专利名称：慢粒人原代干祖细胞模型的构建方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种利用具有多向分化潜能的人原代造血干祖细胞来建立慢性粒细胞白血病(简称慢粒)模型的方法，涉及干祖细胞的分离、癌基因的转染、干祖细胞模型的构建，涉及利用此模型有效地再现慢粒病人造血干祖细胞粘附缺陷、增殖分化异常和凋亡延缓等特性，利用此模型细胞建立造血干祖细胞系。
目前国际上有几种不同的慢粒模型，如转基因鼠及细胞模型，但都不尽完善。在人慢粒中，p210BCR/ABL是在BCR启动子的调控下表达的，理想的模型应采用BCR的启动子，在BCR之后敲入(knock in)ABL基因，产生BCR/ABL基因敲入模型。但BCR/ABL癌基因对于胚胎发育中的敲入小鼠及转基因小鼠都是致死的，因此，此类模型没有成功报道。1990年Dr.Groffen在Nature杂志报道了采用MT启动子来建立转基因小鼠模型，但获得的小鼠都是急性淋巴细胞白血病模型；最近，Honda等采用在造血细胞中优势表达的tec基因的启动子建立转基因小鼠，除急淋外小鼠可发生髓系增生性疾病，非常近似于慢粒，但其发生率很低，且潜伏期很长(＞1年)。目前小鼠模型尚不能准确代表人类慢粒疾病，尤其不适合BCR/ABL癌基因信号传导分子水平的研究。另外人们还利用p210癌基因转染鼠32D细胞系及人MO7e细胞系后建立慢粒模型，但此为两个分化成熟的细胞系，不具有干祖细胞的多向分化潜能，不能反映出慢粒系克隆性干祖细胞疾病的特性。慢粒的发生是由于干祖细胞癌基因表达而诱导髓系细胞异常增生分化所致的慢性恶性肿瘤。只有人干祖细胞癌基因诱导的信号传导才能真正代表慢粒的病理发生发展过程。
本发明的目的是在国际上首次提出利用人原代CD34+造血干祖细胞建立慢粒模型的方法，此方法建立的模型能够有效地再现人慢粒的一些异常表型，如粘附缺陷、迁移异常、恶性髓系增殖与分化及凋亡延缓等特性。
本发明的目的是通过下述方法实现的一．人原代CD34+造血干祖细胞的分离通过Ficoll密度梯度离心富集脐带血CD34+lin-细胞，其纯度可达95％以上，在含有细胞因子TPO、SCF和Fit3L而无血清的培养基中培养。
二．载体的构建从IRES的上游克隆出完整的p210BCR/ABLcDNA，并构建一个新的逆转录病毒载体MSCV-p210BCR/ABL-IRES-eGFP载体，简称M-p210-G。逆转录病毒载体MSCV-IRES-EGFP的特点为1、具有较强启动子启始外源基因，尤其在造血干细胞高效表达。2、克服了第一代逆转录病毒载体所致功能基因Silencing缺点。3、该载体保留了分泌高滴度病毒上清的优势。
采用内核糖体启始序列(IRES)起始表达功能基因及筛选基因，可使单启动子同时翻译IRES引导的上、下游基因，以获得相同水平双蛋白表达，克服了以往载体内源启动子自相抑制蛋白表达作用。
采用最佳筛选基因绿荧光蛋白(GFP)，经64、65位点突变的增强绿荧光蛋白(EGFP)，特点为无需反应底物，荧光强度增至100倍，可获得含修饰基因表达的荧光阳性细胞，24小时可经流式细胞仪快捷分离、应用研究。
构建方法如图所示，将p210BCR/ABL克隆，酶切后连接于上游及下游EcoRⅠ酶切位点。参见图逆转录病毒载体设计，共转染及富集高滴度病毒上清转染人原代干祖细胞群。其中p代表将转染人原代干祖细胞的p210BCR/ABL基因，1为MSCV逆转录病毒启动子，2为IRES、内核糖体启始序列，3为EGFP、增强绿荧光蛋白的序列。
二．制备含p210BCR/ABL的高滴度病毒上清及基因转染人原代CD34+干祖细胞1．采用PCL-Ampho质粒快速转染系统，与逆转录病毒载体共同转染293Kj细胞。将PCL及病毒载体20微克质粒DNA加入725微升(0.25M)氯化钙与(PH=7.0)725微升2倍HBS缓冲液混匀，再与2百万个293Kj细胞共同培养(37℃)6小时。取出转染液加入15％甘油缓冲液5毫升，休克细胞1分钟，加入5毫升培养液培养细胞，第一及第二天收集含p210BCR/ABL修饰基因的病毒上清液，其滴度可高达106。
2．基因转染采用胶原包被转孔膜培养板、流式病毒转染方法。将胶原包被的0.4μm孔径转孔器放置于细胞培养板，病毒上清持续流过转孔膜，病毒上清与被转染细胞共同培养6小时2次，中间相隔12小时，细胞培养及基因转染全过程在低血清培养基进行。用流式细胞仪筛选出转染成功了的带绿荧光的eGFP+CD34+细胞，转染阳性率可高达30％以上。
