br>[0138] 破碎后立即将带拉链的塑料袋移至面部（鼻+ 口）附近，按下计时器（countup 功能）的开始按钮之后，立刻拉开塑料袋的拉链，鼻和口靠近塑料袋的开口部，进行感官评 价。感官评价的指标设置为以下2点。
[0139] 1.是否感觉到生洋葱破碎时的味道。
[0140] 2.到开始感觉到生洋葱破碎时感觉到的催泪性为止需要多少时间。
[0141] 完成感官评价的带拉链的塑料袋，立即拉紧拉链，并且放入较大的塑料袋中，不使 催泪性或味道扩散而影响其后的样品的感官评价。
[0142] 感官评价的结果，将生洋葱气味或者催泪性弱的试样判定为阳性试样，对阳性试 样的洋葱球，进行标记以使其能够识别，l〇°C下冷藏保管。
[0143] (注意点）
[0144] 考虑到防止催泪因子或味道成分的扩散，样品制备和感官评价在台式通风橱上进 行，而且，为了防止手上味道残留，佩带橡胶手套进行。
[0145] 在对一个样品进行感官评价后，对下一个样品进行感官评价之前空出3分钟以 上，以防止灵敏度降低。
[0146] (感官评价的灵敏度检查）
[0147] 对样品洋葱进行连续评价的中途，使用感觉到催泪性的非照射洋葱或很难感觉到 催泪性的生洋葱破碎气味弱的市售品种，进行同样的感官评价，进行灵敏度的检查。此外， 另外地在一次选拔实施之前，为了考察利用在密封的袋中将鳞片破碎时感觉到的催泪性或 生洋葱气味进行评价?选拔的可靠性，关于将水果洋葱、色拉洋葱、超北楓的鳞片分别破碎 时是否能够将其区别开来，通过盲检进行试验。其结果，由于能够选择催泪性弱的水果洋 葱，因此，判断将组织破碎时的感官评价用于一次选拔没有问题。
[0148] (一次选拔的结果）
[0149] 一次选拔的结果为选拔生洋葱气味或者催泪性弱的38球。
[0150] [二次选拔]
[0151] a)鳞片破碎液中的催泪因子（LF)生成量的测定
[0152] 将一次选拔中为阳性且10°C保管的洋葱球，再次按照与一次选拔时相同的顺序， 对最外层的鳞片的一部份取样。将切出的鳞片重量X1/2量的蒸馏水放入装有洋葱鳞片的 带拉链的塑料袋中，尽量不残留空气，拉紧拉链。保持原样，从带拉链的塑料袋的上方，用橡 胶锤敲打，将洋葱鳞片破碎（开始破碎时，按下计时器（countup功能）的开始按钮，记录 破碎后的时间）。挥舞破碎后的带拉链的塑料袋，将袋的内容物尽量收集至一处，在塑料袋 的破碎物集中的位置附近刺入带针头的lmL注射器，抽取洋葱破碎液。注射器的前端将针 头替换为0. 2μm或0. 45μm过滤器，过滤抽取的洋葱破碎液。立即使用微量注射器保持原 样采取过滤的洋葱破碎液1μL，注入HPLC，考察LF生成量（记录从破碎开始至HPLC注入 所需要的时间）。将剩余的滤液置于冰上。HPLC注入后，使用带针头的注射器，进一步回收 洋葱破碎液，记录得到的破碎液量。
[0153] b)鳞片破碎液的LFS活性的测定
[0154] 在分析LF生成量的滤液（10μL)中混合123μL的50mM磷酸缓冲液（ρΗ6· 5)。 从得到的稀释液取20μL，用40μL的50mM磷酸缓冲液（ρΗ6. 5)稀释。使用制备的稀释液 10μL，如下所示，进行利用HPLC的LFS活性测定。
[0155] <LFS活性测定的顺序>
[0156] 1.向新的Eppendorf管中加入40μL大蒜蒜氨酸酶（50单位/mL)。
[0157] 2.向其中添加10μL的1/20汁液（上述制备的稀释液），移液（匕°'y4 > 夕）2〇次。
[0158] 3.进而，添加20yL的PRENCS0(20mg/ml)，移液5次立即关闭盖。
[0159] 4.启动设置为3分钟的计时器。
[0160] 5.在剩余20秒之际，打开Eppendorf管的盖，使用10μL微量注射器，在正好变为 3分钟时，取样1μL，保持原样注入HPLC。
[0161] 6.用蒸馏水将HPLC的注入口和微量注射器清洗。
[0162] c)鳞片破碎液的蒜氨酸酶活性的测定
[0163] 将测定LF生成量的滤液（稀释前）作为蒜氨酸酶源，进行LFS活性测定反应，根 据HPLC上出现的LF峰区域考察蒜氨酸酶活性的强度。
