专利名称：一种基于转座子的新型遗传标记的制作方法
背景技术：
(a) 发明领域本发明涉及一种对核酸序列进行基因分型的方法，该方法使用一对引物进行扩增，其中第一引物具有与微型反向重复可转座元件(miniatureinverted-repeat transposable element，MITE)同源的DNA序列，第二引物与第一引物相同或不同。本发明总体上涉及将MITE引物用于指纹分析或连锁研究。
(b) 现有技术在McClintock(McClintock B.1946.玉米遗传学.Camegie Inst. Wash.年报45176-186；和McClintock B. 1947.玉米和链孢霉属的细胞遗传研究.Camegie Inst. Wash.年报46146-152.)发现可转座元件Ac/Ds系统后，对新的可转座元件系统(家族)的遗传鉴定成为植物(Peterson P. A. 1986.玉米中的可移动元件.Plant Breeding Reviews 43-122.)及其它生物遗传学研究中的热点领域。随后是对可转座元件的分子鉴定及开发利用这些元件作为基因鉴定和分离的工具，尤其是在用果蝇中的copia逆转录转座子克隆出white位点(Bingham P. M.，R. Lewis and G.M. Rubin 1981.用一种新的通用方法克隆，黄猩猩果蝇white位点的DNA序列。Cell 25693-704.)，以及对玉米转座元件Ac(Pohlman R.F.，N.V. Fedoroff and J.Messing 1984.玉米控制元件激活剂(Activator)的核苷酸序列。Cell 37635-643.)和En/Spm(Pereira A.，Zs.Schwarz-Sommer，A.Gierl，I.Bertram，P.A. Peterson and H. Saedler 1985，玉米(Zea mays)中增强子(En)转座元件系统的遗传学及分子分析。EMBO J.417-25.)的分子鉴定之后。从此以后，转座元件相关的研究成为生物科学的一个聚焦点。
同生物研究的其它领域一样，现代计算机技术加速了对可转座元件的鉴定。Bureau等(Bureau T.E.，P. C.Ronald，and S.R. Wessler 1996.一种基于计算机的系统调查显示在野生型水稻基因中存在大量小分子反向重复元件。Proc. Natl. Acad. Sci.938524-8529.)采用该方法鉴定出一种新转座元件家族的大量成员。这些元件同传统DNA介导型转座元件因都具有末端反向重复(TIR)而相似(与通过RNA中间体介导转座的逆转录因子相反，Boeke J.D.，D.J.Garfinkel，C.A.Styles and G.R.Fink 1985.RNA中间体介导的Ty元件转座。Cell 40491-500.)。但是同经典遗传学方法鉴定出的转座元件不同的是，这些元件比较小，没有明显的编码蛋白的能力。这些元件被称为微型反向重复可转座元件或MITE(Bureau等同上)。
自从限制性片段长度多态性(RFLP)技术(Bostein D.，R. White，M.Skolnick and R. W. Davis 1980.用限制性片段长度多态性构建人的遗传连锁图谱。Am. J. Hum. Genet.32314-331.)用作分子作图的工具以来，基因组作图和指纹技术有了很大进展，表现为其它新技术如随机扩增的DNA多态性(RAPD，Welsh J. And M.McClelland 1990.用随机引物PCR对基因组的指纹分析。Nucleic Acids Res.187213-7218.；Williams J.G.K.，A.R.Kubelik，K.J.Livak，J.A.Rafalski and S.V.Tingey 1990.用随机引物扩增的DNA多态性是有效遗传标记。Nucleic Acids Res.186531-6535.)和扩增的片段长度多态性(AFLP，Vos P.，R. Hogers，M. Bleeker，M. Reijans，T.Van de Lee，M.Hornes，A.Frijters，J.Pot，J.Peleman，M.Kuiper and M.Zabeau 1995.AFLP一种新的DNA指纹分析技术。