不依赖品种的植物转化的快速方法

专利名称：不依赖品种的植物转化的快速方法
技术领域：
本发明涉及将感兴趣的遗传物质引入植物的方法，更具体说涉及已证明在基因水平上难以操纵的植物品种的转化和品系转变的方法。
背景技术：
在过去二十年中，方法学已进步到基因工程改造植物。一般它们是基于直接将DNA引入植物细胞或用根瘤土壤杆菌(Agrabaterium tumefaciens)介导间接转移。与直接转移有关的方法包括对培养的植物组织颗粒轰击和用聚乙二醇或电穿孔将DNA引入裸露植物细胞，即原生质体。见例如，Sawahel & Cove，biotech.Adv.10394-412(1992)；Christou，Cur.OPinion Biotech.4135-141(1993)；Gelvin，Cur.Opinion Biotech.9227-232(1998)和Birch，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.48297-326(1997)。大多数方法是品种专一性的，因为它们基于使用体外生长的可再生的植物系统，它是品种专一性的。除了一些经济上重要的作物如番茄、马铃薯和芸苔(canola)以外，目前可行的转化方法仅能用于少数几种品种。
育种的传统回交方法提供了将一种性状从一品系(供体)转移到另一品系(回归亲本)的机制。见例如Harlan和Pope，J.Heredity，13319-322(1922)。它对于玉米、大豆和棉花是特别有用的。成功的回交育种需要先前衍生的回归亲本；在选择中保持感兴趣的性状；充分回交以重建回归亲本的基因组。Allard，Principle of Plant Breeding，Wiley and Sons(1960)。在回交程序中，杂交群落以下式描述的速率提高回归亲本基因的纯合性纯合比例＝1-0.5m其中m是回交代数。用该公式可计算出98％以上的杂交基因组在6代后将成为纯合的回归亲本基因。然而该公式仅描述了不与待渐渗杂交的基因连接的基因组区域。连接区域达到纯合的速率依赖于染色体重组频率。在最详细的评估传统回交育种效力的一个研究中，在9个侧接限制性片段长度多态性(RFLP)基因座上检测到8个Tm-2-转换的同基因番茄品系。见Young和Tanksley，Theor.Appl.Genet.77353-359(1989)。回交10代后发现的，在下9代中保持尺寸不减小的最小供体染色体片段是4cM，11代后发现的最大尺寸是51cM(即比相应染色体的一半大)。在根据单序列重复(SSR)或RFLP的标记辅助选择中，可更快更清楚的进行重建，但需要用相对昂贵的方法筛选相当大的子代群，并可能因转基因随机插入独立的原代转化子而复杂化。
显然回交不是一种不重要的工作，因为对于大部分作物，同时需要数百种品系、杂交物或品种。例如在1998，美国大豆种子市场包括500种以上的品种，而美国玉米种子市场包括600种以上的杂交品种。回交方法的另一个主要缺点是非常耗时。通过回归回交的品系转变通常需要3-5次再回交，因此增加了至少2-4年的品种发育时间。
目前的转化方法有许多缺点。例如品系转变是一种将异源DNA从一种植物物种或品种通过不同的性(如授粉)或体(即细胞)杂交方法转移到另一种植物的方法。由于目前的方法是物种和品种专一性的，它们商业上仅能与允许将转基因从原代转化物转移到多种感兴趣品种的品系转变技术联用。另外，它们导致随机转基因插入宿主基因组。因此需要广泛筛选许多独立的转化物来鉴定稳定、可遗传，并能正确表达转基因的转化物。随后的转基因插入不可能在同一位点，从而使育种复杂化。连锁拖曳(即不良性状的共同遗传)和有限的操纵多个独立转基因性状的能力提出了进一步的困难。
发明简述申请人发明了一种将核酸引入植物并产生基因工程改造的植物的方法。该方法可用于玉米和小麦等植物，它们很难用当前的技术进行基因修饰。另外，本方法对回交方法有显著的改进，因为它在短得多的时间内达到了相同或更好的结果。
感兴趣的核酸不直接引入感兴趣的植物或称作受体。而是首先送到另一与受体不同的植物，称作供体或剪贴板物种。然后将核酸从供体移到受体。一种方法需要有性杂交或“杂交”两种植物。用供体的花粉对受体植物授粉。另一种方法是在细胞水平上进行的，将供体和受体植物的细胞或原生质体融合。本发明的一个特征使核酸从供体移动到受体，而不移动供体的任何天然基因组DNA。这是通过选择通常产生不稳定杂交子的供体/受体对完成的。这意味着各自的基因组是不稳定的，因此不能合并产生“杂交”植物。该现象在下文称作“产生不稳定子代或显示优先分离或分拣。”在供体和受体染色体临时性共存过程中，感兴趣基因的核酸移动到受体植物的基因组。本发明的另一个特征是通过用旁侧序列包围感兴趣的核酸来实现随机或位点专一性引入核酸，这些旁侧序列使得核酸转座到随机位置或指导核酸插入受体基因组的特定位置。
因此，本发明的一个方面涉及一种将遗传物质引入植物的方法，包括制备用具有5’和3’可切割旁侧序列的异源核酸转化的第一种植物，这些旁侧序列使异源核酸从一个基因组移动到另一个基因组；使第二种植物和转化的第一种植物杂交，其中第一和第二种植物在杂交后产生不稳定子代或显示优先分离或分拣；和选择含有异源核酸第二种植物的子代。
在优选例中，5’和3’可切割旁侧序列含有转座因子，第一种植物、第二种植物或第一和第二种植物都产生对转座因子专一性的转座酶。在另一个优选例中，5’和3’可切割旁侧序列是重组位点，第一种植物、第二种植物或第一和第二两种植物都产生对重组位点专一性的重组酶。