参见图示其中4为PCL-Ampho质粒，5为293kj细胞，6为富集的病毒上清，7为转孔膜细胞培养板，8为人原始干祖细胞群与病毒共同培养以转染细胞，9为干祖细胞模型。
三．检测P210在克隆祖细胞中的表达情况，p210对细胞粘附、粘附介导的迁移、粘附介导的增殖、有丝分裂原活性、延缓凋亡、细胞分化和p27的作用情况。
1．p210BCR/ABL在转染细胞中的表达采用抗人BCR抗体做免疫组化实验，证明p210BCR/ABL在eGFP+CD34+细胞中稳定表达，同时用western blot测定证实p210BCR/ABL蛋白水平。
2．p210对细胞粘附的作用用FN或BSA包被48孔培养板，4℃下过夜，加入低浓度细胞因子无血清培养基和M-p210-G载体或不含有p210BCR/ABL的对照eGFP载体转染的CD34+细胞，共同培育2小时后，先按标准操作吹打培养液，悬浮并富集未粘附细胞，再用胰酶消化并富集粘附细胞。然后用这两种细胞分别做祖细胞集落培养实验，根据集落生成数目计算CFC的粘附率粘附率=粘附细胞集落/(粘附细胞集落+未粘附细胞集落)*100％。实验证实，eGFP转染的CFC粘附率为24.4±4％，而p210转染的CFC对FN的粘附大大减弱，为3.4±1％。
3．p210对细胞迁移的作用通过配体包被倾斜平皿迁移实验对p210BCR/ABL转染的细胞的粘附介导迁移性能进行测定。把CD34+细胞加入FN或BSA包被的平皿，倾斜平皿80°1小时，使所有细胞都位于平皿下方，然后把倾斜角度降至20°，在37℃下培养12小时。从平皿下方迁移到上方的细胞的比例即代表细胞的迁移能力。证实eGFP转染的细胞无迁移，而p210转染的细胞有10％异常迁移。
4．p210对增殖抑制的作用采用粘附介导的增殖抑制实验，研究p210对增殖抑制的作用，在FN或poly-L-lysine包被的平皿上培养p210BCR/ABL转染的CD34+细胞，用PI染色测定细胞周期，23％未粘附p210BCR/ABL转染的CD34+细胞进入细胞S期，经附粘12小时后，仍有16％未粘附p210BCR/ABL转染的CD34+细胞位于细胞S期，与对照载体转染的CD34+细胞50％的细胞周期粘附抑制相比，说明p210具有阻碍增殖抑制的作用。
5．p210对有丝分裂原活性的作用祖细胞集落培养实验证实p210转染CD34+细胞后，会促进其异常增殖。采用体外甲基纤维素半固体培养，培养体系含有IMDM、1.2％甲基纤维素、20mg/ml BSA、10ug/ml胰岛素、200ug/ml转铁蛋白、10-4mol/l2-巯基乙醇、100U/ml青霉素和链霉素、5 ng/ml G-CSF、5ng/ml SCF、5ng/ml IL-3和3U EPO。对照载体转染的CD34+细胞可产生82个集落，而p210转染的细胞集落数目异常增加至560个。
6．p210延缓凋亡的作用在无血清低细胞因子的培养基中培养p210或eGFP转染的CD34+细胞。低浓度细胞因子无血清培养基包括IMDM、20mg/ml BSA、10ug/ml胰岛素、200ug/ml转铁蛋白、10-4mol/l2-巯基乙醇、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素、200pg/ml GM-CSF、1,000 pg/ml G-CSF、200pg/ml SCF、50pg/ml LIF、200pg/ml MIP-1α和1000pg/ml IL-6。用7AAD实验证实p210转染CD34+细胞后可抑制其凋亡。
7．p210对细胞分化的作用采用p210和对照载体转染的CD34+细胞做祖细胞集落培养实验，根据所形成的髓系、红系与淋系集落的数目，研究p210对细胞分化的作用。实验证实p210可使髓系细胞异常分化。
8．p210与p27相关性(已知p27对含p210的CD34+细胞具有细胞周期抑制作用)试验表明p210转染CD34+细胞后，上调p27活性。p27因BCR/ABL的诱导而转位于细胞浆内。
我们建立的这个模型代表慢粒的慢性期。
四．慢粒人原代造血干祖细胞模型构建及其应用的例作用pCL质粒与M-p210-G载体共同转染293kj细胞，共同培育6小时，在第1及第2天内病毒上清液的滴度可高达106。收集病毒上清转染人原代CD34+造血干细胞，24小时后用流式细胞仪筛选出转染成功了的带绿荧光的eGFP+CD34+细胞，转染效率可高达30％以上。