Nucleic Acids Res.234407-4414.)的发展。最近，利用逆转录元件(Sinnet D.，J.M.Deragon，L.R.Simard and D.Labuda1990.Alumorphs-用Alu特异性引物进行聚合酶链反应来检测人DNA多态性。Genomics 7331-334；and Nelson D.L.，S.A.Ledbetter，L.Corbo，M.F.Victoria，R.Ramirez-Solis，T.D.Webster，D.H.Ledbetter and C.T.Caskey 1989.Alu聚合酶链反应一种从复合DNA源中快速分离人特异性DNA序列的方法。Proc. Natl. Acad. Sci. 866686-6690.)和简单序列重复(SSR)(Litt M.And J. A. Luty 1989，通过对心肌肌动蛋白基因中二核苷酸重复的体外扩增所揭示的高变微卫星。Am.J. Hum. Genet. 44397-401；Tautz D.1989.简单序列的高变性可作为多态性DNA标记的通常来源。Nucleic Acids Res. 176463-6471；and Weber J.L.And P.E.May 1989.可用聚合酶链反应分型的大量类型的人DNA多态性。Am.J.Hum.Genet.44388-396.)的技术为产生新一代基因组作图和指纹分析工具提供了条件。
限制性片段长度多态性(RFLP)标记方法包括用限制酶消化基因组DNA、通过电泳分离DNA片段、将分离的DNA片段转移至由尼龙膜组成的固相支持物，从而在该支持物上获得凝胶的影印版，用于与已知DNA序列杂交。已知的DNA序列可以是克隆的基因组序列或cDNA序列，或特异性PCR产物。该DNA序列(探针序列)用具有放射性、荧光性或可着色的核苷酸进行标记。杂交结果可通过将固相支持物在X射线敏感胶片上曝光来观察，或者当用着色的核苷酸进行标记时，可直接在固相支持物上观察。依赖于探针序列的来源，常可观察到一个或几个DNA条带。限制性片段长度多态性可显示为不同基因型之间的带型差异，其反映给定限制性酶切位点的分布差异。
随机扩增多态DNA(RAPD)标记方法包括将含有10个核苷酸的短DNA序列用作引物，来启动以基因组DNA为模板的PCR扩增。寡核苷酸引物的核苷酸组成随机选定，不需要参考任何现存DNA序列。PCR产物可直接在琼脂糖凝胶电泳上观察。一般的，真核基因组可观察到1-15个扩增的DNA条带作为扩增产物。多态性可通过将琼脂糖凝胶染色后直接检测，其为不同基因型的扩增模式的差异，多态性可反映引物中单个核苷酸的变化或插入/缺失。
扩增片段长度多态性(AFLP)标记方法包括用限制酶消化基因组DNA，将得到的基因组DNA片段与接头序列(一种短的双链DNA序列，其一端含有与消化基因组DNA所用限制酶所致相同的酶切位点)连接，用与该接头序列同源的寡核苷酸序列作引物进行PCR扩增。扩增的结果可在染色后的丙烯酰胺凝胶上直接观察，其为数条(不超过60条)DNA片段。不同基因型的多态性可表现为有无特异性扩增条带，同RFLP相似，反映的是给定限制性酶切位点与在另一组基因组DNA中的分布差异。
简单序列重复(SSR)标记方法包括用一简单DNA序列重复(如(TA)n，(CAGA)n，(GA)n等，“n”一般为5-18)作为探针来鉴定某一生物基因文库中携带有这些简单序列单元的基因克隆。然后对分离的克隆测序，设计位于SSR两端的一对引物序列，用于扩增SSR和其两端的DNA序列。不同基因型的多态性表现为具有一或几个核苷酸差异的一或几个扩增的DNA条带，反映的是简单序列中重复数目(“n”)的差异。
基于逆转录元件和其它长重复元件的DNA标记包括设计位于所述元件两端的引物，不同基因型中有或无该元件可视为多态性。
还存在其它类型的DNA标记，但它们是上述DNA标记类型的组合。例如，CAP为酶切扩增多态性DNA，其中PCR产物在扩增后要进行酶切消化。其中的引物对可以根据重复元件和AFLP引物或不同重复元件的序列来设计。
亟需提供一种新的普遍性核酸序列用于连锁研究和指纹研究。
另外还亟需提供一种方法以便利用上述新型普遍性核酸序列来检测真核生物的多态性。
发明概述本发明的目标之一是提供一种新的普遍性核酸序列用于连锁研究和指纹研究。