在其他优选例中，也称为供体或剪贴板物种的第一种植物是三囊草(Tripsacum)，也称为受体的第二种植物是玉米、小麦、大麦或燕麦。在另一个优选例中，供体是诸葛菜(Orychophragmus)，受体是十字花科植物如芸苔。其他优选供体/受体对是短绒野大豆(Glycine tomentella)/大豆、龙葵(Solanumphureja)/马铃薯、玉米/小麦、玉米/大麦、玉米/燕麦、狼尾草(Pennisetum)/小麦、狼尾草(Pennisetum)/大麦、鳞茎大麦(Hordeum bulbosum)/大麦、鳞茎大麦/小麦、Nicotiana digluta/烟草(Nicotiana tabacum)和小粒稻(Oryza minuta)/水稻。
在其他优选例中，供体和/或受体植物携带Se半配子(semigamy)突变。在另一个优选例中，供体和/或受体植物是携带导致多胚性的ms突变的大豆。
在本方法的其他优选例中，转基因通过靶向重组靶向进入作为整合基因座位的专一性预定的基因组位点。
本发明的相关方面针对在体细胞水平进行的将遗传物质引入植物的方法。该方法包括以下步骤
制备用异源核酸转化的第一种植物的细胞或原生质体，该异源核酸具有5’和3’可切割的旁侧序列，它能使异源核酸从一个基因组移动到另一个基因组；将细胞或原生质体与第二种植物的细胞或原生质体融合，产生融合细胞或融合原生质体，其中第一和第二植物在杂交后产生不稳定的子代或显示优先分离或分拣；从融合细胞或融合原生质体再生出整株植物；和选择含有异源核酸的再生植物的子代。还提供了融合细胞或原生质体本身。另外，本发明的方法产生与用其他方法产生的转基因植物具有不同基因组成的植物，因为该方法的最后结果是一种独立的植物，它通常没有原代转化物(即供体)的任何固有DNA。还提供了该植物的子代、植物部分和种子以及植物的种子部分。
本发明的方法提供了基本上所有作物物种，尤其是经济学上重要的品种的转基因操纵。该方法不仅一般用于几乎全部作物物种，而且它们还是快速的(1-2次杂交)，没有连锁拖曳的，和无品种依赖性的。另外，描述的方法是唯一的转化和品系转变的品种独立过程，可用于基因工程改造与其他品种杂交后不能回收的复合品系/杂交子。
附图简述


图1是pIC156的线状质粒图；图2是pIC216的线状质粒图；图3是pIC312的线状质粒图；图4是pIC31A2的线状质粒图；图5是pIC401的线状质粒图；和图6是pIC411的线状质粒图。
发明详述本发明的方法可产生转化的植物，该方法如下用能切割/重新插入的构建物(优选通过转座子介导的、或同源或非同源的重组机制)转化供体物种或突变株；将供体与受体杂交，其中供体和受体生物选自物种/突变株组合，在有性/体细胞杂交后产生的杂交子是不稳定的，并显示基因组不稳定性，和一种或两种纯亲本基因型；诱导或选择从受体上切下异源核酸并整合入供体亲本染色体中；最后，选择携带所述转基因的基本上遗传纯的受体植物子代。在用受体和供体生物的物种或突变株组合进行基因操纵时，异源遗传物质的流动是与固有基因流动完全分开的，这些生物在有性/体细胞杂交后产生杂交子，这些杂交子不显示同源/同源染色体的重组，而且不稳定，在有丝分裂或减数分裂后分拣出一种或两种类型的纯合亲本基因组。
术语“植物”指所有开花植物和植物的所有形式、品系和品种。本文所用的“转化的”意味着通过将异源DNA掺入细胞进行基因修饰。术语“异源”意味着在受体植物中通常找不到的DNA。
种间/属间杂交子中的物种专一性染色体消除(基因组分离)是公知的现象。然而许多情况下，对不稳定杂交子的兴趣有限，因为主要育种工作目的在于两个亲本基因组之间的染色体交换，作为外源染色体物质的基因渐渗方法。在本发明产生之前，不稳定杂交子分离性亲本基因组仅在产生单倍体植物(种间、属间杂交产生单倍体小麦、大麦、马铃薯)的系统方面，或在尝试实现野生物种的染色体材料渐渗种植作物(如从三囊草到玉米或短绒野大豆到大豆)的负面结果方面有所描述。
通常对于每种作物物种(包括其全部品种和品系)有着野生性亲属或突变形式，杂交后形成不稳定杂交子，并可能作为本文所定义的供体或剪贴板植物起作用。一种鉴定这类生物的经验方法包括将感兴趣的作物物种与许多相关物种杂交，并测试所得子代的基因组成。初步鉴定主要是单亲本子代的方法是文献中已知的，根据基于差异选择性性状或非选择性性状。广泛而可靠的测定子代基因型的方法有许多而且是简单的，依赖于分析基因组DNA中的各种标记。根据这种最初筛选和随后的基因型分析，可迅速鉴定合适的剪贴板生物。该基本标准外，选择供体/受体对，在原代杂交或其子代细胞中提供足够持续的杂交状态。虽然完全消除是所需的最终状态，在同一细胞中两种物种的染色体共存相当时间是重要的，因为它提供了足够时间从而能从“剪贴板”生物上切下转基因座，并整合到受体染色体的染色体中。
可用许多不同方法排除或最大程度减小杂交子中亲本基因组之间的物理性相互作用，尤其是染色体物质交换。最熟知的方法是基于使用种间或属间杂交-产生的杂交子几乎不显示任何同源染色体配对，因此限制了转变。另外，许多这样的杂交子或多或少是基因不稳定的，并且显示迅速消除一个亲本基因组的倾向。结果用这样的杂交，可将两个关系甚远的亲本生物的染色体置于一个杂交核中，产生在二亲本之间定向交换转基因材料的杂交状态。然而，两个亲本的固有染色体物质基本不相互作用，随后染色体消除将在F0、F1或BC1子代消除一个亲本。
