L，继代培养3次后将继代周期缩短至6天，继续培养3代，此时甲瓦龙酸内酯的加入时间 为培养周期的第2天。悬浮细胞培养液即为可提高虎杖愈伤组织中白藜芦醇含量的培养液。
[0014]培养结束后，用高效液相色谱(HPLC)测定白藜芦醇含量，结果表明白藜芦醇含量 占细胞干重的0.161%。
[0015] 实施例3: 一种可提高虎杖愈伤组织中白藜芦醇含量的培养方法，采用以下步骤： A、 外植体材料选取与预处理： 选择苗龄为一周左右生长茁壮的虎杖茎段为外植体。先将虎杖的茎剪成5~10 cm的茎 段，流水冲洗2~3 h，将茎放置到已灭菌的超净工作台上，用无菌水浸泡10 min，然后用75% 乙醇一水溶液浸泡消毒30 s，无菌水冲洗2~3次，再用10% NaCIO溶液消毒5 min，最后用无 菌水浸泡材料3次，时间分别为10 min，5 min，3 min，放在无菌滤纸上晾干；用刀切除茎段 两端的旧切面，剪成0. 5X0. 5 cm左右的小段备用； B、 虎杖愈伤组织的诱导:将步骤A中已消毒的外植体接入固体培养基，培养基组成为MS 培养基+1.0 mg/L 6-BA + 0.5 mg/L KT +0.2 mg/L NAA，30 g/L蔗糖，8 g/L琼脂，pH 5.8， 温度25 ± 1 °C，在暗光(0 lx)下培养25天，诱导出愈伤组织。选择质地疏松、颜色淡黄的新 鲜愈伤组织进行继代培养，每20天继代一次，在相同固体培养基上继代培养3次； C、 愈伤组织悬浮扩大培养与次生代谢产物白藜芦醇的诱导：以步骤B中继代3次后获得 的生长旺盛、疏松、易散的愈伤组织为悬浮培养体系的种子细胞，将其接种在悬浮细胞培养 液中（配方见附表4)，接种量为95 g/L(愈伤组织鲜重/培养基体积）。将接种完成的悬浮细 胞培养基进行悬浮振荡培养，摇床转速115 rpm，光照强度1680 lx，光照时间13 h/day，培 养温度25±1 °C，培养过程中每天向培养液中充入清洁无菌空气一次。每12天继代培养一 次，并在悬浮培养周期的第7天于悬浮细胞培养液中加入甲瓦龙酸内酯，使其终浓度为100 mg/L，继代培养4次后将继代周期缩短至8天，继续培养3代，此时甲瓦龙酸内酯的加入时间 为培养周期的第4天。悬浮细胞培养液即为可提高虎杖愈伤组织中白藜芦醇含量的培养液。
[0016] 培养结束后，用高效液相色谱(HPLC)测定白藜芦醇含量，结果表明白藜芦醇含量 占细胞干重的0.154%。
[0017] 实施例4: 一种可提高虎杖愈伤组织中白藜芦醇含量的培养方法，采用以下步骤： A、 外植体材料选取与预处理:选择苗龄为一周左右生长茁壮的虎杖茎段为外植体。先 将虎杖的茎剪成5~10 cm的茎段，流水冲洗2~3 h，将茎放置到已灭菌的超净工作台上，用无 菌水浸泡10 min，然后用75%乙醇一水溶液浸泡消毒30 s，无菌水冲洗2~3次，再用10% NaCIO溶液消毒5 min，最后用无菌水浸泡材料3次，时间分别为10 min，5 min，3 min，放在 无菌滤纸上晾干;用刀切除茎段两端的旧切面，剪成0. 5X0. 5 cm左右的小段备用； B、 虎杖愈伤组织的诱导:将步骤A中已消毒的外植体接入MS培养基，培养基组成为MS培 养基+1.0 mg/L 6-BA + 0.5 mg/L KT +0.2 mg/L NAA，30 g/L蔗糖，8 g/L琼脂，pH 5.8,温 度25 ± 1 °C，在暗光(0 lx)下培养25天，诱导出愈伤组织。