一种龙脑樟组织培养快速繁育方法
【专利摘要】本发明公开了一种龙脑樟组织培养快速繁育方法，本方法包括外植体消毒杀菌、不定芽诱导、增殖继代培养、生根培养以及炼苗移栽，并对各步骤具体参数进行改进，同时对不定芽诱导培养基、增殖继代培养基、生根培养基成分及参数进行优化，本发明通过植物组织培养方法短时间内获得大量优质龙脑樟种苗的方法。以龙脑樟萌发芽为外植体，经过外植体消毒、不定芽诱导培养、增殖继代培养、生根培养、炼苗及移栽等步骤建立了一套完善的龙脑樟组织培养快速繁育方法，为满足对龙脑樟优质种苗的需求、加速龙脑樟良种的推广具有重要的现实意义，同时该套方法相较于其他的培养方法再生率高、出芽多，植株移栽成活率可达到90％以上。
【专利说明】
_种龙脑樟组织培养快速繁育方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种植物的繁殖方法，尤其是一种龙脑樟组织培养快速繁育方法。
【背景技术】
[0002] 长期以来对龙脑樟的开发利用多以提取精油为主，过度采伐导致其资源严重破 坏，尤其是优树资源趋于枯竭。近年来其人工林发展规模急剧扩大，市场上对于龙脑樟优质 苗木的需求不断增长。要加速龙脑樟的产业开发，必须建立规模化的苗木和原料林基地，如 何使龙脑樟优良母株的各种优良性状在后代个体中遗传性稳定，提高龙脑樟的龙脑含量， 提高成活率和生长整齐度，是实现龙脑樟种苗产业开发、生产关键技术。
[0003] 目前，龙脑樟树主要是通过种子、扦插、组织培养等方式进行繁育，种子繁育最大 的缺陷是后代个体变异性非常大，母株的诸多优良性状，如高龙脑含量及抗病丰产性能在 后代中很难稳定延续;扦插繁育虽然能有效解决后代个体差异问题，单扦插成活率低;采用 组织培养技术不仅能克服上述缺陷，同时在短期内即可获得大量优质苗木，但是组织培养 体系同样存在着不完善的问题，快繁增殖系数低、生根苗根系差、容易脱叶、木质程度不够 等导致田间种植成活率低等客观事实，大大限制了龙脑樟组织培养产业的发展。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种龙脑樟组织培养快速繁育方法，可有效提高龙脑樟的 增殖系数、生根率以及成活率。
[0005] 为实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：
[0006] -种龙脑樟组织培养快速繁育方法，包括如下步骤：
[0007] (1)剪取龙脑樟单株的萌发芽做为外植体，用质量百分数0.05%的洗洁精浸泡 5min，自来水冲洗后，移置于超净工作台上；在75%乙醇中浸泡30秒，无菌水冲洗2遍后，用 0.1%升汞消毒lOmin，无菌水清洗3次后，再用无菌吸收纸去掉表面水分待用；
[0008] (2)将步骤（1)处理后的外植体接种到不定芽诱导培养基中，先在25-28°C条件下 全暗培养1-3天，然后置于每天光照10-12小时，光照强度为1500-30001X，直至诱导形成不 定芽;所述不定芽诱导培养基包括:MS培养基、6-BA 0.5-1.Omg/L、NAA 0.1-0.5mg/L、谷氨 酰胺〇 · 5-1 · 0mg/L、DA-6 0 · 02-0 · 05mg/L、琼脂5 · Og/L、蔗糖30g/L;
[0009] (3)将步骤(2)培养的外植体的愈伤组织上的不定芽长至约2-3cm时切下，并接种 至增殖继代培养基上进行增殖继代培养，接种后先在25-28Γ条件下全暗培养3-5天，然后 置于每天光照10-13小时，光照强度为3500-45001x，置于培养温度为25-28°C的条件下培养 2-3周后，龙脑樟的组培苗开始形成，每25-35天继代转管一次，继代5次生成生长健壮的试 管苗；
[0010] ⑷生根培养:将步骤(3)过程获得的高度约为3.5-5.5cm的小芽分切下并接种到 生根培养基上进行生根培养，接种后先在25-28 °C条件下全暗培养3-7天，然后置于每天光 照12-15小时，光照强度为1500-25001X，培养温度为25-28°C的条件下培养20天左右即开始 生根；
