专利名称：脱氧核糖核苷三磷酸的制备方法
技术领域：
本发明涉及人工合成DNA技术，特别是涉及人工合成DNA的必备前体原料的方法。
众所周知，脱氧核糖核苷三磷酸(DNTP)是人工合成DNA的必备前体原料，根据其结构的不同，DNTP可分为DATP、DCTP、DGTP和DTTP。人工合成DNA片断(基因)广泛应用于基因工程、分子生物学、生命科学、基因药物等方面。DNTP的制备研究曾有不少报道，如Chemical Abstract88，117297；ChemicalAbstract89，180281；Acta.Biochim.biophys.Acad.Sci.Hung.16，131-3(1981)。但所有这些方法均有一定的缺陷，大部分的生物生产方法的合成量在1mmol以下，化学法合成有的后处理相当困难，有的还需要使用大量的毒性较大的有机溶剂。
本发明的目的在于提供一种利用酶解-酶促-化学合成工艺制备脱氧核糖核苷三磷酸的方法。
本发明所述脱氧核糖核苷三磷酸的制备方法包括以下步聚DNMP酶制备的培养基组成细菌培养用酵母提取物5-10％、蛋白胨0.5-2％、磷酸二氢钾4-6％、磷酸氢二钾2-5％、葡萄糖10-15％、尿素0.5-3％、氯化钙0.2％、氯化锌0.2％，培养基经1.2公斤/平方厘米的蒸汽灭菌消毒后，接种，接种量为20-30％，50℃下强烈搅拌培养10-30小时，在1℃下离心收集菌体；菌体经高速搅拌后，用PH2-7的缓冲液萃取，缓冲液可以用柠檬酸钠-氢氧化钠-盐酸、氯化钾-盐酸、乙酸-乙酸钠、柠檬酸-柠檬酸钠、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠、磷酸氢二钠-磷酸二氢钾、磷酸二氢钾-氢氧化钠、磷酸氢二钠-柠檬酸、邻苯二甲酸氢钾-氢氧化钠等，萃取液不经纯化可直接使用。
商品DNA分散在水中制得DNA水溶液，DNA可分别来自于鲸鱼精、鲑鱼精、鲤鱼精、牛肝、牛胸腺等。在DNA溶液中加入锌离子使其浓度达到2×10-2-1×10-4M，锌离子可由乙酸锌、氯化锌、硫酸锌等提供。根据脱氧核糖核酸酶的活性加入其量，一般为DNA溶液量的二十——五十分之一。酶解在30-55℃下进行；酶解5-15小时。
DNMP水溶液用10M的氢氧化钾溶液调节PH为4-8，加入磷酸盐，如磷酸肌酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、PEP等；再加入金属离子，如硫酸锌、氯化锌、乙酸锌、氯化钙、硫酸镁、氯化镁、氯化钡，用ATP作催化剂，根据DNMP酶的活性加入DNMP酶，一般为每毫摩尔DNMP加入40-60单位酶。50-55℃保温48-96小时。
酶促反应完成后，加入等量的醇类溶剂，如甲醇、乙醇、丁醇、丁氧基乙醇，2-5倍量的磷酸或磷酸盐，20-40倍量的DCC，80-90℃下反应4-8小时。
DNTP合成完成后，得到的溶液为磷酸盐，DNMP、DNDP、DNTP和多磷化合物的混合溶液，该溶液经过层析分离可得到纯净的DNTP。
本发明采用酶解-酶促-化学合成全新工艺线路，采用天然DNA经溶液态脱氧核糖核酸酶的酶解可得到DNMP，DNMP的收率为70-90％。DNMP在经DNMP酶反应一步后结合化学反应，可分别转化为相应的DNTP，DNTP经层析法纯化，以钠盐或钡盐的形式沉淀分离。利用该方法得到的DNTP纯度为95％-97％。可满足DNA合成的需要。以DNA为原料计算，DNTP的总收率为45-80％。本发明不仅使DNTP的生产工艺变的简单，而且使生产量达到了摩尔级，适用于工业大量生产，并且污染性极小。
