具有高水平香芹酚的牛至克隆系的制作方法
【专利说明】具有高水平香芹酚的牛至克隆系
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2013年5月7日提交的题为"具有高水平香芹酚的牛至克隆系"的美国 临时专利申请系列号61/855,067的优先权，其通过引用以其整体并入本文。 发明领域
[0003] 本发明大体涉及牛至(oregano)植物，且更具体地，涉及产生高量香芹酚的牛至克 隆系KI-0vll750的植物。
[0004] 发明背景
[0005] 牛至(Orignaum sp.)作为传统草药、香料以及在传统医药中已经使用许多世纪。 牛至精油在若干应用中被用作成分，包括牙膏、口腔洗液、口香糖等。牛至精油中的主要活 性分子是香芹酚和麝香草酚。已经显示这些分子具有潜在的抗微生物活性 1且已经用作饲 料添加剂以改善农场动物的胃肠道健康。已经显示动物饲料饮食中的牛至精油在猪2, 3中改 善生长和繁殖表现以及在肉鸡中改善整体表现。牛至油也用于若干个人护理应用中。
[0006] 精油在牛至和其它草中的积累随着植物的发育阶段而不同4。发现Orignaum onites中的最高香芹酚和麝香草酚含量在开花前阶段 5。然而，另外的研究报道在六月中旬 开花后和种子形成阶段期间的最高香芹酚和麝香草酚含量6。
[0007] 尽管受遗传学控制，所述生物活性分子强烈地受到特定生长区域的环境影响；且 还受到农艺条件、收获时间和加工类型的影响4。收获的时候植物的年龄似乎影响油产量和 组成。获得自较年轻植物的牛至油的总麝香草酚和香芹酚含量高于成熟植物的含量 4。植物 接受的水的量对提取自墨西哥牛至(Mexican oregano)的油的麝香草酚和香芹酚含量没有 显著作用7。
[0008] 已经研究了温度和日照持续施加对牛至精油的生物活性组分的作用。像许多其他 物种一样，在较高温度、光强度和更长日长周期生长的牛至植物倾向于具有增加的油含 量 8。收获时间对于在牛至中最大化精油产量和其主要组分浓度是关键的。香芹酚和麝香草 酚含量一般在夏季月份要高得多 8。
[0009] 正在进行的遗传学改进聚焦于增加精油，而很少或没有进行改善牛至以更好生产 香芹酚、麝香草酚或其它抗微生物和抗氧化分子的努力。从超积累的牛至克隆系提取香芹 酚对于经济可行的商业化香芹酚生产是关键的。因此，开发具有高水平的香芹酚并具有高 生物量的牛至品种将提供具有经济价值的香芹酚来源。
[0010] 发明概述
[0011] 本发明由名为KI-0V1750的牛至植物组成，其具有升高的香芹酚水平、优异的活力 和整体农艺稳健性。从获得自正在分离的牛至的商品来源的种子选择和繁殖出该品种。选 择具有升高的香芹酚水平和良好生长习性的植物并无性繁殖以产生相同的植物的克隆系。
[0012] 克隆系KI-0V1750的植物在全部可能的环境条件下均没有被观察到过。随着环境 和培养例如温度、光强、日长、水状态和/或肥料比例或类型的差异，表型可能有点不同，然 而没有基因型的任何变化。
[0013] 本发明的一个目的是具有高水平香芹酚的植物，其在人和动物食物、饮料和个人 护理产品中作为抗微生物和抗氧化剂使用。
[0014] 本发明的另一目的是牛至的克隆系，其是新颖的、稳定的和一致的并具有良好的 农艺特性，允许高效培育该品种，作为产生能够提取香芹酚的高量生物质的作物。
[0015] 附图简述
[0016]图1是比较温室生长和田间生长的植物中香芹酚和麝香草酚含量的图表。
[0017] 图2是所选定的牛至品系中香芹酚/麝香草酚含量的季节性差异的图表。
[0018] 图3是选定的牛至品系的相对表型活力评分的图表。
[0019]图4是品种KI -Ον 17 50的植物的叶的长度针对厘米比例尺的照片。