[0164] 蒜氨酸酶活性测定的顺序
[0165] 1.向新的Eppendorf管加入20μL滤液。
[0166] 2.向其中添加5yL的rLFS，移液20次。
[0167] 3.进一步，添加10yL的PRENCS0(20mg/ml)，移液5次立即关闭盖。
[0168] 4.启动设置为3分钟的计时器。
[0169] 5.在剩余20秒之际，打开Eppendorf管的盖，使用10μL微量注射器，在正好变为 3分钟时，取样1μL，保持原样注入HPLC。
[0170] 6.用蒸馏水将HPLC的注入口和微量注射器清洗。
[0171] d)HPLC分析条件
[0172] 上述的a)~c)中使用的HPLC条件如下所示。3个测定，由于均是进行LF生成程 度的HPLC分析，因此HPLC条件完全相同。
[0173] HPLC分析条件
[0174] 柱：ODS(SenshuPak0DS4. 6mmX25cm)
[0175] 流动相：甲醇：0. 005%三氟乙酸水=3:7
[0176] 检测：254nm
[0177] 温度：35°C
[0178] 流速：0.6ml/min
[0179] (二次选拔的结果）
[0180] 二次选拔的结果，选拔 9 球（个体编号B0266、B0108、B0277、B0297、B0383、B0317、 B0280、B0258)。
[0181] (1_3)M2洋葱球的制作
[0182] 选拔的Ml洋葱（9 球，B0266、B0108、B0277、B0297、B0383、B0317、B0280、B0258、 B0371)分别进行自体繁殖交配。结果得到约350粒（B0108:71粒、B0297:约80粒、B0280: 约200粒、B0371:1粒）的种子（以下称为M2子代）。将得到的M2种子按照与Ml栽培相 同的顺序栽培，得到M2洋葱197球（B0108:18球、B0297:73球、B0280:106球）。
[0183] (1-4)M2洋葱的选拔
[0184] (分析试样的制备）
[0185] 为了避免因作为分析试样使用的部位引起的测定值或评价不同，分析试样使用以 下特定的部位。分析试样如下采取：在距离洋葱球的上端1/3~1/2的高度，沿着与球的上 下方向轴（通过洋葱球的底盘部和尖端部的轴）垂直的面分割为2部分，从得到的上侧部 分（包括尖端部的侧）或者下侧部分（包括底盘部的侧）的切断面中心部的鳞叶采取（参 照图1)。洋葱的各部位的说明如上述所示。
[0186] 将按照上述"（分析试样的制备）"记载的方法从上述M2洋葱采取的600mg洋葱 组织加入装有3个3ι?πιΦ的氧化错球的Eppendorf公司制离心管（2ml)。添加0. 6mL蒸馏 7K，利用QIAGEN公司制丽300型珠磨机通过30HzX2分钟X3次的处理进行破碎。将粉碎 的洋葱组织样品10μL添加至ELISA板的孔中。将添加试样的ELISA板在调温至37°C的 恒温槽内静置1小时。经过1小时后，将ELISA板从恒温槽取出，进行以下清洗步骤。（i) 从全部的孔除去溶液。（ii)在各孔每孔添加300μ1清洗缓冲液（0. 05%聚氧乙烯（20)脱 水山梨醇单月桂酸酯（Tween-20 同等品）in140mMNaCl，10mMNa2HP04-NaH2P04(pH7. 4))， 立即除去清洗缓冲液，将该操作重复3次。（iii)在将第3次的清洗缓冲液除去后，在盖 有纸巾的实验台上敲打ELISA板，从孔内将清洗缓冲液完全去除。在经过以上清洗步骤 (⑴~（iii))的ELISA板的各孔中每孔添加300μ1封闭溶液（1% (w/v)BSAin包被缓 冲液（50mMsodiumcarbonate-bicarbonatebuffer(ρΗ9· 6))。保持原样将ELISA板在调 温至37°C的恒温槽内静置1小时。经过1小时后，重复上述清洗步骤（(i)~（iii))。在 清洗后的ELISA板各孔中每孔添加100μ1 -次抗体（将抗蒜氨酸酶大鼠抗血清用稀释缓 冲液（〇· 1%BSAin140mMNaCl, 10mMNa2HP04-NaH2P04(pH7. 