一种调控盾叶薯蓣三倍体植株生根的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物三倍体植株生根方法技术领域，具体涉及一种调控盾叶薯蓣三倍 体植株生根的方法。
【背景技术】
[0002] 盾叶薯截（ZVascoreaC.H.Wright)是薯截科薯截属多年生草本 植物，俗称黄姜，以干燥根茎入药，根茎中10%左右为薯蓣皂苷(含量最高为16. 5%)(秦松 云，丁季春，舒抒，余再柏，李泉森.中国盾叶薯蓣资源现状及保护对策.资源开发 与市场，2004，20，263-265.)，是世界上皂苷元含量最高的植物。薯蓣皂苷元具有降血 月旨、抗衰老、抗肿瘤、治疗骨质疏松、保护肝脏、抗糖尿病和消炎等功能。
[0003]多倍体基因的剂量效应，可以使其营养器官变大，有效成分增加，抗逆性增强等， 所以药用植物多倍体育种已成为一条很好的优良品种选育的有效途径。三倍体育种是以营 养器官为药用部位的植物多倍体育种的一种有效途径。因为它不仅具有多倍体植株所具有 的优良性状，而且还因其减数分裂行为异常而多败育，降低了植物的生殖能耗，有利于营养 生长和有效成分的积累（LewisWH(鲍文奎等译）.多倍体在植物和动物中的地位.贵阳： 贵州人民出版社，1984 :293-294)。
[0004]近年来，对盾叶薯蓣的研究主要集中在有效成分的提取和药理的研究等。含有皂 苷元的药物逐渐被开发，在临床上的应用越来越广泛。然而由于人们对于盾叶薯蓣资源不 合理的开发与利用，导致其生产能力满足不了市场的需求，因此运用组织培养技术开发出 新品种有望解决产量和质量问题，其中利用胚乳培养的方法获得三倍体植株，能够有效的 改善盾叶薯蓣品质、提高盾叶薯蓣的产量及有效成分含量，具有十分重要的现实意义。前期 我们研究室通过盾叶薯蓣的胚乳培养诱导出了愈伤组织，并从愈伤组织分化了再生芽，采 用李懋学和张柿方(李懋学，张柿方.植物染色体研究技术.哈尔滨：东北林业大学出 版社.1991，6-48)方法对再生芽的腋芽生长点进行鉴定获得了三倍体再生芽，获得的三 倍体再生芽很难生根，在培养基上茎基部膨大，时间长了茎芽枯黄。采用1/2MS+ 0.3mg/ LNAA能够使生根率达到90%，但生根所需时间较长，培养15天后才有明显的根长出，45天后 才能达到移栽状态，移栽成活率仅为80%。为了使其快速生根，根数增多，根长增加，移栽成 活率升高，我们对其生根促进剂进行了研究探索。
[0005]銳皮留酮（ecdysterone，EDS)B卩β-虫兑皮留酮，1954 年，Butenandt等从 500kg香 蛹中分离出250mg最初的昆虫变态活性物质銳皮酮（ecdysone)。此后，在许多种植物中分 离出多种类似的物质。人们发现，蜕皮激素在植物界的分布不仅较动物界高，而且广，资源 丰富，如怀牛膝、川牛膝、桑叶、白毛夏枯草、泽泻、罗汉松、紫杉、乌毛蕨及紫箕等药用植物 中均含有其类似物，涉及到低等植物厥类、裸子植物、被子植物等80个科的植物类群中。动 物实验表明EDS能促进核酸及蛋白质合成、调节糖代谢、促进脂肪代谢、调苄基因表达、改 善免疫功能、影响中枢神经及心血管系统和促进细胞增殖、分化等，因此被认为有"更生诱 导物质（reviveinducer)"的作用。銳皮留酮易溶于乙醇，用乙醇很容易将其提取。研究 发现牛膝的醇提物以及醇提物的乙酸乙酯萃取物(主要成分为m)s)对成骨样细胞有显著的 促进增殖作用（高晓燕，王大为，李发美，姜志.牛膝提取物对成骨样细胞增殖的作用. 2000a，17 (3): 201-213,高晓燕，王大为，李发美.牛膝中脱皮留酮的含量测定及促成 骨样细胞增殖活性.药学学报，2000b，35(11): 868-870)，在人表皮干细胞增殖过程中也 有显著促进作用，是促进创面愈合的主要机制（李国芳.蜕皮留酮促进人表皮干细胞增殖 的初步研究[D]，广州：南方医科大学，2009)。也有研究发现，DES可促进人脐静脉血管内皮 细胞（HUVEC)由静止期和（或）DNA合成前期进入DNA合成期、由DNA合成期进入DNA合成 后期和(或）分裂期，对HUVEC增殖具有促进作用（吴旭.蜕皮留酮的内皮保护作用及其机 理研究[D]，广州：第一军医大学，2006)。