下面结合实施例，对本发明说明如下实施例1100克商品鲸鱼精DNA分散在水中制得浓度为1％的DNA水溶液。DNA还可分别来自于鲑鱼精、鲁鱼精、牛肝、牛胸腺等。在DNA溶液中加入氯化锌1.5克。加入脱氧核糖核酸酶(550单位/毫升)250毫升。酶解在30-50℃下进行。酶解时间10小时。酶解过程中有白色沉淀生成，酶解完成后，冷冻过夜，过滤除去沉淀。上清液层析分离。层析条件色层柱150×1000mm，100-200目阴离子交换树脂(Cl-)，解析液0.01N盐酸，流速200-250毫升/分钟。得到的DNMP蒸发浓缩，以钠盐形式沉淀，沉淀为白色粉末，DAMP23.3克，DCMP26.5克，DGMP22.1克，DTMP18.8克，总收率90.7％。
DNMP酶制备细菌培养用酵母提取物10％、蛋白胨0.5％、磷酸二氢钾4％、磷酸氢二钾4％、葡萄糖10％、尿素3％、氯化钙0.2％、氯化锌0.2％，余量为水溶液。培养基经1.2公斤/平方厘米的蒸汽灭菌消毒后，接种，接种量为20-30％，50℃下强烈搅拌培养24小时，在1℃下离心收集菌体。菌体经高速搅拌后，用PH2.8的磷酸氢二钠——柠檬酸缓冲液萃取，萃取液不经纯化可直接使用。
20克(约6mmol)DNMP溶于500毫升水中，溶液用10M的氢氧化钾溶液调节PH为4.2-4.4，加入磷酸氢二钠1.45克(10mmol)，再加入硫酸锌30毫克、ATP50毫克，加入300单位DNMP酶。50-55℃保温72小时。反应结束后，加温至90℃10分钟，冷冻，离心除去沉淀。上清液蒸发浓缩至200毫升，备用。
在上述得到的溶液中加入等体积的乙醇，2.5倍量的正磷酸，20倍量的DCC，80-90℃下反应5小时。反应结束后，过滤除去沉淀，蒸发除去溶剂，残留物溶于10升水中，层析分离。层析条件色层柱100×1000mm，200-400目阴离子交换树脂(Cl-)，解析液0.1N盐酸，流速50-80毫升/分钟。得到的DNTP蒸发浓缩，以钠盐形式沉淀，沉淀为白色粉末，DATP25.5克，DCMP24.1克，DGMP20.7克，DTMP26.2克，本步收率约67％，以DNA为起始原料计算，总收率60％。
实施例2DNMP的制备、DNMP和DNTP的层析分离同实施例1。
DNMP酶制备细菌培养用酵母提取物5％、蛋白胨2％、磷酸二氢钾2％、磷酸氢二钾2％、葡萄糖10％、尿素1％、氯化钙0.2％、氯化锌0.2％，余量为水溶液。培养基经1.2公斤/平方厘米的蒸汽灭菌消毒后，接种，接种量为20-30％，50℃下强烈搅拌培养12小时，在1℃下离心收集菌体。菌体经高速搅拌后，用PH4.9的磷酸氢二钠——磷酸二氢钾缓冲液萃取，萃取液不经纯化可直接使用。
20克(约6mmol)DNMP溶于500毫升水中，溶液用10M的氢氧化钾溶液调节PH为5.5-5.8，加入磷酸肌酸钠3.27克(10mmol)，再加入氯化钙50毫克、ATP100毫克，加入220单位DNMP酶。50-55℃保温48小时。反应结束后，加温至90℃10分钟，冷冻，离心除去沉淀。上清液蒸发浓缩至200毫升，备用。
在上述得到的溶液中加入等体积的乙醇，3倍量的正磷酸，25倍量的DCC，80-90℃下反应5小时。反应结束后，过滤除去沉淀，蒸发除去溶剂，残留物溶于10升水中，层析分离。最终得DATP27.4克，DCMP29.1克，DGMP24.4克，DTMP22.8克，本步收率约72％，以DNA为起始原料计算，总收率65％。
实施例3DNMP的制备、DNMP和DNTP的层析分离同实施例1。
DNMP酶的制备同实施例2。
20克(约6mmol)DNMP溶于500毫升水中，溶液用10M的氢氧化钾溶液调节PH为6.5-6.8，加入磷酸肌酸钠4.91克(15mmol)，再加入氯化镁40毫克、ATP100毫克，加入250单位DNMP酶。50-55℃保温48小时。反应结束后，加温至90℃10分钟，冷冻，离心除去沉淀。上清液蒸发浓缩至200毫升，备用。