除了在关系甚远的物种之间杂交作为允许实现临时杂交状态，然后迅速回复纯亲本基因组的一种方法以外，还有其他实现类似结果的方法。一种方法基于使用能减少或消除染色体交换，和/或在种间和种内杂交中导致纯亲本基因组分离的突变株。一个例子是棉花中的半配子，一种突变导致精核进入卵细胞但随后大概未发生核融合；两个核分别分裂，产生的F1植物是嵌合体，具有父本和母本型的单倍体组织区域。见Turcotte和Feaster，J.Hered.5855-57(1967)。另一种方法是熟知的月见草系统，其中所有染色体都参与转位，这种转位方式是F1与正常原种杂交将在减数分裂时形成含有染色体全部单倍体数目的一个环，从而排除了独立的染色体分拣。另一种方法(Pandey，N.Z.J.Bot.，18203-207(1980)或其他)用化学/物理处理(如辐射)一个亲本，导致损伤并随后优先消除损伤的基因组。这种方法是用γ照射的花粉授粉后产生单雌生殖洋葱植物中的手段。见Dore&Marie，Plant Breeding 111142-147(1993)。
为了对任何给定的植物实施本发明，可找到野生的或远亲植物来产生遗传不稳定的杂交子，其特征是迅速的基因组分离。下文总结了与经济学重要作物有关的熟知组合。
在所关注的双子叶作物中，对于马铃薯研究的最深入的是商业品种的马铃薯(Solanum tuberosum)、和野生种Solanum phureja之间的杂交，导致高频率的单倍体产物，因为在杂交种胚中phureja染色体早消失-Hougas等，Crop.Sci.4593-595(1964)；Clulow等，Theo.Appl.Genet.82545-551(1991)。关于Canola/油菜，Li，Z.，等，Theo.Appl.Gent.91131-136(1995)；Li，等，Herediatas12569-75(1996)；Li等，Theo.Appl.Genet.96251-265(1998)；Wu，J.，等，PlantBreeding 116251-257(1997)描述了欧洲油菜(Brassica napus)和诸葛菜(Orychophragmus violaceous)之间的杂交子中亲本基因组的体细胞分离。杂交子是形态学上的中间体，但是自身不育的，在自花受粉后主要产生欧洲油菜子代。诸葛菜法还可用于芥菜(Brassica juncea)和(Brassica carinata)另两种经济上重要的芥属物种。还用于其他经济的十字花科如甘蓝(B.oleracea)、油菜(B.campestris)、萝卜(Raphanus sativus)。关于大豆，Shoemaker等，Theo.appl.Genet.8017-23(1990)中记载了大豆和短绒野大豆之间的杂交子代中，野生物种基因组的消除。偏母植物的其他例子可从野草莓(Fragaria vesca)和(Fragariachiloens)或(F.virginiana)之间的杂交获得(Ichijima，Genetics，11590-604(1926))，从(Nicotiana digluta)和烟草之间的杂交获得了偏父植株(Clausen和Lammerts，Amer.Nat.63279-322(1929))。
在所关注的单子叶作物中，Galinat，Ann.Rev.Genet.，5447-478(1971)和Galinat，Evolution，27644-655(1973)证明了在二倍体玉米和二倍体鸭茅状摩擦禾(Tripsacum dactyloidees)之间的杂交中，F1杂交子具有预期的双-单倍体染色体数。然而三囊草染色体在减数分裂中可能不配对，而且由于三囊草染色体在有丝分裂和减数分裂中倾向丧失，一旦BC1即可回收二倍体玉米。在全世界的许多育种实验室中常规的重复产生这些结果。当小麦或大麦与野生物种鳞茎大麦杂交时，由于受精和随后鳞茎大麦基因组消除的结果，获得了高频率的单倍体(Kasha和Kao，Nature 225874-876(1970)；Barclay，Nature 256410-411(1975))。该方法广泛用于这两种作物的许多品种的单倍体产生。鳞茎大麦法已被远缘杂交所取代，其中小麦(普通小麦(Triticum estivum)和圆柱小麦(T.turgidum))、黑小麦或大麦植株用玉米、高粱、珍珠粟或三囊草的花粉授粉。得到的杂交子是高度不稳定的，而且通常产生仅保留母本基因组的植株。该单倍体法用于数十种小麦品种，并基本上不依赖于品种。Laurie和Bennett，Theor.Appl.Genet.76393-397(1988)；Ohkawa等，Jap.J.Breed.42891-894(1992)；Ushiyama等，Jap.J.Breed.41353-357(1991)；Furusho等，Jap.Breed.41175-179(1991)；Laurie，Genome，321063-1067(1989)。相同方法也可用于燕麦的单倍体产生。见Rines和Dahleen，Crop.Sci.，30，1073(1990)。优先基因组分离也在种间稻(Oryza)组合(如稻(O.sativa)和小粒稻(O.minuta))的子代中发生。见Mariam等，Theo.Appl.Genet.93664-671(1996)。
