形延伸区加热器(22)均为环形。
5.根据权利要求1或3所述的螺旋式微通道聚合酶链式反应芯片，其特征是，所述的螺旋式微流通道(4)的各个拐点区段的衔接处采用圆角(5、15、17)平滑试剂样品流动。
全文摘要
一种螺旋式微通道聚合酶链式反应芯片，用于预防医学与卫生领域。本发明带有微流通道的基底层上的微流通道为螺旋式微流通道，带有微流通道的基底层与密封盖层以键合技术密封在一起，在密封盖层设有试剂样品输入口、试剂样品输出口，分别与通道起点、通道终端相对应，带有微流通道的基底层的另一侧设有环形变性区加热器、环形延伸区加热器以及环形温度传感器，金属薄膜形成的复性区散热区位于芯片右下方绝缘层和带有微流通道的基底层之间，带有微流通道的基底层上沉积绝缘层和金属引线层。本发明提高了扩增效率，扩大了芯片的使用范围，增强芯片的效率，同时缩小了芯片体积，提高了芯片的兼容性和可集成性。
文档编号C12P19/00GK1584043SQ20041002470
公开日2005年2月23日 申请日期2004年5月27日 优先权日2004年5月27日
发明者陈文元, 贾晓宇, 牛志强, 张卫平 申请人:上海交通大学