选择质地疏松、颜色淡黄的新鲜 愈伤组织进行继代培养，每20天继代一次，在相同固体培养基上继代培养3次； C、 愈伤组织悬浮扩大培养与次生代谢产物白藜芦醇的诱导：以步骤B中继代3次后获得 的生长旺盛、疏松、易散的愈伤组织为悬浮培养体系的种子细胞，将其接种在悬浮细胞培养 液中（配方见附表5)，接种量为110 g/L(愈伤组织鲜重/培养基体积）。将接种完成的悬浮细 胞培养基进行悬浮振荡培养，摇床转速130 rpm，光照强度1760 lx，光照时间12 h/day，培 养温度25 ± 1 °C，培养过程中每天向培养液中充入清洁无菌空气一次。每16天继代培养一 次，并在悬浮培养周期的第5天于悬浮细胞培养液中加入甲瓦龙酸内酯，使其终浓度为120 mg/L，继代培养2次后将继代周期缩短至9天，继续培养5代，此时甲瓦龙酸内酯的加入时间 为培养周期的第5天。悬浮细胞培养液即为可提高虎杖愈伤组织中白藜芦醇含量的培养液。
[0018] 培养结束后，用高效液相色谱(HPLC)测定白藜芦醇含量，结果表明白藜芦醇含量 占细胞干重的0.148%。
[0019] 实施例5: 一种可提高虎杖愈伤组织中白藜芦醇含量的培养方法，采用以下步骤： A、 外植体材料选取与预处理:选择苗龄为一周左右生长茁壮的虎杖茎段为外植体。先 将虎杖的茎剪成5~10 cm的茎段，流水冲洗2~3 h，将茎放置到已灭菌的超净工作台上，用无 菌水浸泡10 min，然后用75%乙醇一水溶液浸泡消毒30 s，无菌水冲洗2~3次，再用10% NaCIO溶液消毒5 min，最后用无菌水浸泡材料3次，时间分别为10 min，5 min，3 min，放在 无菌滤纸上晾干;用刀切除茎段两端的旧切面，剪成0. 5X0. 5 cm左右的小段备用； B、 虎杖愈伤组织的诱导:将步骤A中已消毒的外植体接入MS培养基，培养基组成为MS培 养基+1.0!1^/16-8厶 + 0.5 11^/11〇'+0.2 11^/1熟厶，308/1蔗糖，88/1琼脂，？!15.8，温 度25 ± 1 °C，在暗光(0 lx)下培养25天，诱导出愈伤组织。选择质地疏松、颜色淡黄的新鲜 愈伤组织进行继代培养，每20天继代一次，在相同固体培养基上继代培养3次； C、 愈伤组织悬浮扩大培养与次生代谢产物白藜芦醇的诱导：以步骤B中继代3次后获得 的生长旺盛、疏松、易散的愈伤组织为悬浮培养体系的种子细胞，将其接种在悬浮细胞培养 液中（配方见附表6)，接种量为70 g/L(愈伤组织鲜重/培养基体积）。将接种完成的悬浮细 胞培养基进行悬浮振荡培养，摇床转速105 rpm，光照强度1500 lx，光照时间15 h/day，培 养温度25±1 °C，培养过程中每天向培养液中充入清洁无菌空气一次。每12天继代培养一 次，并在悬浮培养周期的第8天于悬浮细胞培养液中加入甲瓦龙酸内酯，使其终浓度为120 mg/L，继代培养4次后将继代周期缩短至6天，继续培养5代，此时甲瓦龙酸内酯的加入时间 为培养周期的第3天。悬浮细胞培养液即为可提高虎杖愈伤组织中白藜芦醇含量的培养液。
[0020] 培养结束后，用高效液相色谱(HPLC)测定白藜芦醇含量，结果表明白藜芦醇含量 占细胞干重的0.135%。
[0021] 表1. MS培养基的基本组成
表2.实施例1的悬浮细胞培养液配方
【主权项】