本发明的另一目标是提供一种利用该新型普遍性核酸序列来检测真核生物的多态性的方法。
根据本发明，提供了一种用于检测目的核酸序列多态性的方法，该方法包括下述步骤(a)用一对引物扩增该目的核酸序列，其中第一引物与微型反向重复可转座元件(MITE)，或其片段或其衍生物同源，第一引物同目的核酸序列中的该MITE退火，第二引物可与第一引物一致或不同，并与MITE序列同源或不同源；(b)分离步骤(a)中扩增的目的核酸序列的片段；(c)分析步骤(b)中所获片段与对照片段的关系，对照片段是用至少一个可测定步骤(b)中获得片段同对照片段的差异的引物对核酸序列扩增得到的，该差异即表示目的核酸的多态性。
此外根据本发明，提供了一种用于对真核生物进行基因分型的方法，该方法包括下述步骤(a)用一对引物扩增该真核生物中的目的核酸序列，其中第一引物与MITE，或其片段或其衍生物同源，该引物可与所述真核生物的目的核酸序列中的该MITE退火，第二引物可与第一引物一致或不同，并可与MITE同源或不同源；(b)分离步骤(a)中扩增的目的核酸序列；
(c)比较步骤(b)中所获片段与该真核生物中对照核酸序列的片段，步骤(b)中所获片段与对照核酸序列的片段一致即表示该真核生物具有该核酸序列。
此外根据本发明，提供了一种用于对真核生物进行指纹分析的方法，该方法包括下述步骤(a)用一对引物扩增真核生物的核酸序列，其中第一引物与MITE，或其片段或其衍生物同源，且该引物特异于MITE序列，第二引物可与第一引物一致或不同，并可与MITE同源或不同源；(b)分离步骤(a)中扩增的核酸序列的片段，由此分离的片段即可代表该真核生物。
优选的扩增步骤通过PCR来实现。第一引物来自MITE元件的共有序列。更优选的，第一引物含有来源于Tourist、Stowaway、Barfly或Mariher的共有序列。
最优选的，第一引物含有选自下组的核酸序列SEQ ID NO1、SEQ IDNO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9、SEQ ID NO10、SEQ ID NO11、SEQ ID NO12、SEQ ID NO13、SEQ ID NO14、SEQ ID NO15、SEQ IDNO16、SEQ ID NO17、SEQ ID NO18、SEQ ID NO19、SEQ ID NO20、SEQ ID NO21、SEQ ID NO22、SEQ ID NO23、SEQ ID NO24、SEQ IDNO25、SEQ ID NO26、SEQ ID NO27、SEQ ID NO28、SEQ ID NO29、SEQ ID NO30、SEQ ID NO31、SEQ ID NO32、SEQ ID NO33、SEQ IDNO34、SEQ ID NO35。
可选择的，第二引物可选自下述引物MITE特异引物、基于SSR序列的引物、基于逆转录元件的序列的引物、基于检测RFLP所用克隆化核酸序列的引物、基于随机基因组序列的引物、基于载体序列的引物和基于基因序列的引物。
此外根据本发明，提供了多态性当与本发明下述方法联合时的用途，所述用途为追踪真核生物子代、测定真核生物的杂交、鉴定真核生物中连锁表型性状的变异、从杂交体中鉴定具有由亲代供体和/或亲代受体贡献的所需遗传性状的子代个体，或具有可作为构建遗传图谱的遗传标记的子代个体。
本发明的方法可用于分离基因编码区或非编码区附近的基因组DNA序列。基因编码区附近的基因组DNA序列优选为启动子或调控序列。
此外根据本发明，提供了一种核酸片段或其衍生物，该片段是通过用至少一个和MITE同源的引物作为针对核酸序列的探针，对真核生物的核酸序列扩增而来。
核酸片段或其衍生物可用于利用标记进行的筛选(MAS)、基于作图的克隆、杂合子鉴定、指纹分析、基因分型和等位基因特异性标记。
真核生物优选植物、动物或真菌。
本发明还提供基因组作图的方法，包括下述步骤(a)对真核生物的基因组进行分级分离；(b)将所分离的基因组克隆到一载体中；(c)用和微型反向重复可转座元件(MITE)同源的第一引物和第二引物扩增所克隆载体中的DNA，从而检测该载体，其中第一引物能与所述DNA中的微型反向重复可转座元件(MITE)杂交，第二引物可与第一引物一致或不同，并与MITE序列同源或不同源；(d)根据大小来分离扩增步骤中的延伸产物；(e)测定延伸产物的图谱；(f)从重叠图谱来重建基因组。
