一种杂交鹅掌楸体胚纯固体培养植株再生方法
【专利摘要】本发明公开了一种杂交鹅掌楸体胚纯固体培养植株再生方法，包括：1）杂交鹅掌楸胚性愈伤组织的诱导；2）以3/4MS+VC 5mg/L+蔗糖30g/L+氨基寡糖素0.01~0.1mg/L为基本培养基，24℃暗培养杂交鹅掌楸胚性愈伤组织；3）将材料转移至光照培养室组培瓶中，以3/4MS基本培养基继续培养至再生植株；4）将再生植株驯化后移栽。本发明的杂交鹅掌楸体胚纯固体培养植株再生方法，通过纯固体培养方式，跳过体胚发生过程中悬浮培养和平板培养这两个体胚诱导环节，优化并丰富杂交鹅掌楸体胚发生系统，从而更加高效便捷地获得高质量体胚再生植株。建立出稳固、高频、操作简单、苗木抗性良好的杂交鹅掌楸纯固体培养基体胚发生体系，为建立更加高效的杂交鹅掌楸遗传转化受体体系提供参考。
【专利说明】
一种杂交鹅掌楸体胚纯固体培养植株再生方法
技术领域
[0001] 本发明属于植物育种技术领域，具体涉及一种杂交鹅掌楸体胚纯固体培养植株再 生方法。
【背景技术】
[0002] 鹅掌楸的组织培养始于1986年，美国人Sommer等人对北美鹅掌楸进行了组织培养 试验，得到了一些植株。Parks等利用幼胚对北美鹅掌楸进行培养。国内研究杂交鹅掌楸体 胚成果最显著的是，陈金慧等人以未成熟种胚为外植体，经过愈伤组织诱导和悬浮培养，建 立起的杂交鹅掌楸一整套体细胞胚胎发生系统，以及体胚快速成苗体系。该研究在杂交鹅 掌楸体胚发生的各个培养阶段均优选出了最佳培养方案，其中包括愈伤组织诱导、继代、悬 浮培养、平板培养以及生根培养等最佳配方。另外，其在研究体胚发生过程中的激素变化、 蛋白质变化以及相关基因的表达与调控等方面，也有了比较明显的进展。再生植株的田间 试验结果表明，再生植株保持了明显的杂种优势，并在生长势、株型结构上明显优于同期的 扦插苗。
[0003] 现有的杂交鹅掌楸体胚发生体系主要包括愈伤组织诱导、胚性愈伤组织培养、悬 浮培养、平板培养、体胚再生植株培养几个重要环节。这种培养方法步骤多，时间久，还不够 便捷，需要对其进行进一步的创新，满足使用需求。
【发明内容】
[0004] 发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种杂交鹅掌楸体 胚纯固体培养植株再生方法，跳过体胚发生过程中悬浮培养和平板培养这两个体胚诱导环 节，从而更加高效便捷地获得高质量体胚再生植株。
[0005] 技术方案:为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：
[0006] -种杂交鹅掌楸体胚纯固体培养植株再生方法，包括以下步骤：
[0007] 1)杂交鹅掌楸胚性愈伤组织的诱导；
[0008] 2)以3/4MS+VC 5mg/L+蔗糖30g/L+氨基寡糖素0 · 01~0 · lmg/L为基本培养基，24 °C 暗培养杂交鹅掌楸胚性愈伤组织；
[0009] 3)待从愈伤组织表面长出胚状体，并发育至子叶胚时期后，将材料转移至光照培 养室组培瓶中，以3/4MS基本培养基继续培养至再生植株；
[0010] 4)将再生植株驯化后移栽到直径为5-8厘米的小盆中；随后进行正常的室外栽培。
[0011] 所述愈伤组织基因型包括:253010、C136、112040、82133。
[0012] 在所述的3/4MS+VC 5mg/L+蔗糖30g/L+氨基寡糖素0.01~O.lmg/U：咅养基中添加 有2.0mg/L的ΑΒΑ。