采用抗人BCR抗体做免疫组化实验，证明p210BCR/ABL在eGFP+CD34+细胞中稳定表达，同时用western blot测定证实p210BCR/ABL蛋白水平。
用FN或BSA包被48孔培养板，4℃下过夜，加入低浓度细胞因子无血清培养基和M-p210-G或不含有p210BCR/ABL的对照eGFP载体转染的CD34+细胞，共同培育2小时后，证实p210减弱细胞的粘附作用。
把CD34+细胞加入FN或BSA包被的平皿，倾斜平皿80°1小时，使所有细胞都位于平皿下方，然后把倾斜角度降至20°，在37℃下培养12小时。从平皿下方迁移到上方的细胞的比例即代表细胞的迁移能力。证实p210转染的细胞异常迁移。
采用粘附介导的增殖抑制实验，在FN或poly-L-lysine包被的平皿上培养p210BCR/ABL转染的CD34+细胞，用PI染色测定细胞周期，证实p210可阻碍增殖抑制作用。转染CD34+细胞后，采用体外甲基纤维素半固体培养，比较p210及对照载体转染的CD34+细胞的集落数目，证实p210可致CD34+细胞异常增殖。
在无血清低细胞因子的培养基中培养p210或eGFP转染的CD34+细胞，用7AAD实验证实p210转染CD34+细胞可致其凋亡延缓。
采用p210和对照载体转染的CD34+细胞做祖细胞集落培养实验，根据所形成的髓系、红系与淋系集落的数目，研究p210对细胞分化的作用。实验证实p210可促进髓系细胞异常分化。
建立造血干祖细胞系原代造血干细胞经M-p210-G转染2天后，用流式细胞仪筛选出转染了癌基因的带绿荧光的干祖细胞，并种植于AFT024基质细胞包被的96孔板，每孔种植一个细胞，进行长期培养，待细胞长满孔后，换到一个大的培养板，传代50次。细胞表型为CD33+、CD34-。
本发明的优点是1．人慢粒原代干祖细胞模型的构建方法简便、可行、重复好。
2．人慢粒原代干祖细胞模型的细胞仍保持原细胞的分化、增殖潜能及表型。
3．快速转染系统简捷、有效，转染后，造血干祖细胞仍保持其原有的特性及分化潜能，体外可长期稳定表达修饰的基因。
4．以人原代细胞构建模型能够有效地再现人慢粒的特性。
权利要求
1.一种建立慢粒人原代干祖细胞模型的方法，其特征在于从脐带血中获得人原代CD34+干祖细胞，在病毒流式转染系统上，转染M-p210-G载体，结合流式细胞仪筛选出转染成功了的CD34+细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于以人原代干祖细胞构建模型能够有效地再现人慢粒的特性。(1)、p210BCR/ABL在转染细胞中高效表达。(2)、p210减弱细胞粘附作用。(3)、p210增加细胞粘附介导的迁移性能。(4)、p210对粘附介导的增殖抑制的作用。(5)、p210增加CD34+细胞的增殖力。(6)、p210抑制细胞凋亡。(7)、p210对细胞分化的作用，可使髓系细胞异常分化。(8)、p210上调p27活性。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于人慢粒原代干祖细胞模型的细胞仍保持原细胞的多向分化、增殖潜能及表型，体外可长期稳定表达修饰的基因。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于采用逆转录病毒载体，整合并高效表达p210BCR/ABL癌基因于人原代干祖细胞群。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于逆转录病毒载体与pCL质粒共同转染293Kj细胞，制备含p210BCR/ABL修饰基因的高滴度病毒上清，采用包被转孔膜培养器流式病毒转染法转染人原代干祖细胞。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于利用人原代干祖细胞慢粒模型细胞建立造血干相细胞系。
全文摘要
本发明公开了利用具有多向分化潜能的人原代造血干祖细胞建立慢性粒细胞白血病模型的方法,根据所述方法分离干祖细胞、转染癌基因、构建慢性粒细胞白血病模型,模型有效再现慢粒病人造血干祖细胞粘附缺陷、增殖分化异常和凋亡延缓等特性,所建模型的细胞在建立造血干祖细胞系中的应用。
文档编号C12N15/867GK1307101SQ0010126
公开日2001年8月8日 申请日期2000年1月25日 优先权日2000年1月25日
发明者赵春华 申请人:赵春华