本发明还提供对多态性遗传标记作图的方法，包括(a)提供来自真核生物的生物样品中核酸序列的限制酶消化混合物；(b)用和微型反向重复可转座元件(MITE)或其片段或其衍生物同源的第一引物和第二引物扩增上述限制酶消化的核酸序列混合物，其中第一引物特异于MITE，第二引物和第一引物可以一致或不同，同MITE序列也可以同源或不同源；(c)鉴定混合物中一组差异扩增的核酸序列；(d)对所述差异扩增的核酸序列中的至少一个序列进行特异的遗传多态性作图，由此提供一个多态性标记。
本发明基于MITE的标记系统同以前报道的任何方法不同，具有更简便、能获得更多信息和重复性好的特点。
根据本发明的目的，对下述术语进行限定。
术语“MITE”指微型反向重复可转座元件。事实上，MITE是可转座元件超家族。这些元件长度小于3kb，含有完整或简并的末端反向重复，其侧翼为小于或等于10个碱基对的靶位点重复，在基因组中中度或大量分布。
MITE优选长度小于1kb，含有完整或简并的末端反向重复，其侧翼为TA或TAA靶位点重复，在基因组中中度或大量分布。
术语“基于MITE的引物”指含有MITE或其片段的引物，或衍生自MITE并能够识别MITE，与之杂交或退火的引物。
术语“基于MITE的遗传标记”(MGM)指可与MITE元件杂交的标记，或用至少一个MITE引物与另一引物扩增核酸序列得到的遗传标记，所述另一引物可选择为另一MITE引物、基于SSR序列的引物、逆转录元件序列、RFLP序列或基因序列。
术语“MITE间多态性”(IMP)涉及一组MGM，指用一个或两个不同MITE引物经PCR扩增核酸序列得到的标记。
术语“真核生物”指植物、动物和真菌。
术语“同源”指在同源核酸序列的环境中，一核酸序列在严谨条件下能够同与之互补的“同源”核酸序列杂交。
图例简述
图1说明了TEM-4/-10引物组合和单独TEM-10的PCR产物在琼脂糖凝胶上的结果；图2说明了本发明一个优选实施方案中，IRD700TM荧光染料标记的TEM-1引物所扩增PCR产物在6％丙烯酰胺凝胶上用LI-COR自动系统4200观察的结果，其中P1为亲本H.Vulgare，Lina(P1)，P2为亲本H.Spontaneum，Canada Park(P2)，而分离的个体来自于Lina和Canada Park DH(双单倍体)群的杂交。
图3说明了TEM-3/-10引物组合在1分15秒的长延伸条件下扩增得到的PCR产物在琼脂糖凝胶上的结果；图4A和4B说明了TEM-1/-4引物组合在60秒和75秒的延伸条件下扩增得到的不同PCR产物的琼脂糖凝胶结果；图5说明了H.Vulgare cv.Lina和H.Spontaneum Canada Park群杂交的连锁图，其中显示了用TEM-1和TEM-10引物检测的IMP位点分布；
图6说明了27个Hordeum品种在琼脂糖凝胶上的指纹图谱；图7说明了IRD700TM荧光染料标记的TEM-1引物对27个Hordeum品种进行指纹分析的一部分结果；图8说明了根据TEM-1和TEM-10的带型，用UPGMA对27个品种的遗传相似性矩阵进行聚类得到的树状图。
图9A、9B、9C和9D说明了基于MITE的标记在不同真核生物中的广泛应用，显示了用主引物TEM-12(图9A)、主引物TEM-1(图9B)、主引物TEM-10(图9C)和主引物TEM-11(图9D)对11个不同来源的DNA进行PCR扩增的图谱；
图10A、10B、10C、10D和10E说明了用主引物TEM-1和其相应锚定引物得到的结果的一个示例。
发明详述本发明提供一新的遗传标记，此处称为基于MITE的遗传标记(MGM)。在此新方法中，根据大量可转座元件MITE设计引物，使用PCR来显示多态性。通过对一个大麦双单倍体作图群的分离图谱以及对26个大麦(Hordeum Vulgare)品种和1个Hordeum Spontaneum品系的基因分型的研究，对这些基于可转座元件的引物的用途进行了测定。根据本发明，提供了一种新型DNA标记，此处称作基于MITE的遗传标记，以及这些标记的染色体定位、它们的通用性、多样性和指纹图谱结果。最后，我们讨论了本发明MGM和IMP方法的可行性和总结。