总的说，文献提供了许多熟知的杂交组合的例子，这些组合当用于本发明时，能产生临时的杂交状态，使得在该过程中可交换异源遗传物质。另外，可用许多野生物种作为转基因供体，迅速和无连锁拖曳的将转基因转移到多种重要作物的物种中。野生物种包括三囊草(如对于玉米、小麦、大麦和燕麦)；小粒稻(如对于稻)、诸葛菜(如对于芸苔和其他经济上重要的十字花科植物)；(Solanumphureja)(如对于马铃薯)和短绒野大豆(如对于大豆)。出于相同目的也可使用突变株，如棉花的半配子突变株或在大豆中导致多胚性的ms突变。对于其他重要作物，包括甜菜、豌豆和西红柿也不难鉴定出类似的物种组合或突变株。用含有遗传信息的外源或异源构建物转化供体物种，该遗传指令必然指导所述转基因的切割及通过同源或非同源重组机制重整合到另一染色体上，以及感兴趣的DNA中。为了有助于成功转化子的选择，该构建物还含有编码选择性标记(如监测的性状，例如抗生素或除草剂抗性或表型标记，尤其是β-葡糖醛酸酶和/或绿色荧光蛋白质)的DNA。感兴趣的DNA可含有一个或多个编码不同蛋白质的基因。受体植株子代的基因表达可导致对真菌、病毒和/或细菌性疾病、害虫、杀虫剂或环境压力更强的抗性，或可导致改善的味道、储藏或营养性质。受体生物可以是未转化的植株或转化成在其基因组中含有特定位点的植株，该特定位点是与供体基因组中外源DNA插入物同源重组交换必须的。
在优选例中，异源DNA从供体移动到受体，通过基于以下的系统(1)转座子-介导的非同源性转基因转移或(2)利用同源重组机制的靶向转移。转座子是可移动遗传元件，它可含有一种植物基因组的基本部分，并产生巨大的表型多样性。转座元件是可移动的DNA片段，能切下并重新插入染色体上的另一个位置。植物转座子是最先描述的可移动DNA元件之一，已克隆了许多植物转座元件，如Ac/DS、Mu和En/Spm，优选用于本发明。这些转座元件目前用作植物分子生物学和生物技术的遗传工具。它们是植物发育研究、植物基因组分析和通过所谓的插入诱变和标记进行植物基因分离的无价工具。见例如，Walbot，Ann.Rev.Plant Mol.Biol.4349-82(1992)。Fedoroff，美国专利号4,732,856；Doonerk等，PCT申请WO91/156074；等，Yoder和Lassner，PCT申请WO92/01370，和Ebinuma等，PCT申请WO96/15252中描述了用于本发明的转座元件的其他例子。
对于本发明的目的，转座子切割和转基因的重新插入是一个系统，该系统使杂交过程中转基因移动与固有的植株基因移动相分离，同时提供额外重要优点，即完全指令指导转基因切割和重新插入一个基因构建物中，并通过一个转化步骤。因此，该系统不需要受体生物中着陆位点的基因工程改造。
在另一个优选例中，用重组酶和重组位点组合将异源DNA整合到受体基因组的特异性位点。噬菌体和酵母的位点专一性重组酶广泛用作在试管和活生物体内操纵DNA的工具。用于本发明的优选重组酶/重组位点组合是Cre-Lox、FLR-FRT和R-RS，其中Cre、FLP和R是重组酶，Lox、FRT和RS是重组位点。其他合适的系统包括可使用内含子编码的酵母内切核酸酶I-SceI。见Choulika等，Mol.Cell.Biol.151968-1973(1995)为了在植物中具有功能，这些位点需要7-8个碱基对(bp)的核心序列，位于12-13bp的反向重复之间；不对称的核心位点确定3位点的取向，从而确定了重组产物的类型。不论将重组位点以正向或反向置于一DNA分子上或内，或置于非连锁的线性或环状DNA分子上，对应的重组酶可催化相互交换，产生缺失、倒置、转位或共整合。见Bollag等，Ann.Rev.Genet.23199-225(1989)；Kilby等，Trnds Genet.9413-421(1993)；和Ow，curr.OpinionBiotech.7181-186(1996)。在本发明中，重组酶介导的位点专一性转位发生在不同的，特别是非同源染色体之间。该内-反式(in-trans)重组酶的作用主要是为了影响杂交子中属于不同亲本的两条染色体之间转基因的转移。见Dale和Ow，Gene9179-85(1990)；Odell等，Mol.Gen.Genet.223369-378(1990)；Dale和Ow，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8810558-10562(1991)；Russell等，Mol.Gen.Genet.23449-59(1992)；Lyznik等，Plant J.8177-186(1995)；Albert等，PlantJ.7649-659(1995)；van Deuersen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 927376-7380(1995)。
在文献中描述了本发明中所用的合适的同源重组系统的例子，包括Cre-lox系统(Sauer，，美国专利4,959,317，Odell等，美国专利5,658,772；Odell等，PCT WO91/09957)和FLP-FRT系统(Hodge和Lyzinik，美国专利5,527,695)。植物中转基因处理的已知重组系统的一个特定用途涉及从植物基因组上切割转基因，一种用于消除商业品种不需要的异源遗传物质如抗生素选择标记的方法(Ow和Dale，PCT WO93/01283)。然而这些系统针对完全不同的应用领域，即用于同源重组以消除异源DNA不需要的部分，而不是管理转基因和固有植物基因流动的分离。Hooykaas和Mozo，美国专利5,635,381和Offringa等，美国专利5,501,967描述了另一种用途，针对用同源重组系统，通过土壤杆菌介导的转化，实现DNA定点靶向整合入植物基因组。这些例子也限于细菌和植物细胞之间的靶向转移，而不是两种植物生物体之间。
