一种测定药物对大蜂螨急性和慢性毒性的方法
【专利摘要】本发明的测定药物对大蜂螨毒性的方法，包括：将健康的蜜蜂幼虫待测定量药液轻轻喷于的体表，然后将蜜蜂幼虫从幼虫培养板内转移至底部铺有药液浸润的滤纸片的蜂蛹培养杯内；收集待测大蜂螨，每个处理组和对照组的蜂蛹培养杯内接入一只大蜂螨，并用透气的透明薄膜封住蜂蛹培养杯的杯口，防止接入的大蜂螨逃出蜂蛹培养杯，将蜂蛹培养板放入培养箱中培养，温度为34.5℃,相对湿度为75％；统计48h或72h蜂螨死亡数，计算死亡率，分析药物对大蜂螨的急性毒性；或每天连续记录试验蜂螨的存活情况，统计每只蜂螨的存活时间，分析药物对大蜂螨的慢性毒性。本发明的方法实验条件可控、蜂螨存活率高、存活时间长、结果准确可信。
【专利说明】
一种测定药物对大蜂螨急性和慢性毒性的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及测定药物对昆虫毒性的方法，特别是涉及一种测定药物对大蜂螨急性 和慢性毒性的方法。
【背景技术】
[0002] 蜜蜂是重要的经济昆虫，具有很大的经济价值和生态价值，蜜蜂既能提供有益的 蜂产品又能为植物授粉，大蜂螨是危害蜂业的最严重的蜜蜂敌害。
[0003] 大蜂螨是危害世界养蜂业的最严重的蜜蜂敌害，由于长期使用拟除虫菊酯类杀螨 剂，大蜂螨产生了严重的抗药性，新型高效绿色杀螨剂的筛选迫在眉睫。而在国际上缺乏杀 螨剂对大蜂螨毒力测定的标准方法。目前，一般采用两种方法，一种为蜂群毒力测定法，另 一种为室内毒力测定法。这两种方法均有一定的缺点，无法准确测定杀螨剂对大蜂螨的毒 力。蜂群施药法：（1)无法控制试验条件，受环境和蜂群群势等因素影响较大，导致系统误差 大；（2)试药剂量不是蜂螨实际接触的剂量，导致结果不准确；（3)试验蜂群之间的蜂螨寄生 率不一致，导致处理组内差异较大；（4)蜂群试验费时费力。室内毒力测定法是将蜂螨接入 内壁均匀涂有待测药物的培养皿或玻璃瓶内，测定蜂螨死亡率;或将蜂螨放入培养皿内，再 对着蜂螨喷洒待测药物，测定蜂螨死亡率。室内毒力测定法的缺点是，由于蜂螨缺乏食物等 因素，导致对照组蜂螨死亡率高，结果不可信，也无法测定药物对大蜂螨的慢性毒性。
【发明内容】
[0004] 本发明要解决的技术问题是提供实验条件可控、蜂螨存活率高、存活时间长、结果 准确可信的测定药物对大蜂螨急性和慢性毒性的方法。
[0005] 本发明的测定药物对大蜂螨毒性的方法包括如下步骤：
[0006] 1)将待测药物按照处理组设置，用溶剂配制成不同待测浓度药液，将待测定量药 液轻轻喷于的健康的蜜蜂幼虫体表，然后将蜜蜂幼虫置于一只34.5°C预热后的蜂蛹培养杯 内；对照组用溶剂处理;所述蜂蛹培养杯底部铺设相应浓度药物浸润后晾干的滤纸片；
[0007] 2)从准备的养螨脾上收集待测大蜂螨，每个处理组和对照组的蜂蛹培养杯内接入 一只大蜂螨，并用透气的透明薄膜封住蜂蛹培养杯的杯口，将蜂蛹培养杯放到蜂蛹培养板 的孔内，每孔一只，将蜂蛹培养板放入培养箱中，温度为34.5°C，相对湿度为75% ;
[0008] 3)统计不同时间段的不同处理组大蜂螨死亡数，计算死亡率，分析药物对大蜂螨 的急性毒性;或每天连续记录试验蜂螨的存活情况，统计每只蜂螨的存活时间，分析药物对 大蜂螨的慢性毒性;其中，死亡率=死亡的蜂螨数/接入的蜂螨数。