[0011] (5)炼苗移栽:将步骤(4)获得的高约5-7cm、生长健壮、根系粗壮、叶色浓绿的生根 组培苗置于自然光照下炼苗3-5天后，将组培苗从培养瓶中取出，洗掉根部培养基并在多菌 灵溶液中浸泡8-10s，栽入由草炭土:沙土 = 3:1混合成的基质，保持湿度并给予60-80%的 遮阴处理;移栽时选择室外最高气温稳定达到18°C以上时移栽，移栽后每天进行叶片喷施 清水，早中晚各1次，促进其进一步生长，同时要避免因根部过长而在移栽过程中受伤。
[0012] 优选地，上述步骤（3)中所述增殖继代培养基包括:MS培养基、ZT 2.0-6.0mg/L、 IBA 0.5-1.0mg/L、5.0g/L琼脂、30g/L鹿糖。
[0013] 优选地，上述步骤(4)中所述生根培养基包括：1/2MS培养基、IBA 0.1-0.5mg/L、 NAA 0 · 1 -0 · 2mg/L、5 · Og/L琼脂、20g/L蔗糖，所述 1 /2MS是MS全量减半。
[0014] 与现有技术相比，本发明的优点：1、本发明通过植物组织培养方法短时间内获得 大量优质龙脑樟种苗的方法。以龙脑樟萌发芽为外植体，经过外植体消毒、不定芽诱导培 养、增殖继代培养、生根培养、炼苗及移栽等步骤建立了一套完善的龙脑樟组织培养快速繁 育方法，为满足对龙脑樟优质种苗的需求、加速龙脑樟良种的推广具有重要的现实意义，同 时该套方法相较于其他的培养方法再生率高、出芽多，植株移栽成活率可达到90 %以上。2、 在本发明的不定芽诱导培养基中，还加入了DA-6(己酸二乙氨基乙醇酯），DA-6作为一种植 物生长调节剂，通常用于田间栽培，很少用于组织培养，但是在本发明中，发现培养物对DA-6的加入非常敏感，不定芽的再生效率显著提升了。
【具体实施方式】
[0015] 下面对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被 本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
[0016] 实施例1
[0017] -种龙脑樟组织培养快速繁育方法：
[0018] (1)剪取龙脑樟单株的萌发芽做为外植体，用质量百分数0.05%的洗洁精浸泡 5min，自来水冲洗后，移置于超净工作台上；在75%乙醇中浸泡30秒，无菌水冲洗2遍后，用 0.1%升汞消毒lOmin，无菌水清洗3次后，再用无菌吸收纸去掉表面水分待用；
[0019] (2)将步骤（1)处理后的外植体接种到不定芽诱导培养基中，先在25-28Γ条件下 全暗培养3天，然后置于每天光照12小时，光照强度为30001x，直至诱导形成不定芽;所述不 定芽诱导培养基包括:MS培养基、6-BA 1.0mg/L、NAA 0.2mg/L、谷氨酰胺0.5mg/L、DA-6 0 · 05mg/L、琼脂 5 · Og/L、鹿糖 30g/L;
[0020] (3)将步骤(2)培养的外植体的愈伤组织上的不定芽长至约2-3cm时切下，并接种 至增殖继代培养基上进行增殖继代培养，所述增殖继代培养基包括:MS培养基、ZT 4mg/L、 IBA 0.5mg/L、5. Og/L琼脂、30g/L蔗糖;接种后先在25-28°C条件下全暗培养3天，然后置于 每天光照12小时，光照强度为40001x，置于培养温度为25-28 °C的条件下培养3周后，龙脑樟 的组培苗开始形成，每30天继代转管一次，继代5次生成生长健壮的试管苗；
[0021] (4)生根培养:将步骤(3)过程获得的高度约为3.5-5.5cm的小芽分切下并接种到 生根培养基上进行生根培养，所述生根培养基包括：1/2MS培养基、IBA 0.5mg/L、NAA 0. lmg/L、5. Og/L琼脂、20g/L蔗糖;接种后先在25-28°C条件下全暗培养6天，然后置于每天 光照15小时，光照强度为25001x，培养温度为25-28°C的条件下培养20天左右即开始生根； [0022 ] (5)炼苗移栽:将步骤(4)获得的高约5-7cm、生长健壮、根系粗壮、叶色浓绿的生根 组培苗置于自然光照下炼苗4天后，将组培苗从培养瓶中取出，洗掉根部培养基并在多菌灵 溶液中浸泡8-10s，栽入由草炭土:沙土 = 3:1混合成的基质，保持湿度并给予75%的遮阴处 理;移栽时选择室外最高气温稳定达到18 °C以上时移栽，移栽后每天进行叶片喷施清水，早 中晚各1次，促进其进一步生长，同时要避免因根部过长而在移栽过程中受伤。