同现有技术相比的优势和改进如同上述，MITE成员经常同基因相连，因此不局限于重复序列区域。MITE的这种普遍性具有巨大的价值。它表明，事实上在大部分真核生物的基因组中任何区域都可以进行IMP扩增。
用每一个单一引物可以扩增出总共50-100个记分条带，表明MITE在基因组中存在很高的拷贝数。按每个引物50-100个位点算，利用几个引物即可以很容易对整个基因组进行筛选。
MITE引物可以和其它类型的引物结合使用，例如对SSR、逆转录元件、已测序的RFLP、随机的基因组序列、载体序列和基因特异的引物。这将增加本发明MGM方法的能力。
本发明的方法结合使用高分别率LI-COR自动荧光基因分型系统，在DNA作图和指纹技术中具有很好的效力。它同RAPD和RFLP相比，在能力和分辨率上的优势是显而易见的，因为它可以在单一反应中检测出更多的位点。MGM和IMP分析简便、快速、成本低。同RAPD分析相比，所需要的引物数量显著减少。同AFLP和RFLP不同的是，MGM和IMP不需要限制酶消化或接头连接。
技术描述i)植物材料所使用的作图群体包括88个双单倍体，来自于大麦品种Lina和H.Spontaneum品种Canada Park的杂交。该群体已用于构建主要基于RFLP标记的连锁图。
在指纹试验中总共使用27个品种(参照表1)，包括26个大麦品种和一个H.Spontaneum，Canada Park，同Lina一起用作产生作图群体的亲本。收集方法包括2排和6排两种类型。在2排类型中包括春季和冬季品种。总共使用的27个品种以前都已进行过RFLP基因分型研究，因此在这些品种之间，基于RFLP的遗传关系是已知的。
表1在指纹研究中使用的品种
ii)PCR检测系统利用两种检测系统来比较多态性鉴定的精度和效率。第一种系统为常规的琼脂糖检测系统。在该系统中，用常规(非标记)引物进行PCR。PCR产物在2％琼脂糖凝胶上观察，用或不用Nusieve琼脂糖(2/3Nusieve1/3常规琼脂糖)。第2种系统为LI-COR自动DNA测序/基因分型系统。用于该系统的引物用IRD700TM荧光染料(LI-COR，Inc.，Licoln，Nebraska)标记。PCR产物在6％丙烯酰胺变性凝胶上，使用41厘米的玻璃板装置观察。凝胶电泳使用LI-COR 4200系统。
iii)PCR在本研究中设计并评估了7种主(Master)引物(表2)和它们的3’锚定衍生物(表3)。6种主引物为MITE引物(TEM-1，TEM-2，TEM-3，TEM-10，TEM-11，TEM-12.)，TEM-4为几种Tyl/copia样逆转录转逆转录转座子的逆转录酶(RT)结构域的保守序列节段(Hirochika H.and r.Hirochika 1993.Tyl-copia样逆转录转座子在植物基因组中普遍存在。Jpn. J. Genet.6835-46.)。主引物为简并引物，因为在某些位置存在不止一个核苷酸的可能。锚定引物为，在主引物3’端外添加了核苷酸的引物(表3)。MITE引物根据每种MITE的末端反向重复(TIR)区域的共有序列设计而来。两个TIR都用于设计引物。TEM-4仅同别的引物结合使用。在琼脂糖凝胶检测系统和LI-COR自动检测系统都使用这些引物，不同的是后者的引物用荧光染料标记。
表2主引物来源和序列引物 转座子 宿主种类MITE TIR数序列TEM-1Stowaway Hordeum 44 (AG)TATTT(TA)GGAACGGAGGGAGvulgare (SEQ ID NO1)TEM-3Tourist Triticum.2TT(TG)CCCAAAAGAACTGGCCCaestivum (SEQ ID NO2)TEM-10 BarflyH.vulgare7TCCCCA(CT)T(AG)TGACCA(CGT)CC(SEQ ID NO3)TEM-4Tyl/copia§ Conserved RTNA GT(TC)TT(ACGT)AC(GA)TCCAT(TC)TG(SEQ ID NO4)TEM-11 BarflyH.vulgare 8 TC(CT)CCATTG(CT)G(AG)CCAGCCTA(SEQ ID NO5)TEM-2Tourist H.vulgare 4 CCTT(CT)TAA(AC)(ACGT)GAACAA(CG)CCC(SEQ ID NO6)TEM-12 HsMarl(Ma Homo sapiens 58 AATT(CA)(CT)TTTTGCACCAACCTriner)/MAD (SEQ ID NO7)E1§Hirochika and Hirochika 1993