[0009]所述方法中，所述健康的蜜蜂幼虫处于封盖幼虫期。
[0010] 所述方法中，所述健康的蜜蜂幼虫是西方蜜蜂(Apis melifera)的幼虫。
[0011] 所述方法中，待测药物的溶剂可以为丙酮。
[0012] 所述方法中，待测药物可以为绳毒磷(Coumaphos)。
[0013] 所述方法中，所述健康的蜜蜂幼虫的培养方法如下：用产卵控制器控制蜂王在一 张空巢脾上产卵，24h后释放蜂王，3天后用移虫针将幼虫转移至装有饲料的34.5°C预热的 设有若干可容纳幼虫的孔的幼虫培养板内，每孔移入一只蜜蜂幼虫;幼虫培养板放置到培 养箱内，温度为34.5°C，相对湿度95 %，连续饲喂6天;第1天饲喂10此饲料A，第2天饲喂10此 饲料A，第3天饲喂20yL饲料B，第4天饲喂30yL饲料C，第5天饲喂40yL饲料C，第6天饲喂50yL 饲料C，得到封盖幼虫期健康蜜蜂幼虫；所述饲料A由含有重量百分含量为44.25%的蜂王 浆、重量百分含量为5.3 %的葡萄糖、重量百分含量为5.3 %的果糖、重量百分含量为0.90 % 的酵母提取物和重量百分含量为44.25%的水组成；所述饲料B由含有重量百分含量为 42.95 %的蜂王浆、重量百分含量为6.40 %的葡萄糖、重量百分含量为6.40 %的果糖、重量 百分含量为1.30%的酵母提取物和重量百分含量为42.95%的水组成;所述饲料C由含有重 量百分含量为50.00 %的蜂王浆、重量百分含量为9.00 %的葡萄糖、重量百分含量为9.00 % 的果糖、重量百分含量为2.00%的酵母提取物和重量百分含量为30.00%的水组成。具体 的，34.5°C预热后的蜂蛹培养杯的准备方法如下:待测药物用溶剂配制成不同待测浓度药 液，将定量药液滴到备好的滤纸片上，滤纸片全部浸湿，然后将涂药的滤纸片放置在超净台 内待溶剂挥发晾干后，放入到蜂蛹培养杯的底部，每个蜂蛹培养杯一张滤纸片，将蜂蛹培养 杯放置于蜂蛹培养板的孔内，蜂蛹培养板放置到培养箱内，34.5°C预热待用;对照组用溶剂 处理；
[0014] 本发明还提供一种测定药物对大蜂螨毒性的装置。
[0015] 本发明所述的测定药物对大蜂螨毒性的装置，包括蜂蛹培养板和蜂蛹培养杯，其 特征在于:所述蜂蛹培养板是设若干孔，所述孔的大小与蜂蛹培养杯相应，每个孔可容纳一 只蜂蛹培养杯;所述蜂蛹培养杯为杯状体，所述蜂蛹培养杯的底部铺设滤纸片，杯口设用于 封口的透气的透明薄膜。
[0016] 在本发明的一个实施方式中，所述蜂蛹培养板设24-48个可容纳蜂蛹培养杯的孔。
[0017] 进一步的，本发明的装置还包括可提供培养温度34.5 °C、相对湿度为75 % -95 %的 培养箱。
[0018] 上述装置的结构设计，提供了幼虫到蜂蛹的培养容器-蜂蛹培养杯2,同时，该容器 还可以接入大蜂螨以及对大蜂螨具有不同毒性的药物，使得，检测更接近自然状态，更加逼 真。同时，该装置还方便了多样本的检测，利用多孔的蜂蛹培养板1，使一次检测可以进行几 十个重复，适合毒性检测这种需要大样本检测的实验。