[0023] 实施例2
[0024] -种龙脑樟组织培养快速繁育方法：
[0025] (1)剪取龙脑樟单株的萌发芽做为外植体，用质量百分数0.05%的洗洁精浸泡 5min，自来水冲洗后，移置于超净工作台上；在75%乙醇中浸泡30秒，无菌水冲洗2遍后，用 0.1%升汞消毒lOmin，无菌水清洗3次后，再用无菌吸收纸去掉表面水分待用；
[0026] (2)将步骤（1)处理后的外植体接种到不定芽诱导培养基中，先在25-28Γ条件下 全暗培养2天，然后置于每天光照11小时，光照强度为15001x，直至诱导形成不定芽;所述不 定芽诱导培养基包括:MS培养基、6-BA 0.5mg/L、NAA 0.3mg/L、谷氨酰胺0.7mg/L、DA-6 0 · 04mg/L、琼脂 5 · Og/L、鹿糖 30g/L;
[0027] (3)将步骤(2)培养的外植体的愈伤组织上的不定芽长至约2-3cm时切下，并接种 至增殖继代培养基上进行增殖继代培养，所述增殖继代培养基包括:MS培养基、ZT 6mg/L、 IBA 0.6mg/L、5.Og/L琼脂、30g/L鹿糖;接种后先在25-28°C条件下全暗培养5天，然后置于 每天光照10小时，光照强度为35001x，置于培养温度为25-28 °C的条件下培养2周后，龙脑樟 的组培苗开始形成，每25天继代转管一次，继代5次生成生长健壮的试管苗；
[0028] (4)生根培养:将步骤(3)过程获得的高度约为3.5-5.5cm的小芽分切下并接种到 生根培养基上进行生根培养，所述生根培养基包括：1/2MS培养基、IBA 0.7mg/L、NAA 0. lmg/L、5. Og/L琼脂、20g/L蔗糖;接种后先在25-28°C条件下全暗培养4天，然后置于每天 光照12小时，光照强度为15001x，培养温度为25-28°C的条件下培养20天左右即开始生根； [0029 ] (5)炼苗移栽:将步骤(4)获得的高约5-7cm、生长健壮、根系粗壮、叶色浓绿的生根 组培苗置于自然光照下炼苗3天后，将组培苗从培养瓶中取出，洗掉根部培养基并在多菌灵 溶液中浸泡8-10s，栽入由草炭土:沙土 = 3:1混合成的基质，保持湿度并给予65%的遮阴处 理;移栽时选择室外最高气温稳定达到18 °C以上时移栽，移栽后每天进行叶片喷施清水，早 中晚各1次，促进其进一步生长，同时要避免因根部过长而在移栽过程中受伤。
[0030] 实施例3
[0031] (1)剪取龙脑樟单株的萌发芽做为外植体，用质量百分数0.05%的洗洁精浸泡 5min，自来水冲洗后，移置于超净工作台上；在75%乙醇中浸泡30秒，无菌水冲洗2遍后，用 0.1%升汞消毒lOmin，无菌水清洗3次后，再用无菌吸收纸去掉表面水分待用；
[0032] (2)将步骤（1)处理后的外植体接种到不定芽诱导培养基中，先在25-28Γ条件下 全暗培养1天，然后置于每天光照12小时，光照强度为25001x，直至诱导形成不定芽;所述不 定芽诱导培养基包括:MS培养基、6-BA 0.8mg/L、NAA 0.2mg/L、谷氨酰胺0.8mg/L、DA-6 0 · 02mg/L、琼脂 5 · 0g/L、鹿糖 30g/L;
[0033] (3)将步骤(2)培养的外植体的愈伤组织上的不定芽长至约2-3cm时切下，并接种 至增殖继代培养基上进行增殖继代培养，接种后先在25-28Γ条件下全暗培养4天，然后置 于每天光照10小时，光照强度为45001X，置于培养温度为25-28Γ的条件下培养2周后，龙脑 樟的组培苗开始形成，每35天继代转管一次，继代5次生成生长健壮的试管苗；
[0034] (4)生根培养:将步骤(3)过程获得的高度约为3.5-5.5cm的小芽分切下并接种到 生根培养基上进行生根培养，接种后先在25-28Γ条件下全暗
[0035] 培养5天，然后置于每天光照13小时，光照强度为20001x，培养温度为25-28Γ的条 件下培养20天左右即开始生根；