[0013] 有益效果:与现有技术相比，本发明的杂交鹅掌楸体胚纯固体培养植株再生方法， 通过纯固体培养方式，跳过体胚发生过程中悬浮培养和平板培养这两个体胚诱导环节，优 化并丰富杂交鹅掌楸体胚发生系统，从而更加高效便捷地获得高质量体胚再生植株。建立 出稳固、高频、操作简单、苗木抗性良好的杂交鹅掌楸纯固体培养基体胚发生体系，为建立 更加高效的杂交鹅掌楸遗传转化受体体系提供参考。
【附图说明】
[0014] 图1是氨基寡糖素诱导的杂交鹅掌楸体胚形态图；
[0015] 图2是不同浓度氨基寡糖素作用下基因型253010的体胚发生数结果图；
[0016]图3是不同浓度氨基寡糖素对基因型253010愈伤组织的影响图；图中a:处理前M13 培养基上的愈伤组织;b~i分别对应A1~A8号培养基愈伤组织；
[0017] 图4是0.01mg/L氨基寡糖素诱导基因型253010体胚发生过程图；图中a，b，c，d分别 为基因型253010体胚发生15d，30d，45d和60d;
[0018] 图5是不同浓度氨基寡糖素作用下基因型C136体胚发生数结果图；
[0019]图6是不同浓度氨基寡糖素作用下基因型112040体胚发生数结果图；
[0020]图7是不同浓度氨基寡糖素作用下基因型82133体胚发生数结果图；
[0021] 图8是不同基因型在氨基寡糖素作用下的总体胚发生情况结果图；
[0022] 图9是氨基寡糖素诱导的体胚再生植株图；
[0023]图10是ΑΒΑ在鹅掌楸体胚发生中的作用结果图；图中，拍照时间为培养60d;a，b，c 为3/4MS诱导的愈伤组织，基因型分别为253010，112040，(：136;(1，6彳为3/4]^+484诱导的愈 伤组织，基因型分别为253010，112040，C136;
[0024]图11是ΑΒΑ联合氨基寡糖素诱导杂交鹅掌楸体胚产生图；图中，拍照时间为培养 60d;a，b，c为氨基寡糖素诱导的愈伤组织，基因型分别为253010，112040，C136;d，e，f为氨 基寡糖素+ABA诱导的愈伤组织，基因型分别为253010，112040，C136。
【具体实施方式】
[0025]下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。
[0026]以下实施例的材料为杂交鹅掌楸胚性愈伤组织，愈伤组织基因型包括:253010、 C136、112040、82133，该愈伤组织均呈淡黄色、致密、细小的颗粒状，生长速度适中且状态稳 定。该杂交鹅掌楸愈伤组织，利用未成熟胚诱导而形成，具体诱导方法为本领域常规技术。 [0027]以下实施例的数据分析方法为:采用SPSS16.0统计软件进行单因素方差分析(One Way AN0VA)，平均值的比较采用Duncan多重比较检验(Duncan,s multiple test)，显著性 水平设为α = 0.05和α = 〇. 〇1两个水平。采用Excel对SPSS软件分析结果进行绘图。
[0028] 实施例1
[0029] -种杂交鹅掌楸体胚固体培养快繁方法，包括以下步骤：
[0030] 1)杂交鹅掌楸胚性愈伤组织固体培养
[0031] 以3/4MS+VC5mg/L+蔗糖30g//L为基本培养基，分别附加不同浓度的氨基寡糖素组 成杂交鹅掌楸体胚诱导培养基。以不含氨基寡糖素的基本培养基为对照。采用4种基因型杂 交鹅掌楸胚性愈伤组织，设置9个浓度梯度(A1 0mg/L、A2 0.005mg/L、A3 0.01mg/L、A4 0.05mg/L、A5 0.1mg/L、A6 lmg/L、A7 10mg/L、A8 100mg/L、A9 500mg/L)，每个浓度至少接 种3皿，每皿接5块愈伤组织，每块愈伤组织直径约0.5cm，重量约1.6g/皿。起始培养环境为 24 °C暗培养。