[0019] 本发明方法利用上述装置进行检测，其优点是：（1)试验条件可控；（2)对照组蜂螨 存活率高，存活时间长;（3)省时省力；（4)结果准确可信。
[0020] 该方法可用于杀螨剂对大蜂螨的急性毒力测定和慢性毒性测定，为筛选杀螨药物 提供了简便可信的测定方法，可大大缩短绿色杀蜂螨药物的研究开发利用周期，既有重要 的研究意义又有广阔的市场前景。
【附图说明】
[0021] 图1为本发明测定药物对大蜂螨毒性的装置的侧视图（放入蜂蛹培养杯的24孔蜂 蛹培养板侧面图）；
[0022]图2为蜂蛹培养板；
[0023]图3为蜂蛹培养杯；
[0024]图4为放入蜜蜂幼虫并封口的蜂蛹培养杯；
[0025]图5为幼虫培养板；
[0026]图6为蜜蜂发育各阶段图。
[0027]图7为毒力测定实验，待测大蜂螨和蜜蜂的发育。
[0028]图1-图5,图中，1为蜂蛹培养板，2为蜂蛹培养杯，3为用于封口的透气的透明薄膜， 4为滤纸片，5为蜂蛹，6为大蜂螨。
[0029]图6中，图片说明如下：
【具体实施方式】
[0031] 根据本发明，提供测定药物对大蜂螨毒性的方法，具体的，包括如下步骤：
[0032] 1)将待测药物按照处理组设置，用溶剂配制成不同待测浓度药液，将待测定量药 液轻轻喷于的健康的蜜蜂幼虫体表，然后将蜜蜂幼虫置于一只34.5°C预热后的蜂蛹培养杯 内；对照组用溶剂处理;所述蜂蛹培养杯底部铺设相应浓度药物浸润后晾干的滤纸片；
[0033] 2)从准备的养螨脾上收集待测大蜂螨，每个处理组和对照组的蜂蛹培养杯内接入 一只大蜂螨，并用透气的透明薄膜封住蜂蛹培养杯的杯口，将蜂蛹培养杯放到蜂蛹培养板 的孔内，每孔一只，将蜂蛹培养板放入培养箱中，温度为34.5°C，相对湿度为75% ;
[0034] 3)统计48h或72h的不同处理组大蜂螨死亡数，计算死亡率，分析药物对大蜂螨的 急性毒性;或每天连续记录试验蜂螨的存活情况，统计每只蜂螨的存活时间，分析药物对大 蜂螨的慢性毒性;其中，死亡率=死亡的蜂螨数/接入的蜂螨数。
[0035]所述方法中，所述健康的蜜蜂幼虫处于封盖幼虫期。
[0036] 所述方法中，所述健康的蜜蜂幼虫是西方蜜蜂(Apis melifera)的幼虫。
[0037]所述方法中，所述健康的蜜蜂幼虫的培养方法如下：用产卵控制器控制蜂王在一 张空巢脾上产卵，24h后释放蜂王，3天后用移虫针将幼虫转移至装有饲料的34.5°C预热的 设有若干可容纳幼虫的孔的幼虫培养板内，每孔移入一只蜜蜂幼虫;幼虫培养板放置到培 养箱内，温度为34.5°C，相对湿度95 %，连续饲喂6天;第1天饲喂10此饲料A，第2天饲喂10此 饲料A，第3天饲喂20yL饲料B，第4天饲喂30yL饲料C，第5天饲喂40yL饲料C，第6天饲喂50yL 饲料C，得到健康的蜜蜂幼虫;所述饲料A由含有重量百分含量为44.25%的蜂王浆、重量百 分含量为5.3%的葡萄糖、重量百分含量为5.3%的果糖、重量百分含量为0.90 %的酵母提 取物和重量百分含量为44.25 %的水组成;所述饲料B由含有重量百分含量为42.95 %的蜂 王衆、重量百分含量为6.40%的葡萄糖、重量百分含量为6.40%的果糖、重量百分含量为 1.30 %的酵母提取物和重量百分含量为42.95 %的水组成;所述饲料C由含有重量百分含量 为50.00 %的蜂王浆、重量百分含量为9.00 %的葡萄糖、重量百分含量为9.00 %的果糖、重 量百分含量为2.00 %的酵母提取物和重量百分含量为30.00 %的水组成。