基于同源重组的转基因改组(shuffling)具有明显和强大的优点。通过着重于同源性的DNA位点采用精确的靶向，可建立转基因“着陆位点”，它是精心选择并预先确定特征的。结果，实现了转基因行为，包括可继承性、表达水平，无沉默等的更高水平的可预测性和可复制性。还可将转基因盒的新版本安置到相同位点，用新的替换转基因的旧版本。随后培育具有预选和确定并作图的整合位点的材料更容易而且更直接。本领域技术人员应理解仅当所有受体“预先布线”而含有整合位点，才能使用该系统。用其他转移机制，如转座子介导的转移或回交的经典渐渗法可实现这样的基因渗入。在更具体的情况下，除了重组位点，还可将重组酶基因引入受体物种。在这些情况下，重组酶基因将在人工转录因子-介导的启动子控制下，而转录因子由供体(剪贴板)植物中的基因组成型表达。重组酶仅在不稳定杂交子的两个基因组共存时产生。另外，重组酶可位于剪贴板植株中，但转录因子可在受体植物中组成型表达。
可将异源DNA用标准技术引入供体植物。双子叶植物的转化技术是本领域中熟知的，包括基于土壤杆菌的技术和不需要土壤杆菌的技术。非土壤杆菌技术涉及原生质体或细胞直接摄取外源遗传物质。这些技术包括PEG或电穿孔介导的摄取，颗粒轰击-介导的传递和显微注射。Paszkowski等，EMBO J 32717-2722(1984)，Potrykis等Mol.Gen.Genet.199169-177(1985)，Reich等，Biotechnology 41001-1004(1986)和Klein等，Nature 32770-73(1987)描述了这些技术的例子。在每种情况下，用标准技术将转化的细胞再生成整株植物。
土壤杆菌介导的转化是双子叶植物转化的优选技术，因为其转化效率高及其在许多不同物种中的广泛应用。常规可用土壤杆菌转化的许多作物物种包括烟草、西红柿、向日葵、棉花、油菜(oilseed rape)、马铃薯、大豆、苜蓿和杨(EP 0 317511(棉花)；EP 0 249 432(西红柿)、WO 87/07299(芥菜)、美国专利4,795,855(杨))。土壤杆菌转化通常涉及转移携带感兴趣的外源DNA的二元载体(如pCIB200或pCIB2001)到合适的土壤杆菌菌株，该转化可能依赖于宿主土壤杆菌菌株携带的、在共存质粒或染色体上的vir基因的互补(如菌株CIB542对于pCIB200)(Uknes等，Plant Cell 5159-169(1993))。重组二元载体转移到土壤杆菌是通过用携带重组二元载体的大肠杆菌(一种辅助大肠杆菌菌株，携带pRK2013等质粒，能将重组二元载体移动到靶土壤杆菌菌株)三亲本交配法实现的。另外，通过DNA转化将该重组二元载体转移到土壤杆菌中(Hfgen&Willmitzer，Nucl.Acids.Res.16，9877(1988))。
用重组土壤杆菌转化靶植物常涉及共同培养土壤杆菌和植物的外植体，并按照本领域已知的方案。转化组织在可选择培养基上再生，其携带了存在于二元质粒T-DNA边界之间的抗生素或除草剂抗性标记。
单子叶植物的优选转化技术包括用PEG或电穿孔技术直接将基因转移入原生质体和颗粒轰击入愈伤组织。可用一单DNA物种或多个DNA物种(如共转化)进行转化，两种技术都适用于本发明。共转化可具有避免复杂载体构建和产生对感兴趣的基因和选择标记具有不连锁基因座的转基因植物的优点，使得选择标记在后代中被除去(如果认为这是需要的)。然而，采用共转染的缺点是分开的DNA整合入基因组的频率小于100％(Schocher等，Biotechnology 41093-1096(1986))。
出版的专利申请EP 0 292 435，EP 0 392 225和WO93/07278描述了制备玉米愈伤组织和原生质体的技术，用PEG或电穿孔转化原生质体，和从转化原生质体再生玉米植株的技术。Gordeon-Kamm等。Plant Cell 2603-618(1990)和Fromm等，Biotechnology 11194-200(1993)，描述了用颗粒轰击转化杰出的近交纯系玉米的技术。
稻转化还可通过直接基因转移技术，利用原生质体或颗粒轰击进行。已描述了日本型和印度型水稻的原生质体介导的转化(Zhange等，Plant Cell Rep.7739-384(1988)；Shimamoto等，Nature 338274-277(1989)；Datta等，Biotechnology 8736-740(1990))。两种类型都可用颗粒轰击常规转化(Christou等，Biotechnology 9957-962(1991))。
专利申请EP 0 332 581描述了产生、转化和再生Pooideae原生质体的技术。在Vasil等，Biotechnology 10667-674(1992)中还描述了用颗粒轰击入C型长期可再生愈伤组织的转化小麦。Vasil等，Biotechnology 111553-1558(1993)和Weeks等，Plant Physiol.1021077-1084(1993)描述了颗粒轰击未成熟种胚和未成熟种胚衍生的愈伤组织。