表3主引物和相应的锚定引物TEM-1 (AG)TATTT(TA)GGAACGGAGGGAG SEQ ID NO1TEM-1A (AG)TATTT(TA)GGAACGGAGGGAGASEQ ID NO8TEM-1C (AG)TATTT(TA)GGAACGGAGGGAGCSEQ ID NO9TEM-1G (AG)TATTT(TA)GGAACGGAGGGAGGSEQ ID NO10TEM-1T (AG)TATTT(TA)GGAACGGAGGGAGTSEQ ID NO11TEM-2 CCTT(CT)TAA(AC)(ACGT)GAACAA(CG)CCC SEQ ID NO6TEM-2A CCTT(CT)TAA(AC)(ACGT)GAACAA(CG)CCCASEQ ID NO12TEM-2C CCTT(CT)TAA(AC)(ACGT)GAACAA(CG)CCCCSEQ ID NO13TEM-2G CCTT(CT)TAA(AC)(ACGT)GAACAA(CG)CCCGSEQ ID NO14TEM-2T CCTT(CT)TAA(AC)(ACGT)GAACAA(CG)CCCTSEQ ID NO15TEM-3 TT(TG)CCCAAAAGAACTGGCCCSEQ ID NO2TEM-3A TT(TG)CCCAAAAGAACTGGCCCA SEQ ID NO16TEM-3C TT(TG)CCCAAAAGAACTGGCCCC SEQ ID NO17TEM-3G TT(TG)CCCAAAAGAACTGGCCCG SEQ ID NO18TEM-3T TT(TG)CCCAAAAGAACTGGCCCT SEQ ID NO19TEM-4 GT(TC)TT(ACGT)AC(GA)TCCAT(TC)TGSEQ ID NO4TEM-4A GT(TC)TT(ACGT)AC(GA)TCCAT(TC)TGA SEQ ID NO20TEM-4C GT(TC)TT(ACGT)AC(GA)TCCAT(TC)TGC SEQ ID NO21TEM-4G GT(TC)TT(ACGT)AC(GA)TCCAT(TC)TGG SEQ ID NO22TEM-4T GT(TC)TT(ACGT)AC(GA)TCCAT(TC)TGT SEQ ID NO23TEM-10 TCCCCA(CT)T(AG)TGACCA(CGT)CC SEQ ID NO3TEM-10ATCCCCA(CT)T(AG)TGACCA(CGT)CCA SEQ ID NO24TEM-10CTCCCCA(CT)T(AG)TGACCA(CGT)CCC SEQ ID NO25TEM-10GTCCCCA(CT)T(AG)TGACCA(CGT)CCG SEQ ID NO26TEM-10TTCCCCA(CT)T(AG)TGACCA(CGT)CCT SEQ ID NO27TEM-11 TC(CT)CCATTG(CT)G(AG)CCAGCCTA SEQ ID NO5TEM-11ATC(CT)CCATTG(CT)G(AG)CCAGCCTAA SEQ ID NO28TEM-11CTC(CT)CCATTG(CT)G(AG)CCAGCCTAC SEQ ID NO29TEM-11GTC(CT)CCATTG(CT)G(AG)CCAGCCTAG SEQ ID NO30TEM-11TTC(CT)CCATTG(CT)G(AG)CCAGCCTAT SEQ ID NO31TEM-12 AATT(CA)(CT)TTTTGCACCAACCT SEQ ID NO7TEM-12AAATT(CA)(CT)TTTTGCACCAACCTASEQ ID NO32TEM-12CAATT(CA)(CT)TTTTGCACCAACCTCSEQ ID NO33TEM-12GAATT(CA)(CT)TTTTGCACCAACCTGSEQ ID NO34TEM-12TAATT(CA)(CT)TTTTGCACCAACCTTSEQ ID NO35用于琼脂糖检测系统的PCR扩增在25μl的体系中完成，其中包括2.5mM的MgCl2、0.4mM dNTP、每种引物各1μM和0.625单位的AmpliTaqTMDNA聚合酶(Perkin-Elmer)。使用下述的扩增程序起始的变性步骤为94℃1分30秒，然后以94℃30秒、58℃45秒、72℃1分钟为一循环，共35个循环，最后在72℃延伸5分钟。除非有特殊说明，都使用该程序。当包括TEM-1时，退火温度为60℃。