[0020]图5是品种ΚI -Ον 17 50的植物的叶的宽度针对厘米比例尺的照片。
[0021]图6是品种ΚI -Ον 17 50的侧枝的照片。
[0022] 图7是现有技术希腊牛至(Greek Oregano)的色谱图。
[0023] 图8是品种KI_0vl750的色谱图。
[0024] 发明详述
[0025] 我们之前从大规模遗传筛选研究中鉴定了专有的牛至克隆系，其能够在温室条件 下积累高水平的香芹酚(Hi-C)或高水平的麝香草酚(Hi-T)。在田间条件下生长这些Hi-C和 Hi-T牛至克隆系并在生长季节期间测量香芹酚和麝香草酚积累以及总体生物量积累。靶分 子积累、生物量产生和繁殖能力已被用于鉴别用于商业应用的最佳克隆系。
[0026] 本发明的植物衍生自O.vulgare ssp.vinculum和O.vulgare ssp.hirtum的杂交， 且分类学描述为牛至属（Origanum)，vulgare种，唇形科（Lamiaceae)以及通用名牛至 (oregano)。表2示出取自生长于温室的植物的植物性状描述，且表1示出表2性状的定义。 [0027] 表1-性状的描述
[0028]
[0029] 表2-在温室观察的KI-0vl750的特性 「00301
L〇〇31J 在一实施方式中，植物KI-0vl750在活跃生长和收获李节（5月全9月）期间以>5% (基于干物质）的水平产生香芹酚。本发明涉及新颖的、稳定的、一致的旺盛生长的稳健牛至 植物KI-Ovl 750的开发。该植物是独特的并且明显区别于全部其它已有的牛至品种。
[0032] 实施例1-克隆系的选择和开发
[0033] 材料和方法
[0034] 专有的牛至克隆系。选择从之前的遗传学筛选鉴定的17种牛至选择物在靠近 Indianola，Iowa的田间位置在田间条件下种植。在温室条件生长的14个高香芹酚(Hi-C)牛 至克隆系的香芹酚含量和3个高麝香草酚(Hi-T)克隆系的麝香草酚含量在表3中给出。 [0035] 表3.2010年在温室生长的所选定的牛至克隆系的香芹酚和麝香草酚含量
[0036]
[0037]-表示无法检测的水平
[0038]田间小区（field plot)的建立。2011年5月末在德克萨斯的繁殖温室以根插 (rooted cutting)无性繁殖选定的牛至克隆系用于移植。代表17种选择物的大约38,000株 植物在2011年5月-6月被移植至Indianola, Iowa附近共3.1英亩的田间小区。采用多种杂草 控制策略，包括机械耕地、人工芯吸（wieking)草甘膦、人工锄地、撒播选择性除草剂 (Poast)以及最后喷播针对草、蒲阔叶树和杂草种子萌发的罐混合物(Poast/Basagran/ Sinbar)〇
[0039] 组织取样。在完全建立之后在2011年9月期间从各选择物收集叶组织一次用于香 芹酚和麝香草酚分析。在2012年的生长周期期间，从2012年4月至9月每两周收集一次来自 各克隆系的叶组织。从各克隆系收集顶部4"-6"的叶组织(包括茎）；空气干燥48小时并送去 分析。使用经开发并验证用于测定牛至干叶组织中香芹酚和麝香草酚的快速方法来定量这 些品系中的香芹酚和麝香草酚含量。从代表各克隆系的各批叶组织样品进行三次重复提 取。基于每单位干重确定香芹酚和麝香草酚含量且计算平均值用于统计学比较。
[0040] 表型活力评分。全部克隆系针对它们的整体活力和生长进行评分，基于范围为1-5 的肉眼评估。对具有非常差活力和生长的牛至品系给出评分为1;而对具有最佳活力和生长 的牛至品系给出评分为5。
[0041] 数据分析。使用Stat Centurion Graphics对获得自17个克隆系的数据进行统计 学分析以确定克隆系之间香芹酚和麝香草酚积累的差异。使用普通线性模型分析香芹酚和 麝香草酚含量。费氏最小显著差数(LSD)用于区分平均值并且使用多范围检验计算。