[0006] 通过对近五十年有关EDS的研究报道的总结发现，相关研究主要集中在分离鉴 定、化学结构和对动物的作用及其机制，另外在不同植物中的分布、积累和测定方法等方面 的研究也较多，而对植物本身的作用方面尚未见报道。缘于EDS在动物上有促进细胞增殖、 分化等的作用，本研究将其运用到盾叶薯蓣三倍体植株生根上，以期找到一种调控盾叶薯 蓣三倍体植株快速生根的有效方法。
【发明内容】
[0007] 本发明解决的技术问题是提供了一种调控盾叶薯蓣三倍体植株生根的方法，所建 立的盾叶薯截三倍体植株生根方法不仅生根快而且生根率尚，根数较多，根长较长，同时对 地上部分生长也有明显的促进作用，易于移栽成活，移栽成活率高达100%。
[0008] 本发明为解决上述技术问题采用如下技术方案，一种调控盾叶薯蓣三倍体植 株生根的方法，其特征在于具体步骤为：选取生长健壮的盾叶薯蓣三倍体再生芽，在超 净工作台上切成2-3cm长的带芽茎段，接种到培养基中，该培养基包括1/2MS+0. 3mg/L ΝΑΑ+0. 24-0. 96mg/L蜕皮留酮+30000mg/L蔗糖+7500mg/L琼脂粉，培养基pH值为 5. 8-6. 0， 在无菌条件下进行培养，培养条件为：温度22-24°C，光/暗=16h/8h，相对湿度80%-90%，光 照强度 2000-3000LX。
[0009] 进一步优选，所述的培养基包括1/2MS+0. 3mg/LNAA+0. 48mg/L蜕皮甾酮 +30000mg/L蔗糖+7500g/L琼脂粉。
[0010] 进一步优选，所述的蜕皮甾酮是从药用植物怀牛膝、川牛膝、桑叶、白毛夏枯草、泽 泻、罗汉松、紫杉、乌毛蕨或紫箕中提取的。
[0011] 本发明与现有技术相比较，对盾叶薯蓣三倍体植株生根的促进作用显著，具体表 现为缩短开始生根时间的同时，平均根长和平均生根数显著增加、移栽成活率也显著提高。 本发明中蜕皮留酮来源于植物，存在于80个科的植物类群中，并且易于提取、定量。因此具 有广阔的应用前景。
【具体实施方式】
[0012] 以下通过实施例对本发明的上述内容做进一步详细说明，但不应该将此理解为本 发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容实现的技术均属于本发 明的范围。 实施例
[0013] 材料和方法 1.1材料 供试材料为进行过染色体数目、形态学、细胞学、生理生化、同工酶鉴定的盾叶薯蓣三 倍体再生植株。
[0014] 1. 2 方法 生根实验：超净工作台上，将盾叶薯蓣三倍体再生植株切成2-3cm长的带芽茎段，接种 到 1/2MS+0. 3mg/LΝΑΑ+0. 24-0. 96mg/L蜕皮留酮+30000g/L蔗糖+7500g/L琼脂粉的培养基 中，培养基pH值为5. 8-6. 0,无菌条件下进行培养，蜕皮留酮的浓度分别设置为0. 24、0. 48、 0. 72、0. 96mg/L，以不添加蜕皮留酮的培养基为对照。培养条件为：温度22-24°C，光/暗 =18h/6h，相对湿度 80%-90%，光照强度 2000-3000LX。
[0015] 每种培养基20瓶，每瓶接种4株，每4瓶为一个重复。观察开始生根时间，即有明 显根开始长出的时间。培养30天后，统计生根率、根数、根长等。
[0016] 移栽实验：待生根培养至30天后，用自来水冲洗去根部培养基，水培2-3天，移栽 到m(泥炭土）：m(蛭石）为1:1的基质中，正常管理。在温室中培养30天后，统计成活率。