用于LI-COR检测体系的PCR扩增使用与常规琼脂糖体系相同的条件，不同的是，总体积为20μl并使用0.5个单位的AmpliTaqTMDNA聚合酶(Perkin-Elmer)。使用相同的扩增条件(包括TEM-1时没有温度的改变)。PCR扩增分两步进行。第一步是用非标记的引物预扩增35个循环。取3μl的预扩增混合物用于第二步扩增。在第二步扩增中使用浓度为0.1μM的标记引物(同第一步扩增中使用1μM的非标记引物相比)。
iv)数据收集和统计学分析a)指纹和遗传相似性分析对每一个体，多态性带和共有的带分别记分为出现(1)、缺失(0)和丢失数据(9)。得到的原始数据用Nei和Li(nei M.And W. Li 1979.用限制性内切酶研究遗传变异的数学模型。Proc.Natl.Acad.Sci.765269-5273.)的测定方法2nxy/(nx+ny)，来产生相对遗传相似性(GS)矩阵(matrices)，其中nx和ny分别为品种x和y的条带数，而nxy为二者共有的条带数。多态性带和共有条带均用于计算GS值。
用非加权配对算术平均方法(UPGMA)来根据GS矩阵产生树状图。用两个MITE引物(TEM-1和TEM-10)分析可得到组合的树状图。然后用正常化的Mantel统计方法(Mantel N.A，1967，不显著回归与疾病聚类的检测(Thedetection of disease clustering and a generalized regression approach)，CancerRes. 27209-220)来比较基于以MITE为基础的遗传标记得到的遗传相似性矩阵与基于313个多态性RFLP标记条带得到的遗传相似性矩阵。通过比较1000个随机排列的矩阵的分布所观察到的Z值来完成显著性检验，所有统计分析都用NTSYS-pc软件来进行(Rohlf. F.J.1994.NTSYS-pc数字结构和多变量分析系统，版本1.80，Exeter Software，N.Y.)。
b)遗传作图通过在曾用于构建大麦品种Lina和H.Spontaneum Canada Park群的杂交图谱的含71个RFLP标记的框架内，对用TEM-1和TEM-10引物得到的基于MITE的遗传标记进行作图，从而对它们进行定位。用该群体内的88个双单倍体个体作图。分离比率用x2分析法进行分析。使用计算机程序MAPMAKER进行作图(Lander E.S.，P.Green，J.Abrahamson，A.Barlow，M.J.Daly，S.E.Lincoln and L.Newburg 1987.MAPMAKER一种用于构建实验群与自然群的基础遗传连锁图的互动式软件包。Genomics 1174-181.)。以LOD阈值为4，用两点分析将基于MITE的遗传标记分配到连锁群中，其中7H群例外，该群在所述阈值时形成两群，根据RFLP标记的已公开位置进行连锁。在LOD阈值为2时，用多点分析将这些标记分配到连锁群中。
结果为了在本发明基于PCR的方法中评价MITE序列，从末端反向重复(TIR)区域设计引物，所有的引物方向都从TIR指向外。用这种方式，可以预期这些引物扩增的任何序列都位于可扩增距离内的两个相邻的MITE之间。这些引物单独或组合用于对大麦品种Lina与H.Spontaneum Canada Park的88个杂交子代双单倍体个体进行分离分析。
a)单引物扩增在琼脂糖凝胶上，每个MITE引物产生大约10个记分带，其中2-5个为多态性带。在大麦亲本Lina和H.Spontaneum Canada Park之间可明显检测到这些多态性，在双单倍体中大部分表现为1∶1的预期孟德尔分离比。
图1显示了分离图谱的一个实例。
M代表λPstI标记。泳道1包含大麦品种Lina的PCR产物。泳道2包含H.Spontaneum Canada Park的PCR产物。泳道3-28包含作图群中个体的PCR产物。
