一种改良型甘蓝型油菜萝卜细胞质雄性不育恢复系及其改良方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于作物育种技术领域，具体涉及一种改良型甘蓝型油菜萝卜细胞质雄性 不育恢复系及其改良方法。
【背景技术】
[0002] 萝卜细胞质雄性不育恢复系（oguracytoplasmicmalesterility，oguraCMS) 在 1968 年首次在萝卜（Raphanussativus)资源中被发现（OguraH.Studiesonthe malesterilityinJapaneseradishwithspecialreferencetotheutilization ofthissterilitytowardsthepracticalraisingofhybridseed[J].MemFac AgricKagoshimaUniv，1968,6:39 - 78·)，其不育性稳定彻底，是由细胞质中线粒体 嵌合基因 0rfl38 (BrownGG，FormanovaN，JinH，etalTheradishRforestorergene ofOguracytoplasmicmalesterilityencodesaproteinwithultiplepenta tricopeptiderepeats[J].PlantJ,2003,35(2):262 - 272. ；DesloireS,GherbiH,Laloui W，etal.Identificationofthefertilityrestorationlocus,Rfo,inradish，a samememberofthepentatricopeptide-repeatproteinfamily[J].EMBORep, 2003, 4(6):588 - 594.)和一对隐性细胞核基因（rfrf)共同控制（BonhommeS，BudarF， LancelinD，etal.SequenceandtranscriptanalysisoftheNco2. 50gura-specific fragmentorrelatedwithcytoplasmicmalesterilityinBrassicahybrids[J].Mol GenGenet，1992, 235 (2) :340 - 348.)的。
[0003]因为所有甘蓝型油菜品种均可以很好地保持其不育性，所以被认为是转育高产、 高含油量油菜不育系的首选途径。但由于油菜品种中不存在OguraCMS系的恢复源，所以 油菜萝卜质雄性不育三系利用的主要任务是选育甘蓝型油菜OguraCMS的恢复系。
[0004]然而，研究（GiancolaS，MarhadourS，DesloireS，etal·Characterization ofaradishintrogressioncarryingtheOgurafertilityrestorergeneRfoin rapeseed，usingtheArabidopsisgenomesequenceandradishgeneticmapping[J]. 11^(^4??1661^^，2003，107(8):1442 - 1451.)表明，把恢复基因导入油菜的同时也导致 了恢复系农艺性状不良和籽粒硫代含量的增加，并且利用各种传统育种技术很难有效降低 后代植株籽粒的硫甙含量（文雁成，张书芬，王建平，等.甘蓝型油菜萝卜质雄性不育恢复 系的筛选和初步研究[J].华北农学报，2010, 25(4) : 102 - 106.)，法国INRA(1987)报道了 将带有恢复基因的萝卜染色体片段导入到了油菜中，利用γ射线诱变获得了低硫甙含量 的OguraCMS恢复系R2000,并且由其研究出的用于甘蓝型油菜萝卜质不育双低恢复系选 育的PCR标记也取得了较好的效果。随后，各国研究者开展了对OguraCMS恢复系的改良和 相关遗传研究。通过遗传定位、测序等方法，已有许多报道关于导入油菜的带有恢复基因的 萝卜染色体片段的核酸信息。因此，至今已经获得了部分与这些关键恢复基因紧密连锁的 分子标记。这为开展Ogura恢复系创新过程中用分子标记作为辅助手段提供了必要条件。
[0005]自获得甘蓝型油菜Ogura CMS恢复系后，育种家和研究者们开展了大量的回交和 系谱选育，以期获得强恢复力和低硫苷的油菜恢复系材料。遗憾的是，通过以上方法获得的 Ogura CMS恢复系并未得到实质性改良。这是因为常规杂交的遗传基础是染色体重组，其本 身所带有的染色体片段（不利基因）无法剔除。因此，若要打破不利基因（硫苷）的连锁， 缩短萝卜染色体片段需采用其他方法。
[0006] 采用辐照（物理诱变）的方法，可以随机打断植物细胞中的染色体，从而创造新材 料。基于此原理，将导入油菜中的外源萝卜染色体片段打断，缩短其长度是可行的。法国 INRA的研究者Primar-Brisset等（2005)采用辐照方法获得了新型恢复系R2000,较以往 的恢复系版本有了很大的改良。然而，恢复系R2000的外源萝卜染色体片段仍然太长，这对 其农艺性状和产量的表现具有很大的影响。
【发明内容】