[0017] 1. 3数据处理 数据处理用SPSS13.0。采用"Duncan"法进行平均数多重比较。
[0018] 实验结果 不同浓度蜕皮留酮处理对盾叶薯蓣三倍体植株生根及移栽成活率的影响见表1。
[0019] 表1不同浓度的蜕皮留酮溶液对盾叶薯蓣三倍体植株生根及移栽成活率的影响 (30 天）
注：同一列数据后不同小写字母表示表示在/^ 0. 05水平上达到显著差异。
[0020] 由表1可以看出：与对照①号培养基相比，添加0. 24-0. 96mg/L蜕皮甾酮都促进了 盾叶薯蓣三倍体植株的生根，具体体现在：开始生根时间提前，最多可提前5天；生根率显 著提高，最高可达100%，每个茎段平均根数增加，最多可达大约26条，其中多lcm根(对移栽 成活非常重要）所占比率也大幅提尚，最尚达85%。
[0021] 由表1还可以看出，与对照①号培养基相比，添加0. 24-0. 96mg/L蜕皮甾酮也促进 了盾叶薯蓣三倍体植株地上部分的生长，具体表现在：显著增加了株高，最大株高3. 92cm; 显著增加单株叶片数，叶片数最多为4. 85个。
[0022] 添加蜕皮留酮对盾叶薯蓣三倍体植株生根和地上部分生长的的促进作用也显著 影响了其移栽成活，使其移栽成活率大幅提高，最高可达1〇〇%。这对于其规模化生产具有重 要意义。
[0023] 以上实施例描述了本发明的基本原理、主要特征及优点，本行业的技术人员应该 了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原 理，在不脱离本发明原理的范围下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进均落入 本发明保护的范围内。
【主权项】
1. 一种调控盾叶薯蓣三倍体植株生根的方法，其特征在于具体步骤为：选取生长健壮 的盾叶薯蓣三倍体再生芽，在超净工作台上切成2-3cm长的带芽茎段，接种到培养基中，该 培养基包括 1/2MS+0. 3mg/LΝΑΑ+0. 24-0. 96mg/L蜕皮留酮 +30000mg/L蔗糖 +7500mg/L琼 脂粉，培养基pH值为5. 8-6. 0,在无菌条件下进行培养，培养条件为：温度22-24Γ，光/暗 =16h/8h，相对湿度 80%-90%，光照强度 2000-3000LX。2. 根据权利要求1所述的调控盾叶薯蓣三倍体植株生根的方法，其特征在于：所述的 培养基包括 1/2MS+0. 3mg/LΝΑΑ+0. 48mg/L蜕皮留酮 +30000mg/L蔗糖 +7500mg/L琼脂粉。3. 根据权利要求1所述的调控盾叶薯蓣三倍体植株生根的方法，其特征在于：所述的 蜕皮甾酮是从药用植物怀牛膝、川牛膝、桑叶、白毛夏枯草、泽泻、罗汉松、紫杉、乌毛蕨或紫 箕中提取的。
【专利摘要】本发明公开了一种调控盾叶薯蓣三倍体植株生根的方法，其特征在于具体步骤为：选取生长健壮的盾叶薯蓣三倍体再生芽，在超净工作台上切成2-3cm长的带芽茎段，接种到培养基中，该培养基包括1/2MS+0.3mg/L？NAA+0.24-0.96mg/L蜕皮甾酮+30000mg/L蔗糖+7500mg/L琼脂粉，培养基pH值为5.8-6.0，在无菌条件下进行培养，培养条件为：温度22-24℃，光/暗=16h/8h，相对湿度80%-90%，光照强度2000-3000Lx。本发明对盾叶薯蓣三倍体植株生根的促进作用显著，具体表现为缩短开始生根时间的同时，平均根长和平均生根数显著增加、移栽成活率也显著提高。
【IPC分类】A01H4/00
【公开号】CN105248283
【申请号】CN201510750174
【发明人】赵喜亭, 李金亭, 陈明霞, 李俊华, 蒋丽薇, 李明军
【申请人】河南师范大学
【公开日】2016年1月20日
【申请日】2015年11月9日