[0038] 具体的，34.5°C预热后的蜂蛹培养杯的准备方法如下：待测药物用溶剂配制成不 同待测浓度药液，将定量药液滴到备好的滤纸片上，滤纸片全部浸湿，然后将涂药的滤纸片 放置在超净台内待溶剂挥发晾干后，放入到蜂蛹培养杯的底部，每个蜂蛹培养杯一张滤纸 片，将蜂蛹培养杯放置于蜂蛹培养板的孔内，蜂蛹培养板放置到培养箱内，34.5°C预热待 用;对照组用溶剂处理；
[0039] 本发明的方法中使用了测定药物对大蜂螨毒性的装置，本发明所述的测定药物对 大蜂螨毒性的装置，包括蜂蛹培养板1和蜂蛹培养杯2，所述蜂蛹培养板是设若干孔，所述孔 的大小与蜂蛹培养杯相应，每个孔可容纳一只蜂蛹培养杯;所述蜂蛹培养杯为杯状体，所述 蜂蛹培养杯的底部铺设滤纸片4,杯口设用于封口的透气的透明薄膜3。
[0040] 在本发明的一个实施方式中，所述蜂蛹培养板设24-48个可容纳蜂蛹培养杯的孔。 [0041 ]进一步的，本发明的装置还包括可提供培养温度34.5 °C、相对湿度为75 % -95 %的 培养箱。
[0042]上述装置的结构设计，提供了幼虫到蜂蛹的培养容器-蜂蛹培养杯，同时，该容器 还可以接入大蜂螨以及对大蜂螨具有不同毒性的药物，使得，检测更接近自然状态，更加逼 真。同时，该装置还方便了多样本的检测，利用多孔的蜂蛹培养板1，使一次检测可以进行几 十个重复，适合毒性检测这种需要大样本检测的实验。
[0043] 实施例
[0044] 实施例1、药物对大蜂螨的毒性的测定方法
[0045] 试验前准备:西方蜜蜂(Apis melifera)蜂群(健康群，感染蜂螨群），培养箱，超净 台，天平，磁力搅拌器，混匀振荡器，温湿度计，移液器，超净台加热器，冷光源照明，产卵控 制器，移虫针，镊子，48孔幼虫培养板，幼虫培养杯，，蜂螨收集器(带盖培养皿），移螨用小毛 刷，石蜡膜，巢脾保温盒，乳胶手套，口罩，蜂王浆，葡萄糖，果糖，酵母提取物，硫酸钾，氯化 钠，双蒸水，待测药物。如无特殊说明，本实施例所用的药物和器材均可以从商业途径获得。
[0046] 1准备蜂螨
[0047] 检查蜂群中大蜂螨寄生率，选择寄生率高的蜂群为养螨群，终年不治螨。大蜂螨毒 力试验开始时，从养螨群中取出新封盖的子脾。逐一打开巢房，收集大蜂螨备用。
[0048] 2饲养蜜蜂幼虫
[0049]用产卵控制器控制蜂王在一张空巢脾上产卵，24h后释放蜂王，3d后用移虫针将幼 虫转移至装有人工饲料的已预热的48孔幼虫培养板内（图5)，每孔移入一只幼虫。培养板放 置到培养箱内，温度为34.5 °C，相对湿度95 %。连续饲喂6天，第1天饲喂10此饲料A，第2天饲 喂10yL饲料A，第3天饲喂20yL饲料B，第4天饲喂30yL饲料C，第5天饲喂40yL饲料C，第6天饲 喂50yL饲料C，第7天转移至本发明的测定药物对大蜂螨毒性的装置。
[0050] 上述饲料配方如表1所示，表1中所述的百分含量均为重量百分含量。
[0051] 表1.