[0032]将对图1中各种形态的体胚进行统计，作为总体胚数，已发育至鱼雷形胚及以后的 归为成熟体胚。其中总体胚主要为愈伤组织压平分散后，可以轻易分离的，表面光滑，呈球 形、椭球形、心形或不规则长形等性状的一个个体，能够看出与愈伤组织形态明显不同。 [0033] 如图2所示（图中，统计时间和照片拍摄时间相同，为处理后56d左右。字母表示各 培养基上总体胚之间的差异性比较以及成熟体胚之间的差异性比较;字母相同表示差异不 显著，不相同表示差异显著，大写字母表示0.01极显著水平，小写字母表示0.05显著水平。 标注代表A2~A8培养基与Al(CK)之间的相互比较，其中总体胚与总体胚进行比较，成熟 体胚与成熟体胚进行比较;*表示0.05显著水平，**表示0.01极显著水平。），杂交鹅掌楸愈 伤组织的体胚诱导数量在不同浓度培养基上差异显著，低浓度的氨基寡糖素能够促进杂交 鹅掌楸愈伤组织的体胚发生，而过高浓度的氨基寡糖素则会抑制其体胚的产生。基因型 253010，当氨基寡糖素浓度在0.01~0. lmg/L时，平均每克愈伤组织体胚发生数量最高，平 均最高可达2769个，约为对照组的3倍；当氨基寡糖素浓度>0. lmg/L时，其体胚诱导能力显 著下降，当浓度达l〇〇mg/L时(A8培养基），体胚诱导数量为1096个/克，仍比对照组高，但是 仅为A4培养基的40% ;然而，当浓度高达500mg/L时，愈伤组织状态变差，不产生体胚。另外， 根据图2-1显示，成熟体胚的发生与总体胚的趋势一致，在A5培养基上数量达到最高，平均 651个/克，且与A3、A4培养基差异不明显。因此基因型253010体胚发生所需的氨基寡糖素的 最佳浓度为0.01~〇· lmg/L。
[0034]如图3,与对照（图3b)相比，氨基寡糖素处理下的杂交鹅掌楸愈伤组织（图3c~i) 状态相对较好，色泽嫩黄，含水量较适中，体胚发生数量较多；而对照组愈伤组织则呈现参 差不齐的状态，其中一部分愈伤组织生长良好，能够产生体胚，而另一部分愈伤组织则呈褐 化、水渍状，不能产生体胚或者产生极少畸形胚。由此表明，氨基寡糖素能够改善杂交鹅掌 楸愈伤组织状态，提高体胚发生数量和质量。
[0035]基因型253010愈伤组织材料在含有0.01mg/L氨基寡糖素的培养基上，培养15d时 内含物明显增多（图4a)，培养25d开始出现大量球形胚，30d左右发育成鱼雷胚，并有大量球 形胚源源不断地产生（图4b);培养至45d时，一方面早期从愈伤组织表面产生的大部分体胚 发育成熟，可移到光照培养室进行培养至再生植株，另一方面原愈伤组织内部及表面酝酿 着大量的胚状体，不断涌现并且生长迅速（图4c);培养至60d时大部分子叶胚成熟，应及时 转至光照培养(图4d)。