[0036] (5)炼苗移栽:将步骤(4)获得的高约5-7cm、生长健壮、根系粗壮、叶色浓绿的生根 组培苗置于自然光照下炼苗4天后，将组培苗从培养瓶中取出，洗掉根部培养基并在多菌灵 溶液中浸泡8-10s，栽入由草炭土:沙土 = 3:1混合成的基质，保持湿度并给予80%的遮阴处 理;移栽时选择室外最高气温稳定达到18 °C以上时移栽，移栽后每天进行叶片喷施清水，早 中晚各1次，促进其进一步生长，同时要避免因根部过长而在移栽过程中受伤。
[0037] 将实施例1-3龙脑樟繁育过程情况进行统计，见表1
[0038] 表1实施例1-3龙脑樟繁育过程数据统计表 「00391
[0040]由上述数据可知，采用本发明的组织培养快速培育方法，龙脑樟繁育过程中，愈伤 组织诱导率、不定芽诱导率、小苗生根率、移栽成活率均能保持在较高水平。
【主权项】
1. 一种龙脑樟组织培养快速繁育方法，其特征在于，包括如下步骤： (1) 剪取龙脑樟单株的萌发芽做为外植体，用质量百分数0.05%的洗洁精浸泡5min，自 来水冲洗后，移置于超净工作台上;在75 %乙醇中浸泡30秒，无菌水冲洗2遍后，用0.1 %升 汞消毒lOmin，无菌水清洗3次后，再用无菌吸收纸去掉表面水分待用； (2) 将步骤（1)处理后的外植体接种到不定芽诱导培养基中，先在25-28Γ条件下全暗 培养1-3天，然后置于每天光照10-12小时，光照强度为1500-30001X，直至诱导形成不定芽； 所述不定芽诱导培养基包括:MS培养基、6-BA0.5-1.0mg/L、NAA0.1-0.5mg/L、谷氨酰胺0.5_ 1 · 0mg/L、DA-60 · 02-0 · 05mg/L、琼脂 5 · Og/L、蔗糖 30g/L; (3) 将步骤(2)培养的外植体的愈伤组织上的不定芽长至约2-3cm时切下，并接种至增 殖继代培养基上进行增殖继代培养，接种后先在25-28Γ条件下全暗培养3-5天，然后置于 每天光照10-13小时，光照强度为3500-45001x，置于培养温度为25-28°C的条件下培养2-3 周后，龙脑樟的组培苗开始形成，每25-35天继代转管一次，继代5次生成生长健壮的试管 苗； (4) 生根培养:将步骤(3)过程获得的高度约为3.5-5.5cm的小芽分切下并接种到生根 培养基上进行生根培养，接种后先在25-28Γ条件下全暗培养3-7天，然后置于每天光照12-15小时，光照强度为1500-25001x，培养温度为25-28°C的条件下培养20天左右即开始生根； (5) 炼苗移栽:将步骤(4)获得的高约5-7cm、生长健壮、根系粗壮、叶色浓绿的生根组培 苗置于自然光照下炼苗3-5天后，将组培苗从培养瓶中取出，洗掉根部培养基并在多菌灵溶 液中浸泡8-10s，栽入由草炭土:沙土 = 3:1混合成的基质，保持湿度并给予60-80%的遮阴 处理;移栽时选择室外最尚气温稳定达到18 °C以上时移栽，移栽后每天进彳丁叶片喷施清水， 早中晚各1次，促进其进一步生长，同时要避免因根部过长而在移栽过程中受伤。2. 根据权利要求1所述的龙脑樟组织培养快速繁育方法，其特征在于，步骤(3)中所述 增殖继代培养基包括:MS培养基、ZT2 · 0-6 · Omg/L、ΙΒΑ0 · 5-1 · Omg/L、5 · Og/L琼脂、30g/L蔗 糖。3. 根据权利要求1所述的龙脑樟组织培养快速繁育方法，其特征在于，步骤(4)中所述 生根培养基包括：1/2MS培养基、ΙΒΑ0 · 1-0 · 5mg/L、ΝΑΑ0 · 1-0 · 2mg/L、5 · 0g/L琼脂、20g/L蔗 糖，所述1/2MS是MS全量减半。
【文档编号】A01H4/00GK106069788SQ201610685332
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年8月15日 公开号201610685332.7, CN 106069788 A, CN 106069788A, CN 201610685332, CN-A-106069788, CN106069788 A, CN106069788A, CN201610685332, CN201610685332.7
【发明人】蒋志坚
【申请人】湖南龙脑樟种植开发有限公司