[0053] 蜜蜂从卵到出房(羽化)21天。第4天（1日龄幼虫)开始在实验室养，用的是幼虫培 养板，第10天(封盖幼虫期)转移到蜂蛹培养板，给药和接螨也是这一天。具体操作见下表2。
[0054] 表2.
[0056]
[0057] 3 施药
[0058]利用本发明药物对大蜂螨毒性的装置进行测试，将蜂蛹培养杯（图3)放入到24孔 蜂蛹培养板（图2)内，每孔放入一个蜂蛹培养杯（图1)。待测药物按照试验要求配制成不同 浓度，将定量药液滴到备好的小纸片上，小纸片全部浸湿，涂药的小纸片放置在超净台内待 溶剂挥发晾干后，放入到蜂蛹培养杯内，每个培养杯一张纸片，蜂蛹培养板放置到培养箱 (34.5°C)内预热待用。幼虫转至蜂蛹培养板之前，将药液轻轻喷于的体表，然后将幼虫从幼 虫培养板内转移至蜂蛹培养板内。对照组用溶剂处理。
[0059] 4 接螨
[0060] 从准备的养螨脾上收集大蜂螨，每个处理组和对照组的蜂蛹培养杯内接入一只大 蜂螨，并用透气的透明薄膜封住培养孔（图3,图4)，防止接入的大蜂螨逃出培养孔，便于观 察蜂螨存活情况。将蜂蛹培养板放入培养箱中，温度为34.5°C，相对湿度为75%。
[0061 ] 5统计蜂螨死亡率
[0062] 统计48h或72h蜂螨死亡数，计算死亡率，分析药物对大蜂螨的急性毒性。或每天连 续记录试验蜂螨的存活情况，统计每只蜂螨的存活时间，分析药物对大蜂螨的慢性毒性。 [0063] 死亡率=死亡的蜂螨数/接入的蜂螨数。
[0064] 6、绳毒磷(Coumaphos)对大蜂螨的毒力测定
[0065] 按照上述步骤1-5进行绳毒磷(Coumaphos)对大蜂螨的毒力测定，每个处理3个重 复，每重复12只大蜂螨，如表2所示，D10(即封盖幼虫第1天)药剂处理，同时接入蜂螨，48h后 统计蜂螨死亡率。具体结果如表3所示。
[0066]表3.
[0068]表3 中，lppm = 0.001%。，重量百分比。
[0069] 7、蝇毒磷(Coumaphos)对大蜂螨的慢性毒性试验
[0070] 按照上述步骤1-5进行蝇毒磷(Coumaphos)对大蜂螨的慢性毒性试验，在如表2所 示的蜜蜂发育阶段中，蜜蜂发育第10天（即封盖幼虫第1天)接入蜂螨，第21天(蜜蜂出房或 羽化)检查死亡率。具体结果如表4所示，其中蜂螨在蜜蜂体上存活的图片如图7所示，其中， 自左第一个图片是蜂螨在蜂蛹培养杯内，看不清大蜂螨，自左第2-4张图片是蜜蜂和蜂螨从 蜂蛹培养杯中拿出来后拍的，自左第四张图片上显示有蜂螨繁殖的后代。
[0071] 表4.