[0036]基因型C136愈伤组织培养84d(即3个继代周期）时，开始统计每种培养基上每克愈 伤组织产生的所有体胚数量，包括球形胚等未成熟体胚。如图5(统计时间及拍摄时间为处 理后85d左右）中的数据显示，对照组A1与A2~A7处理组均差异极显著(P值<0.01);与A8培 养基差异显著（P值<0.05)。由此可见，添加浓度低于100mg/L的氨基寡糖素培养基(A2~ A8)都能促进杂交鹅掌楸愈伤组织的体胚的显著发生，其诱导的体胚数量最高为对照组的 5.45倍。基因型(：136愈伤组织在厶2^3^4^5培养基上，体胚发生数较高，且与其他培养基 差异极显著。其中，A3培养基总体胚及其成熟体胚数量均最高，分别为1417个/克和418个/ 克;其次是A4、A5培养基，总体胚及成熟体胚数量均与A3无明显差异;A2培养基虽然总体胚 数与其他三种培养基无明显差异，但是其诱导的成熟体胚数显著较低。另外，当氨基寡糖素 浓度>0. lmg/L时，体胚发生数量与其浓度呈明显的负相关。因此，氨基寡糖素对基因型 C136体胚诱导的最佳浓度为0.01~0. lmg/L。
[0037]基因型C136愈伤组织材料在含O.Olmg/L的氨基寡糖素培养基上增殖迅速，体胚发 生速度较快，但稍比基因型253010晚一些。培养25d左右愈伤组织颗粒增大，内含物增多，逐 渐变得饱满、紧实、光滑;到45d时形成大量密集的球形胚，65d左右发育至鱼雷胚时期，且部 分体胚较早发育成子叶胚;85d左右大部分体胚发育成熟，可移到光照培养室培养获得体胚 再生植株。
[0038] 基因型112040愈伤组织在3/4MS培养基上培养3个继代时间后愈伤组织状态变差， 呈浅褐色，水渍状，其体胚发生数量与添加氨基寡糖素的培养基差异极显著。统计结果（图 6,统计时间及照片拍摄时间为处理后85d)显示，A4培养基体胚诱导数量最高，与A3培养基 差异不明显，与A5培养基差异显著，与其他五种浓度培养基均差异极显著；另外A4培养基诱 导的成熟体胚数也达到了最高，且与A3、A5没有明显差异；因此，基因型112040体胚诱导所 需的氨基寡糖素最佳浓度为0.01~〇.〇5mg/L，平均每克愈伤组织体胚诱导数量高达1112 个，约为对照组的4倍，成熟体胚数约为对照组的2.8倍。
[0039]如图7所示，基因型82133在氨基寡糖素浓度为0.01~0.1mg/L时，体胚诱导状况较 好，A3、A4、A5培养基之间差异不明显，平均每克愈伤组织体胚诱导个数分别高达1139、 1149、1163,成熟体胚个数分别高达404、415、378，与其他浓度培养基差异均较显著，尤其是 与对照差异极显著。其次是A6与A7培养基，体胚诱导数量是CK组的3倍多，其中A6培养基诱 导的成熟体胚数与A3、A4和A5培养基没有明显差异。
[0040] 如图8所示，基因型253010体胚发生能力明显高于其他三个基因型，对氨基寡糖素 的敏感度也比较高；基因型112040与基因型82133的体胚发生数量以及对氨基寡糖素不同 浓度的响应变化较相似，总的来说均比基因型C136低，但是在高浓度氨基寡糖素培养基上 却比基因型C136高。
[0041] 表1氨基寡糖素作用下各基因型体胚发生速度
[0042]
[0044] 注:W表示week，周、星期
[0045] 从表1对照组可以看出，体胚发生速度为253010>C136>82133>112040,基因型 253010比其他基因型至少早一个继代周期。处理组各基因型之间体胚发生速度趋势与对照 组一致，但基因型253010和C136体胚发生均比对照组早1个星期左右，基因型112040比对照 组晚1~2个星期，基因型82133与对照组体胚发生速度差异较小。结合愈伤组织生长情况不 难发现氨基寡糖素在诱导体胚发生的同时，能够提高杂交鹅掌楸愈伤组织状态，保证体胚 正常发生。杂交鹅掌楸愈伤组织在不加任何激素的基本培养基上长时间培养，会出现生长 缓慢、含水量升高、褐化等现象，从而对细胞形成一定的逆境胁迫，并且有研究表明一定的 逆境胁迫可以刺激植物体细胞胚产生，因此推测基因型112040与82133提早出现体胚与其 愈伤组织状态变差有重要关系。另外，基因型82133体胚发生虽然早于112040,但是从体胚 发生到体胚再生植株生长这个周期为7周左右，比基因型112040约多3周，因此基因型 112040体胚发育速度高于基因型82133。