使单子叶细胞与多个针状体接触，在针状体上这些细胞可被穿刺，在细胞壁上形成裂缝，从而使转化DNA进入细胞，实现单子叶细胞如玉蜀黍(Zea mays)的转化。见美国专利5,302,523。还在下列美国专利中公开了可用于单子叶和双子叶的转化技术5,240,855(颗粒枪)；5,204,253(冷气冲击加速的微粒)；5,179,022(生物弹射装置)；4,743,548和5,114,854(显微注射)；和5,149,655、5,120,657(加速颗粒介导的转化)；5,066,587(气体驱动的微粒加速器)；5,015,580(大豆植株的颗粒-介导的转化)；5,013,660(激光束-介导的转化)；4,849,355和4,663,292。
然后使这样转化的植物细胞或植物组织根据标准技术长成完整植株。可按照标准技术从转基因开花植物获得转基因种子。类似的，可用各种已知方法繁殖不开花植物如马铃薯和甜菜。见例如Newell等，Plant Cell Rep.1030-34(1991)(公开了茎培养的马铃薯转化)。
在本发明的另一个实施例中，通过融合体细胞或原生质体将异源核酸从供体转移到受体植物的基因组。该实施例的一个优点是绕过了一些限制有性杂交的杂交屏障。然而该技术比有性杂交更复杂，而且仅能用于可从原生质体再生的物种之间的杂交。因此优选采用无关的供体和受体植物。这些配对的例子包括拟南芥(Arabidopsis)/棉花、拟南芥/大豆、拟南芥/稻和烟草/大豆。另一方面，虽然用原生质体杂交建立了远缘物种(属间、族间和科间)之间的杂交，但两种种系遥远的基因组在杂交细胞中合作能力有限，杂交细胞常常是不稳定的，并且很快丧失了亲本物种之一的遗传物质。见Gleba&Sytnik，Monogr.Theor.Appl.Genet.81-220(1984)，Dudits等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 848434-8438(1987)，和Babiychuck等，Mol.Gen.Genet.8487-91(1992)。因此，远缘供体和受体植物配对是更优选的。
下文描述的实施例是在使用特定物种杂交组合和转座子或同源重组转基因切割/重插入的基础上，成功转化和品系转变4种重要作物物种(芸苔、马铃薯、玉米和小麦)的总结。提供这些例子仅用于说明本发明的具体实施例，而不意味着对本发明权利要求中未列出的提供限制。
实施例实施例1芥菜作物的转化/品系转变设计构建物如下制备了在T-DNA边界内含有玉蜀黍转座因子Spm成分的二元载体。
用Xho1和Sma1消化履粒pIC012，凝胶纯化大片段，与Xho1和Cla1/Klenow处理产生的RS片段连接。得到的质粒pIC013含有pUC118中的pNOS-RS-3’OCS，用Pst1和Bcl1消化，并与用相同酶消化的pIC017大片段连接。然后用HindIII/Klenow处理含有dSpm元件和pNOS-RS-3’OCS的质粒pIC23，以除去HindIII和BamH1位点。将pIC23(-BamH1；-HindIII)的大Cla1片段克隆入pIC201的Cla1位点，得到侧接p35S和GUS-3’NOS(pIC132)的dSpm元件。用EcoR1和HindIII消化质粒pIC132。凝胶纯化大片段，并克隆入基于pRK290的二元载体的EcoR1和HindIII位点，并携带作为植物转化标记的NPTII基因。用Ecl136II和HindIII消化得到的质粒pIC141，与0.3kb pIC022的Xho1-BamH1片段和pIC023的7.7kb的Xho1-Sma1片段连接，以将在35S启动子控制下的Spm转座酶引入该二元载体。获得质粒pIC156并用于转化实验。用相似方法制备质粒pIC216，但用pIC61的0.2kbXho1-BglII片段(pSpm)替换pIC022的Xho1-BamH1片段。
另4种载体的克隆步骤和上述的不同仅在于用pNOS-BAR-OCS3’或pNOS-BAR-OCS3’装配dSpm元件的阶段，其中BAR侧接两个RS位点。用Pst1、Bcl1消化质粒pIC132，凝胶纯化并与pIC016的1.5kbPst1、Bcl1片段连接，得到具有pNOSBAR-OCS3’的dSpm元件。
为了构建pIC401和pIC411，将pIC01的大Xho1-Nco1片段与pIC018的BspH1-BamH1片段的小片段连接，两个RS片段分别侧接Nco1-BspH1和Bgl11-Xho1位点。得到的质粒pIC138含有BAR基因侧面为两个RS位点。重新将pIC36的小Xho1片段克隆入pIC334的Xho1位点，得到具有pNOSRS-BAR-RS-OCS3’的质粒pIC342。如上所述将最后的盒重新克隆入dSpm元件。
总的说，获得的构建物含有转化标记(对卡那霉素抗性的NPTII基因)、在35S或其自身启动子控制下的Spm转座酶来源、插入在p35SGUS切割标记中的非自主dSpm元件。制备了三种不同版本的dSpm元件a)dSpm含有被OCS基因转录终止子的RS位点(Z.rouxii的R重组酶识别的重组位点)分开的NOS启动子。(见pIC156和pIC216，
图1和2)。
b)dSpm含有pNOSBAR-OCS3’。(pIC312、pIC31A2，图3和4)。
c)dSpm含有pNOSBAR-OCS3’，但BAR基因旁侧是两个单向RS位点(pIC401、pIC411，图5和6)。
用植物内转化法在拟南芥中测试了构建物。在用X-gluc染色植物组织后，可用GUS+区段的存在在原代转化物中轻易监测dSpm切割。全部构建物在拟南芥中显示高转位活性，用于获得几种诸葛菜转化物并确定其特征。