在上述得到的溶液中加入等体积的乙醇，4倍量的正磷酸，35倍量的DCC，80-90℃下反应8小时。反应结束后，过滤除去沉淀，蒸发除去溶剂，残留物溶于10升水中，层析分离。最终得DATP29.6克，DCMP32.4克，DGMP25.2克，DTMP28.7克，本步收率约80.5％，以DNA为起始原料计算，总收率约72.5％。
权利要求
1.一种脱氧核糖核苷三磷酸的制备方法，包括以下步骤(1)酶解DNMP酶制备的培养基的基本组成和含量为5-10％的细菌培养用酵母提取物、0.5-2％的蛋白胨、4-6％的磷酸二氢钾、2-5％的磷酸氢二钾、10-15％的葡萄糖、0.5-3％的尿素、0.2％的氯化钙、0.2％的氯化锌，余量为水溶液；以上培养基经灭菌、接种、收集和萃取直接获得；萃取液不经纯化可直接使用；将商品DNA分散在水中制得DNA水溶液，在所述DNA溶液中加入锌离子使其浓度达到2×10-2-1×10-4M，根据脱氧核糖核酸酶的活性加入其量，酶解在30-55℃下进行；酶解5-15小时；(2)酶促DNMP水溶液用10M的氢氧化钾溶液调节PH为4-8，加入磷酸盐，再加入金属离子，用ATP作催化剂，根据DNMP酶的活性加入DNMP酶，50-55℃保温48-96小时；(3)化学合成酶促反应完成后，加入等量的醇类溶剂，2-5倍量的磷酸或磷酸盐，20-40倍量的DCC，80-90℃下反应4-8小时；所得混合液为磷酸盐，DNMP、DNDP、DNTP和多磷化合物；该溶液经过层析分离可得到纯净的DNTP。
2.如权利要求1所述的脱氧核糖核苷三磷酸的制备方法，其特征在于培养基经1.2公斤/平方厘米的蒸汽灭菌消毒后，接种，接种量为20-30％，50℃下强烈搅拌培养10-30小时，在1℃下离心收集菌体；菌体经高速搅拌后，用PH2-7的缓冲液萃取。
3.如权利要求2所述的脱氧核糖核苷三磷酸的制备方法，其特征在于缓冲液可以是柠檬酸钠-氢氧化钠-盐酸、氯化钾-盐酸、乙酸-乙酸钠、柠檬酸-柠檬酸钠、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠、磷酸氢二钠-磷酸二氢钾、磷酸二氢钾-氢氧化钠、磷酸氢二钠-柠檬酸、邻苯二甲酸氢钾-氢氧化钠；
4.如权利要求1所述的脱氧核糖核苷三磷酸的制备方法，其特征在于加入脱氧核糖核酸酶一般为DNA溶液量的二十——五十分之一。
5.如权利要求1所述的脱氧核糖核苷三磷酸的制备方法，其特征在于磷酸盐可以采用磷酸肌酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、PEP；金属离子可以用硫酸锌、氯化锌、乙酸锌、氯化钙、硫酸镁、氯化镁、氯化钡。
6.如权利要求1所述的脱氧核糖核管三磷酸的制备方法，其特征在于醇类溶剂可以是甲醇、乙醇、丁醇、丁氧基乙醇。
全文摘要
本发明涉及人工合成DNA的必备前体原料的制备方法。本发明采用酶解—酶促—化学合成全新工艺。采用天然DNA经溶液态脱氧核糖核酸酶的酶解可得到DNMP,DNMP收率为70—90%。DNMP在经DNMP酶反应一步后结合化学反应,可分别转化为相应的DNTP,经层析法纯化,以钠盐或钡盐的形式沉淀分离,可以得到纯度为95%—97%的DNTP。本发明不仅使DNTP的生产工艺变的简单,而且使生产量达到了摩尔级,适于工业生产,并且污染性极小。
文档编号C12P19/38GK1269422SQ0010084
公开日2000年10月11日 申请日期2000年2月17日 优先权日2000年2月17日
发明者郭焕芳 申请人:郭焕芳