[0073] 表4中，lppm = 0 ? 001%。，重量百分比。
[0074] 上述实验表明，本发明方法的优点：（1)试验条件可控；（2)对照组蜂螨存活率高， 存活时间长;（3)省时省力；（4)结果准确可信。
[0075] 该方法可用于杀螨剂对大蜂螨的急性毒力测定和慢性毒性测定，为筛选杀螨药物 提供了简便可信的测定方法，可大大缩短绿色杀蜂螨药物的研究开发利用周期，既有重要 的研究意义又有广阔的市场前景。
[0076]以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来 说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为 本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种测定药物对大蜂螨毒性的方法，包括如下步骤： 1) 将待测药物按照处理组设置，用溶剂配制成不同待测浓度药液，将待测定量药液轻 轻喷于的健康的蜜蜂幼虫体表，然后将蜜蜂幼虫置于一只34.5°C预热后的蜂蛹培养杯内； 对照组用溶剂处理;所述蜂蛹培养杯底部铺设相应浓度药物浸润后晾干的滤纸片； 2) 从准备的养螨脾上收集待测大蜂螨，每个处理组和对照组的蜂蛹培养杯内接入一只 大蜂螨，并用透气的透明薄膜封住蜂蛹培养杯的杯口，将蜂蛹培养杯放到蜂蛹培养板的孔 内，每孔一只，将蜂蛹培养板放入培养箱中培养，温度为34.5°C，相对湿度为75% ; 3) 统计不同时间段的不同处理组大蜂螨死亡数，计算死亡率，分析药物对大蜂螨的急 性毒性;或每天连续记录试验蜂螨的存活情况，统计每只蜂螨的存活时间，分析药物对大蜂 螨的慢性毒性;其中，死亡率=死亡的蜂螨数/接入的蜂螨数。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述健康的蜜蜂幼虫处于封盖的幼虫期。3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述健康的蜜蜂幼虫是西方蜜蜂(Apis mel if era)的幼虫。4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述健康的蜜蜂幼虫的培养方法如下：用 产卵控制器控制蜂王在一张空巢脾上产卵，24h后释放蜂王，3天后用移虫针将幼虫转移至 装有饲料的34.5°C预热的设有若干可容纳幼虫的孔的幼虫培养板内，每孔移入一只蜜蜂幼 虫;幼虫培养板放置到培养箱内，温度为34.5°C，相对湿度95%，连续饲喂6天;第1天饲喂10 yL饲料A，第2天饲喂10yL饲料A，第3天饲喂20yL饲料B，第4天饲喂30yL饲料C，第5天饲喂40μ L饲料C，第6天饲喂50yL饲料C，得到健康的蜜蜂幼虫;所述饲料Α由重量百分含量为44.25 % 的蜂王浆、重量百分含量为5.3%的葡萄糖、重量百分含量为5.3%的果糖、重量百分含量为 0.90 %的酵母提取物和重量百分含量为44.25 %的水组成；所述饲料B由重量百分含量为 42.95 %的蜂王浆、重量百分含量为6.40 %的葡萄糖、重量百分含量为6.40 %的果糖、重量 百分含量为1.30 %的酵母提取物和重量百分含量为42.95 %的水组成;所述饲料C由重量百 分含量为50.00 %的蜂王浆、重量百分含量为9.00 %的葡萄糖、重量百分含量为9.00 %的果 糖、重量百分含量为2.00 %的酵母提取物和重量百分含量为30.00 %的水组成。5. -种测定药物对大蜂螨毒性的装置，包括蜂蛹培养板和蜂蛹培养杯，其特征在于:所 述蜂蛹培养板是设若干孔，所述孔的大小与蜂蛹培养杯相应，每个孔可容纳一只蜂蛹培养 杯;所述蜂蛹培养杯为杯状体，所述蜂蛹培养杯的底部铺设滤纸片，杯口设用于封口的透气 的透明薄膜。6. 根据权利要求5所述的装置，其特征在于:所述蜂蛹培养板设24-48个可容纳蜂蛹培 养杯的孔。7. 根据权利要求5所述的装置，其特征在于:所述装置还包括可提供培养温度34.5 °C、 相对湿度为75 %-95 %的培养箱，使用时，所述蜂蛹培养板和蜂蛹培养杯置于培养箱内。
【文档编号】A01K67/033GK105850898SQ201610375448
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年5月31日
【发明人】代平礼, 罗其花, 王星, 刁青云, 侯春生
【申请人】中国农业科学院蜜蜂研究所