用诸葛菜进行品系转变消毒诸葛菜的种子并体外发芽。按芥菜物种所述进行了该物种体外生长植株的转化(De Block等，Plant Physiol.，91，694-701(1989))。所用的构建物是基于拟南芥的、携带Spm转座酶和不同版本的插入在35S CaMV启动子和GUS基因之间的非自主dSpm元件(见
图1)。用这些质粒产生转化的诸葛菜植株。产生了几种转基因植株并确定特征。将两种含有单拷贝插入物的独立转化株作为雄性亲本与不同芥菜物种((B.nigra)、芥菜(B.juncea)、欧洲油菜(B.napus)、(B.carinata))，以及白芥(Sinapis alba)如前所述杂交。总计进行了约600次杂交。将得到的杂交子自交，并选出存在dSpm元件的F1子代(PCR分析或磷化麦黄酮抗性)。进一步筛选纯芥菜表型和不存在GUS活性的那些存活的植株，然后测试是否不存在转座酶序列，或物种专一性的诸葛菜重复。最后，通过分析F2子代建立了具有芥菜染色体特异性RFLP模式的dSpm共同分离。
用拟南芥品系转变在下列实施例中，如上所述进行了全部实验，除了用诸葛菜和拟南芥植株作为雄性亲本。拟南芥易于转化，生命周期短。这些特征使拟南芥成为剪贴板物种的优良候选。
实施例II欧洲油菜的转化/品系转变消毒欧洲油菜变种和诸葛菜的种子，体外发芽。如De Block等，Plant.Physiol.91694-701(1989)中所述进行了转化。用基于土壤杆菌的载体pII2(含有R重组酶基因和无启动子的潮霉素抗性基因，旁侧有两个rsx重组位点)转化诸葛菜种子。用含有35S CaMV启动子和RS重组位点的载体pII3转化油菜种子，从而正确的重组将建立赋予潮霉素抗性的活性HPT基因。根据分子分析转基因选出了各物种两个独立转化的植株。如实施例II进行了子代的杂交和分析。
实施例III马铃薯的转化/品系转变如上(实施例I)进行了实验，除了用转基因Solanum phureja作为花粉伴侣。如Hermsen等，Euphytica 22244-259(1973)中所述进行了杂交，选出原代转换的品系作为F0二倍化的双单倍体。
实施例IV玉米的转化/品系转变在该实验中用鸭茅状摩擦禾品系作为转基因供体。所用的构建物基于土壤杆菌，如
图1中所示，携带Spm转座酶和非自主性dSpm元件，插入在35S CaMV启动子和GUS基因之间，dSpm含有一个RS重组位点或一个选择标记(BAR)，具有(pIC401、pIC411)或不具有(pIC312、pIC31A2)RS位点。亲本材料的转化基本如Hiei等，Plant.Mol.Biol.35205-218(1997)中所述进行。将转基因植物与玉米变种杂交，得到的子代自交。从显示磷化麦黄酮抗性或dSpm-专一性PCR信号的BC1中筛选出纯玉米型分离株。进一步筛选纯玉米表型和不存在GUS活性的那些存活的植株，最后，测试是否不存在转座酶序列或物种专一性的三囊草重复序列。最后，通过分析BC/F2子代，建立了磷化麦黄酮抗性或dSpm-专一性PCR信号与玉米染色体专一性RFLP模型的共同分离。
实施例V小麦的转化/品系转变如先前实施例(实施例IV)中进行了实验，除了如Riera-Lizararu&Mujeeb-Kazi，Crop Sci.33973-976(1993)所述进行杂交外。选出原代转变品系作为杂交出现的F0二倍体化的单倍体。
工业应用性本发明用于产生基因工程改造的植物，它们显示广泛的性能，可能包括对病毒、真菌、细菌性疾病、害虫、杀虫剂或环境压力的增强抗性，和增强其他商业上理想的性能，如改善的味道、储藏或营养性能。
本说明书中提到的所有出版物说明了本发明涉及的领域的技术人员的水平。所有这些出版物在此引入以供参考，程度都相当于各出版物专门和单独指明那样引入以供参考。
本文所述的本发明的各种修改本领域技术人员是明白的。这些修改都将在所附权利要求的范围内。
权利要求
1.一种将遗传物质引入植物的方法，其特征在于，该方法包括制备用具有5′和3′可切割旁侧序列的异源核酸转化的第一种植物，该旁侧序列使所述异源核酸从一个基因组移到另一个基因组；使用第二种植物与转化的第一种植物杂交，其中所述第一和第二种植物在杂交后产生不稳定的子代或显示优先分离或分拣；和选出含有所述异源核酸的所述第二种植物的子代。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述5’和3’可切割旁侧序列含有转座元件，其中所述第一种植物、所述第二种植物或所述第一种和第二种植物两者能产生对所述转座元件专一性的转座酶。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述5’和3’可切割旁侧序列是重组位点，和所述第一种植物、所述第二种植物、或所述第一种和第二种植物两者能产生对所述重组位点专一性的重组酶。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一种植物是三囊草，所述第二种植物是玉米。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一种植物是三囊草，所述第二种植物是小麦。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一种植物是三囊草，所述第二种植物是大麦。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一种植物是三囊草，所述第二种植物是燕麦。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一种植物是诸葛菜，所述第二种植物是十字花科植物。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一种植物是拟南芥，所述第二种植物是十字花科植物。