4))稀释至 1000 倍的抗体）。 使用调温至37°C的恒温槽内时，保持原样将ELISA板静置3小时，使用4°C冰箱时静置一 晚（16小时~22小时），使一次抗体反应。与一次抗体的反应后，将ELISA板供于上述清 洗步骤（(i)~（iii))。在清洗后的ELISA板的各孔中每孔添加200μ1二次抗体（将P0D conjugatedanti-ratIgGwholemoleculeSigmaA0545 用稀释缓冲液稀释 10000倍的抗 体）。将添加二次抗体的ELISA板在调温至37°C的恒温槽内静置1小时。经过1小时后， 重复上述清洗步骤（(i)~（iii))。在清洗后的ELISA板每孔添加100μ1显色试剂（TBA ELISA底物溶液（Bio-Rad172-1066)。添加后，立即将ELISA板在25°C恒温室内边以60rpm 振荡搅拌边进行显色反应。添加显色试剂后，在10分钟~60分钟之间使用酶标仪（Emax MolecularDynamics公司）测定650nm的吸光度。代替提取样品而使用精制蒜氨酸酶（制 作法是特开2009-254344号记载的方法），使用溶液的稀释系列，基于同样地测定的值，制 作标准曲线，将提取样品中的吸光度测定值换算为蒜氨酸酶浓度。而且将使用Bradford法 测定的提取液中的总蛋白质量作为基础，换算为每lng提取蛋白质。
[0187] 将单位提取蛋白质的ELISA显色量为非照射对照洋葱的1/10以下作为选拔基准， 选拔蒜氨酸酶蛋白质表达量少的个体18球。
[0188] (1-5)M2选拔球的自体繁殖采种（M3子代的制造）
[0189] 5月~10月
[0190] 得到采种数：3250粒（个体编号300号：280粒、438号：55粒、444号：56粒、455 号：800 粒、479 号：86 粒、482 号：66 粒、486 号：960 粒、487 号：176 粒、489 号：265 粒、511 号：75粒、512号：61粒、515号：367粒）的M3种子。
[0191] (1-6)来自M3种子的球栽培
[0192] 3月~9月
[0193] 对于上述3250粒的M3种子中1078粒（个体编号300号：100粒、438号：55粒、 444 号：56 粒、455 号：100 粒、479 号：86 粒、482 号：66 粒、486 号：100 粒、487 号：176 粒、 489号：100粒、511号：75粒、512号：61粒、515号：100粒），按照与Ml或M2栽培相同的 顺序栽培，得到M3洋葱球466球（300号：81球、438号：28球、444号：22球、455号：74 球、479 号：29 球、482 号：15 球 487 号：67 球、489 号：37 球、511 号：60 球、512 号：4 球、 515 号：49 球）。
[0194](卜7)从M3洋葱球中的选拔
[0195] 11月~3月
[0196] 对于上述M3洋葱球，将鳞叶破碎后的PRENCS0残存量作为指标，选拔蒜氨酸酶活 性弱的个体。选拔基准是残存PRENCS0量为3. 26ymol/gFW以上。该选拔基准是基于以 下原因而设定：在预备研究中，实施蒜氨酸酶活性的强度和感官评价结果的比较时，蒜氨酸 酶活性为1/40时，通过感官评价确认辛辣味降低。上述蒜氨酸酶活性变为1/40时的残存 PRENCS0量（3. 26ymol/g)如下求出：从使用在与M3洋葱球栽培相同的田地中栽培的常见 洋葱（札幌黄）（6球）的模型实验，测定蒜氨酸酶活性变为1/40时的残存PRENCS0量。对 选拔的几个洋葱，感官评价鳞叶，考察辛辣味的有无。
[0197] 此外，对于这些选拔球，使用以自体繁殖采种为目标的栽培途中的叶进行感官评 价和蒜氨酸酶活性测定，进行特性把握。
[0198] 结果，选拔残存？1?从^0量为3.26以111〇1/^?1以上的9球（#2，#6，#10，#11，#37， #230, #262, #263, #651)。
[0199] (1-8)M3选拔球的自体繁殖采种（M4子代的制造）
[0200] 5月~10月
[0201] 得到 16