[0042] 结果
[0043]香芹酚和麝香草酚的差异。对于香芹酚和麝香草酚含量两者，克隆系之间存在显 著差异(表4)。每个克隆系的取样时间对于香芹酚和麝香草酚含量也有显著差异。也观察到 显著的基因型(克隆系)x取样日期(表4)。
[0044] 表4.在不同日期取样的基因型之间香芹酚和麝香草酚含量的方差分析(AN0VA)
[0045]
[0046]在第1年的香芹酚和麝香草酚含量。在2011年5月期间移植所述克隆系的田间小区 并在2011年8月前建立。从第1年生长收集的叶组织样品显示合理的香芹酚/麝香草酚含量， 尽管经历了移植胁迫、大雨和水涝土壤(图1)。
[0047]在第2年的香芹酚和麝香草酚含量。在贯穿第2年的生长季节期间监测克隆系的香 芹酚和麝香草酚含量。从4月至9月每半个月收集的叶组织的香芹酚和麝香草酚含量示于表 5。克隆系的香芹酚和麝香草酚含量在生长季节期间随着生长阶段而变化。在4月的春季再 生长期间，与克隆系无关，香芹酚和麝香草酚含量处于最低水平。从4月开始在所有克隆系 中观察到香芹酚和麝香草酚含量的逐渐增加并在6月达到最大水平。
[0048]横跨克隆系和取样时间，最高香芹酚含量为在克隆系KI-0vl750中的大约7%。该 克隆系从5月至9月持续积累最高水平的香芹酚;之后是KI-〇V1791、KI-〇vl843、KI-〇vl721 和KI-〇vl835。在所种植的三个Hi-T品系中，克隆系KI-〇vl855在冬天没能很好存活;而克隆 系KI-0vl850显示最高水平的麝香草酚积累，基于干物质>5%。
[0049] 全部品系在2012年收获两次;第一次收获在6月的第1周期间而第二次收获在9月 的第 1 周期间。五个Hi-C品系 1(1-〇1750、1(1-〇1721、1(1-〇1791、1(1-〇1843和1(1-〇1835显 示最高的香芹酚含量，KI-0vl750在收获时最高。在9月的第2次收获期间再次观察到类似趋 势。在第2次收获的时候，KI-0vl750比其它Hi-C克隆系具有显著更高的香芹酚水平。在另一 方面，在克隆系KI-0vl850中仅在6月观察到最大麝香草酚积累（5.16%)且该含量在9月的 第2次收获时降低50 %。
[0050] 表5.4月至9月§收集的克隆系的香芹酚％和麝香草酚％
[00511
[0052] ￡KI-0vl850 和 KI-0v2098代表 Hi-T 品系
[0053] §携带不同上标的均值显著不同（p〈0.05)。
[0054] 五个Hi-C克隆系（1750、1721、1791、1835和1843)中香芹酚含量的逐渐增加；以及 克隆系KI-0vl850中的麝香草酚含量示于如下图2。全部Hi-C克隆系在6月的第1周以及再次 在8月的最后1周显示最高水平的香芹酚含量。Hi-T克隆系KI-0vl850在6月显示最高麝香草 酚含量，随后在夏季没有第二个峰。
[0055] 对现有技术希腊牛至（图8)和本发明（图9)进行HPLC，证明本主题品系的低麝香草 酚含量和高香芹酚含量。
[0056] 表型活力评分。全部克隆系在生长周期期间对整体植物活力和生长进行评分。克 隆系（1843、1791、1835和1750)在整个生长周期持续展现旺盛生长（图3)。在全部品系中， KI-〇vl843比其它品系开花早得多。
[0057] 讨论
[0058]之前，我们在温室条件下鉴别了若干专有的Hi_C(14个具有香芹酚含量>4%的克 隆系)和Hi-T(3个具有麝香草酚含量>3%的克隆系）牛至克隆系。2011年期间在Iowa生长这 些品系以监测在田间条件下香芹酚和麝香草酚的积累。了解香芹酚和麝香草酚含量在生长 季节期间的波动对于及时收获生物量以最大化香芹酚和麝香草酚产量是必