[0046] 2)待从愈伤组织表面长出胚状体，并发育至子叶胚时期后，调整培养条件，将材料 转移至光照培养室组培瓶中，以3/4MS基本培养基继续培养至再生植株。
[0047] 将杂交鹅掌楸成熟体胚连同其基部的部分愈伤组织转移到培养瓶中，并用镊子轻 轻压平，使其充分接触培养基，每瓶接5块，每块直径约0.8cm，用3/4MS基本培养基培养，培 养条件为24°C光照培养。通过观察发现，5d后子叶胚变绿，15~20d发育成小苗，而部分未成 熟胚继续发育生长，并最终发育生长为体胚再生植株。
[0048] 一个月后，以3/4MS基本培养基为对照，比较再生植株成苗率、分枝率、叶片数量、 叶片大小、生根数量、根系长度以及株高的差异。其中，成苗率=体胚再生植株数/体胚数量 X 100% ;分枝率=分枝植株数/总植株数X 100%。
[0049] 从图9 (图中，a为光照15d的对照组体胚再生植株，b为光照15d、60d、30d的氨基寡 糖素体胚再生植株)可以直观地看出氨基寡糖素诱导的体胚能够更好地发育成体胚再生植 株，再生植株数量、生长速度、发育情况皆优于对照组。
[0050] 对生长2个月的植株的成苗率及生长势进行统计，结果如下表2。
[0051 ]表2氨基寡糖素诱导的杂交鹅掌楸植株再生情况
[0052]
[0053] 注：同列字母相同表示差异不显著，不相同表示差异显著，大写字母表示0.01极显 著水平，小写字母表示〇. 05显著水平。
[0054]从表2可以看出，氨基寡糖素诱导的体胚成苗率均极显著高于对照组，最高达 83.14%，而氨基寡糖素0.01~0. lmg/L处理组与1.0~100mg/L处理组之间差异不显著。在 植株生长形态方面，植株的叶片数、株高及生根数各组之间没有明显差异;氨基寡糖素1.0 ~100mg/L处理组茎长显著低于对照组;各组之间分枝率和根长都存在差异。氨基寡糖素浓 度在1.0~100mg/L时，体胚再生植株分枝率最高，高达20.37 %，与对照组之间差异达到极 显著水平(P<〇. 01)，且显著高于〇. 〇lmg/L~0. lmg/L处理组。三组植株平均根系最长的是 氨基寡糖素1. 〇~l〇〇mg/L处理组，平均达2.54cm，与0.01~0. lmg/L处理组之间差异显著， 与对照组差异极显著，而0.01~0. lmg/L与对照组之间差异不明显。
[0055] 3)当再生苗长大后，将其驯化后移栽到直径为5-8厘米的小盆中；盆中培养基质为 混合均匀的草炭土:蛭石:珍珠岩=3:1:1(体积比），随后进行正常的室外栽培。
[0056] 实施例2
[0057] 一种杂交鹅掌楸体胚固体培养快繁方法，同实施例1，其中在最适浓度的氨基寡糖 素培养基(3/4MS+VC5mg/L+氨基寡糖素0 · 01~0 · lmg/L+鹿糖30g/L)中添加2 · Omg/L的ΑΒΑ， 对基因型253010、112040、(：136进行新的一轮体胚诱导培养，重复3次实验，每5(1观察记录一 次体胚发生状态，待各基因型体胚发育成熟采用称重法统计体胚发生数量。对基因型 253010培养56d进行统计分析，对基因型(：136,82133，112040培养84(1进行统计分析，每次继 代时间为28d。