[0007] 本发明所要解决的技术问题在于提供了一种改良型甘蓝型油菜萝卜细胞质雄性 不育恢复系，该雄性不育恢复系农艺性状优良，为强优势杂交组合选育提供了基础。同时， 本发明另一个所要解决的技术问题在于提供了一种改良型甘蓝型油菜萝卜细胞质雄性不 育恢复系的改良方法。
[0008]-种改良型甘蓝型油菜萝卜细胞质雄性不育恢复系，它由以下方式改良：
[0009] (1)以甘蓝型油菜萝卜细胞质雄性不育系为母本，以甘蓝型油菜萝卜细胞质雄性 不育恢复系为父本，杂交获得匕代种子；
[0010] ⑵对h代种子进行辐照处理，辐照处理后将Fi代种子播种，得到F玳植株；
[0011] (3)以甘蓝型油菜萝卜细胞质雄性不育系为母本，以匕代植株为父本，杂交获得种 子，将种子播种，得到后代植株；
[0012] (4)对所述后代植株中的可育株进行单株分子标记筛选；
[0013] 最终获得所述改良型甘蓝型油菜萝卜细胞质雄性不育恢复系。
[0014] 本发明采用辐照处理和分子标记筛选相结合的方法，剔除了外源萝卜染色体片段 中几个与恢复基因紧密连锁的分子标记，筛选获得外源萝卜染色体片段比原始恢复系更短 的改良型甘蓝型油菜Ogura CMS恢复系，有效解决了原始恢复系杂种优势不强，生育期迟、 植株矮小，生长势弱、品质差等问题。
[0015] 本发明中，所述甘蓝型油菜萝卜细胞质雄性不育系为不育系Fu58Drakkar;所述 甘蓝型油菜萝卜细胞质雄性不育恢复系为恢复系R2000。不育系Fu58Drakkar和恢复系 R2000 均购自法国INRA(2010 年 1 月 8 日，No.lOOlLi)。
[0016] 作为优选，步骤（2)中，采用6°C〇y射线对F1代种子进行均匀辐照，辐照剂量为 1200 ~2600Gy，剂量率为 1. 2Gy/min。
[0017] 作为进一步优选，步骤（2)中，采用6°Co对F1代种子进行均匀辐照，辐照剂量为 2000Gy，剂量率为 1. 2Gy/min。
[0018] 作为优选，步骤（4)中，所述分子标记包括G26;以及BonJon、0PF10或0PN20中的 至少一种。其中，G26是基于恢复基因本身的分子标记，而Bonjon、0PF10和0PN20则是与 恢复基因紧密连锁的分子标记。在改良型甘蓝型油菜萝卜细胞质雄性不育恢复系中，G26 必须存在，它的存在表明恢复系对Ogura CMS不育系仍然具有恢复育性的能力；而Bonjon、 0PF10和0PN20则需要被剔除，因其会给恢复系带来不良的农艺性状。
[0019] 作为优选，所述分子标记筛选包括：分别提取可育株单株的基因组DNA，并以基因 组DNA为模板，利用引物进行PCR扩增，根据扩增结果筛选改良型甘蓝型油菜萝卜细胞质雄 性不育恢复系；
[0020] 其中，第一对引物（用于扩增分子标记Bonjon)为：
[0021] 上游引物：5' -GATCCGATTCTTCTCCTGTTG-3' ；
[0022] 下游引物：5 ' -GCCTACTCCTCAAATCACTCT-3 ' ；
[0023] 第二对引物（用于扩增分子标记0PF10)为：
[0024]上游引物：5 ' -AACTTTTTGTGTTTGATTTCTTGC-3 '；
[0025]下游引物：5 ' -ACTCCTTCTAAACAAAACCAAACA-3 '；
[0026] 第三对引物（用于扩增分子标记0PF20)为：
[0027]上游引物：5 ' -CCTTAGTTTAGTTGTAGGTGGTGG-3 '；
[0028]下游引物：5 ' -AGAAACCGCTCAATITTAACATAA-3 '；
[0029] 第四对引物（用于扩增分子标记G26)为：
[0030]上游引物：5 ' -GCTCACCTCATCCATCTTCCTCAG-3 '；
[0031]下游引物：5 ' -CTCGTCCTTTACCTTCTGTGGTTG-3 '。
[0032] 本发明第三个所要解决的技术问题在于提供了分子标记组合物在筛选改良型甘 蓝型油菜萝卜细胞质雄性不育恢复系中的应用，所述分子标记组合物为G26、B〇nJ〇n、0PF10 和 0PN20〇
[0033] 作为优选，所述应用包括：
[0034](1)以甘蓝型油菜萝卜细胞质雄性不育系为母本，以甘蓝型油菜萝卜细胞质雄性 不育恢复系为父本，杂交获得匕代种子；
[0035] (2)对匕代种子进行辐照处理，辐照处理后将Fi代种子播种，得到F 植株；
[0036] (3)以甘蓝型油菜萝卜细胞质雄性不育系为母本，以匕代植株为父本，杂交获得种 子，将种子播种，得到后代植株；
[0037] (4)利用上述四对引物对所述后代植株中的可育株进行单株分子标记筛选，获得 所述改良型甘蓝型油菜萝卜细胞质雄性不育恢复系。
[0038] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0039] 本发明采用辐照处理和分子标记筛选相结合的方法，在保证恢复系对OguraCMS 不育系具有恢复育性能力的同时，剔除了外源萝卜染色体片段中三个与恢复基因紧密连锁 的分子标记，筛选获得外源萝卜染色体片段比原始恢复系更短的改良型甘蓝型油菜Ogura CMS恢复系，为强优势杂交组合选育提供了基础。
【附图说明】