1. 一种可提高虎杖愈伤组织中白藜芦醇含量的培养液，其特征在于：在MS基础培养基 中添加6-苄氨基嘌呤、6-糖基氨基嘌呤、萘乙酸、精胺、亚精胺、蔗糖，添加后，所述6-苄氨基 嘌呤的浓度为0.5~1.8 mg/L，所述6-糖基氨基嘌呤的浓度为0.3~1.0 mg/L，所述萘乙酸的 浓度为〇. 15~0.45 mg/L，所述精胺的浓度为1.0~4.5 mg/L，所述亚精胺的浓度为0.5~1.25 mg/L，所述蔗糖浓度为20~50 g/L;培养液pH为5~6。2. -种可提高虎杖愈伤组织中白藜芦醇含量的培养方法，其特征在于采用以下步骤： A、 虎杖愈伤组织的诱导:选择虎杖莖段为外植体，在培养基中暗光(0 lx)培养25天，诱 导出愈伤组织，每20天继代一次，继代培养3次;所述培养基为MS基础培养基中添加6-苄氨 基嘌呤、6-糖基氨基嘌呤、萘乙酸、精胺、亚精胺、蔗糖而成，所述培养基中6-苄氨基嘌呤浓 度为1.0 mg/L，6-糖基氨基嘌呤浓度为0.5 mg/L，萘乙酸浓度为0.2 mg/L，蔗糖浓度为30 g/L，琼脂浓度为8 g/L，培养基pH 5.8,培养温度25±1 °C; B、 愈伤组织悬浮扩大培养及次生代谢产物白藜芦醇的诱导：以步骤A中获得的生长旺 盛、疏松、易散的愈伤组织为悬浮培养体系的种子细胞，将其接种在一种可提高虎杖愈伤组 织中白藜芦醇含量的培养液中进行悬浮扩大培养，接种量为60~110 g/L，g/L=愈伤组织鲜 重/培养基体积，得到含有愈伤组织的培养液;所述一种可提高虎杖愈伤组织中白藜芦醇含 量的培养液是含有0.5~1.8 mg/L 6-苄氨基嘌呤、0.3~1.0 mg/L 6-糖基氨基嘌呤、0.15~ 0.45 mg/L萘乙酸、1.0~4.5 mg/L精胺、0.5~1.25 mg/L亚精胺、20~50g/L蔗糖的MS培养液， 培养液pH为5~6;对所得含有愈伤组织的培养液进行诱导悬浮培养，诱导悬浮培养的条件 为:振荡培养，摇床转速90~130 rpm，光照强度1280~1760 lx，光照时间12~16 h/day，培养 温度25±1 °C，培养过程中每天向培养液中充入清洁无菌空气一次;每12~16天继代培养一 次，继代培养2~4次后将继代周期缩短至6~10天，缩短继代周期后继续培养3~5代;在诱导悬 浮培养继代周期的第4~8天，继代周期缩短后则在第2~5天时加入甲瓦龙酸内酯，甲瓦龙酸 内酯在培养液中的终浓度为50~120 mg/L，诱导悬浮培养结束后得到白藜芦醇含量高的虎 杖愈伤组织细胞。
【专利摘要】本发明涉及一种可提高虎杖愈伤组织中白藜芦醇含量的培养液及培养方法，所述培养液是由MS基础培养基、6-苄氨基嘌呤、6-糖基氨基嘌呤、萘乙酸、精胺、亚精胺、蔗糖组成，所述6-苄氨基嘌呤的浓度为0.5~1.8？mg/L，所述6-糖基氨基嘌呤的浓度为0.3~1.0？mg/L，所述萘乙酸的浓度为0.15~0.45？mg/L，所述精胺的浓度为1.0~4.5？mg/L，所述亚精胺的浓度为0.5~1.25？mg/L，所述蔗糖浓度为20~50g/L；培养液pH为5~6。使用本发明的培养液对虎杖愈伤组织进行培养，白藜芦醇的含量可达细胞干重的0.12~0.18%，具有提高虎杖愈伤组织中白藜芦醇的含量的有益效果。
【IPC分类】A01H4/00
【公开号】CN105580735
【申请号】CN201610064635
【发明人】黄洁芳, 王丽娜, 毕永贤, 殷海琴, 陈斌, 蒋丽刚
【申请人】珀莱雅化妆品股份有限公司
【公开日】2016年5月18日
【申请日】2016年2月1日