[0058]选取氨基寡糖素0.01mg/L作为培养浓度，添加2. Omg/L ΑΒΑ，即诱导体胚培养基配 方为：3/4MS+VC5mg/L+氨基寡糖素0 · 0 lmg/L+ABA2 · 0mg/L+鹿糖 30g/L，ρΗ = 5 · 72，每5d 观察 一次体胚发生情况，结果如表3和图10，图11所示，ΑΒΑ在氨基寡糖素诱导体胚发生过程中， 对体胚发生和发育起明显的促进作用。
[0059] 从图10可见，与3/4MS基本培养基相比，3/4MS+ABA的培养基愈伤组织状态明显改 善，表现在:色泽鲜嫩，呈淡黄色，较早产生胚状体，体胚发育速度快且质量高。该培养基为 原杂交鹅掌楸体细胞胚胎发生系统中所用体胚诱导培养基。如图11，ΑΒΑ与氨基寡糖素联合 使用比只有氨基寡糖素诱导体胚能力强，表现在:体胚发生和发育速度较快，质量较高，体 胚发生数量增加。
[0060] 表3氨基寡糖素与ΑΒΑ对杂交鹅掌楸体胚诱导影响
[0061]
[0063]可见，在氨基寡糖素及ΑΒΑ+氨基寡糖素组中，各基因型的体胚数量均高于对照组 ΑΒΑ，并达到极显著水平；而在3/4MS组中体胚数量均低于ΑΒΑ对照组，并且只有基因型 253010的体胚数量与对照组间存在极显著差异，其余基因型的体胚数量均不与对照组间存 在明显差异。由图表可知，ΑΒΑ+氨基寡糖素培养基诱导数量最高，其中基因型253010的体胚 数量高达2803个/克；其次是氨基寡糖素培养基，其中基因型253010的体胚数量高达2556 个/克;而3/4MS基本培养基诱导体胚数量最低。再次说明在含氨基寡糖素的体胚诱导培养 基中添加2. Omg/L的ΑΒΑ能够提高体胚诱导能力，促进体胚发生。
【主权项】
1. 一种杂交鹅掌楸体胚纯固体培养植株再生方法，其特征在于，包括以下步骤： 1) 杂交鹅掌楸胚性愈伤组织的诱导； 2) 以3/4MS+VC 5mg/L+蔗糖30g/L+氨基寡糖素0 · 01~0 · lmg/L为基本培养基，24°C暗培 养杂交鹅掌楸胚性愈伤组织； 3) 待从愈伤组织表面长出胚状体，并发育至子叶胚时期后，将材料转移至光照培养室 组培瓶中，以3/4MS基本培养基继续培养至再生植株； 4) 将再生植株驯化后移栽到直径为5-8厘米的小盆中；随后进行正常的室外栽培。2. 根据权利要求1所述的杂交鹅掌楸体胚纯固体培养植株再生方法，其特征在于，所述 愈伤组织基因型包括：253010、C136、112040、82133。3. 根据权利要求1所述的杂交鹅掌楸体胚纯固体培养植株再生方法，其特征在于，在所 述的3/4MS+VC 5mg/L+鹿糖30g/L+氨基寡糖素0.01~0 · lmg/L培养基中添加有2 .Omg/L的 ABA〇
【文档编号】A01H4/00GK106069785SQ201610652356
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年8月10日 公开号201610652356.2, CN 106069785 A, CN 106069785A, CN 201610652356, CN-A-106069785, CN106069785 A, CN106069785A, CN201610652356, CN201610652356.2
【发明人】陈金慧, 周敏敏, 成铁龙, 施季森, 郑晨, 董艺妮, 陈婷婷
【申请人】南京林业大学