10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述十字花科植物是芸苔。
11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一种植物是短绒野大豆，所述第二种植物是大豆。
12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一种植物是Solanumphreja，所述第二种植物是马铃薯。
13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一种植物是玉米，所述第二种植物是小麦。
14.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一种植物是玉米，所述第二种植物是大麦。
15.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一种植物是玉米，所述第二种植物是燕麦。
16.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一种植物是狼尾草，所述第二种植物是小麦。
17.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一种植物是狼尾草，所述第二种植物是大麦。
18.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一种植物是鳞茎大麦，所述第二种植物是大麦。
19.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一种植物是鳞茎大麦，所述第二种植物是小麦。
20.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一种植物是小粒稻，所述第二种植物是稻。
21.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一种植物是Nicotianadigluta，所述第二种植物是烟草。
22.如权利要求1所述的方法，其特征在于，第一种和第二种植物之一或两者是携带Se半配子突变的棉花。
23.如权利要求1所述的方法，其特征在于，第一种和第二种植物之一或两者是携带导致多胚的ms突变的大豆。
24.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一种植物是拟南芥。
25.一种将遗传物质引入植物的方法，其特征在于，该方法包括(a)制备用具有5’和3’可切割旁侧序列的异源核酸转化的第一种植物的细胞或原生质体，该旁侧序列使所述异源核酸从一个基因组移到另一个基因组；(b)将所述细胞或原生质体与第二种植物的细胞或原生质体融合，产生融合的细胞或融合的原生质体，其中所述第一种和第二种植物在杂交后产生不稳定的子代或显示分离优势或分拣；(c)从融合细胞或融合原生质体再生整株植物；和(d)选出(c)中所述再生植物的含有所述异源核酸的子代。
26.如权利要求25所述的方法，其特征在于，所述5’和3’可切割旁侧序列含有重组位点。
27.如权利要求25所述的方法，其特征在于，所述融合在含有对所述重组位点专一性的重组酶的培养基中进行。
28.如权利要求25所述的方法，其特征在于，所述第一种植物物种、所述第二种植物物种、或所述第一和第二种植物物种两者能产生对所述重组位点专一性的重组酶。
29.如权利要求25所述的方法，其特征在于，所述5’和3’可切割旁侧序列含有转座元件，其中所述第一种植物、所述第二种植物、或所述第一种和第二种植物两者能产生对所述转座元件专一性的转座酶。
30.如权利要求25所述的方法，其特征在于，所述第一种植物是拟南芥，所述第二种植物是棉花。
31.如权利要求25所述的方法，其特征在于，所述第一种植物是拟南芥，所述第二种植物是大豆。
32.如权利要求25所述的方法，其特征在于，所述第一种植物是拟南芥，所述第二种植物是稻。
33.一种用权利要求1或权利要求24所述的方法制备的、含有异源核酸的完整植物。
34.权利要求33所述的完整植物的种子或种子部分。
35.权利要求33所述的植物的子代。
36.权利要求25(b)所述的方法产生的融合细胞或融合原生质体。
全文摘要
公开了一种产生转基因植物的方法。首先将异源DNA引入供体植物、植物细胞或将原生质体引入植物细胞或原生质体,然后从供体移入到不带任何供体天然基因组DNA的受体植物、植物细胞或原生质体中。选择产生不稳定子代或显示优先分离或分拣的供体或受体。可将DNA随机插入或在特异性位点插入受体植物的基因组。还公开了用该方法产生的植物和植物子代、植物部分和种子以及植物的种子部分。
文档编号C12N15/12GK1373634SQ00807611
公开日2002年10月9日 申请日期2000年5月17日 优先权日1999年5月17日
发明者N·V·屈奇克, V·克利米克 申请人:依康遗传学股份有限公司