引物TEM-1带显示出较高的背景，其中一些带很弱甚至几乎观察不到，可能是由于很多密切相关的序列，例如TIR区变异所致的那些。在此情况下，在反应混合物中加入2％甲酰胺，因为有报道甲酰胺可降低PCR背景，增加特异性(Nagaoka T.And Y.Ogihara 1997.小麦简单序列重复多态性的应用及其作为DNA标记在RFLP和RAPD标记的比较中的应用。Theor.Appl.Genet.94597-602)。
在LI-COR测序胶上用引物TEM-1可检测到总共大约100个记分带，用引物TEM-10可检测到60-70个，而用TEM-3则为30-40个。用TEM-1进行的聚丙烯酰胺凝胶电泳的一个部分示于图2。同琼脂糖凝胶检测相似，在大麦亲本品种Lina和H.Spontaneum亲本品种Canada Park之间可明显检测到多态性，在双单倍体群中大部分表现为1∶1的预期孟德尔分离比。
泳道1包含亲本大麦品种Lina的PCR产物。泳道2包含亲本H.Spontaneum品种Canada Park的PCR产物。泳道3-45包含Lina与Canada Park的杂交群中各个体的PCR产物。
b)引物组合引物组合实验仅用于凝胶检测系统。当这些引物用不同的组合时，遇到几种情况。TEM-4/TEM-10引物组合出现的图谱和仅用TEM-10引物所产生的一致，而TEM-1/TEM-10引物组合出现的图谱则不同，其中单用TEM-10引物时出现的大部分带被抑制，而单用TEM-1所出现的条带可视性也减弱，出现了大小较小的条带。TEM-3/TEM-10引物组合及较长延伸时间(1分15秒)产生了一种不同的图谱，其具有3条清晰可见的分隔的带，它们不同于每种引物单独使用时出现的带(图3)。泳道1-16为作图群中的个体。没有显示亲本。
相似的情形在使用TEM-1引物的情况中也观察到。当TEM-1与TEM-4组合产生的带型(图4A)没有变化，而该引物与TEM-3或TEM-10组合时的图谱则发生变化。此外，TEM-1/TEM-4引物组合在较长延伸时间(1分15秒)的条件下产生了一个较大的分离带，而其它一些条带则受到抑制(图4B)。令人感兴趣的是，这条较大带(在引物组合后称为T1-4AA)同T4-10A(
图1)的分离模式几乎一致。T1-4AA和T4-10A并非共有引物TEM-4的相同产物，因为单独TEM-10也可扩增T4-10A带。此外，T1-4AA比T4-10A长约300bp。这表明两个引物组合扩增DNA中紧密连锁的区域。这种情况是可以预期的，因为已预测这些可转座元件具有很高的拷贝。
图4A和4B的图例说明和
图1相同。图4A和4B的泳道编号彼此对应。
一些引物组合产生不一致的结果。可能的解释为；每一个引物可单独扩增10个以上的条带，因此这些引物的组合要么产生过多的带，多到不能清晰可见，要么产生随细微条件变化而变化的带图谱；不同的退火温度(如使用TEM-4时，它具有低得多的退火温度)可能是测定带型的一个重要影响因素；引物的不同亲和力可能导致某些带占优势，如用TEM-1和TEM-10时的情形。
但是，在单引物反应中，使用荧光标记检测系统则可能解决其中的一部分问题，引物的组合也可能显著增加可检测位点的数量。
c)基于MITE的遗传标记的染色体定位使用琼脂糖检测系统，3个MITE引物和Tyl/copia逆转录转座子引物在作图群中可产生15个可检测的多态性标记。除了其中2个外，所有标记的分离比都是预期的1∶1。这些标记中13个可定位在图谱上。另外2个不连锁。这是和预期分离比有明显偏差的标记，可能是由大小相似的两个带组成，在凝胶上不能分离。
在图5中，基于MITE的遗传标记用较大字体和粗体表示。在丙烯酰胺凝胶上仅能观察到用荧光标记的TEM-1和TEM-10检测到的位点。括号中的位点表示不能被置于LOD值大于或等于2的位置的那些位点。引物TEM-1和TEM-10在LI-COR测序胶上可分别检测到大约120和90个清晰的条带。检测到的条带的大小范围在100bp到1kb之间。图2显示了用TEM-1扩增的产物在聚丙烯酰胺凝胶上的部分结果。
引物TEM-1和TEM-10可分别检测到75和19个多态性条带。多对扩增带表现为共显性行为(1H上的T1-0.2位点、2H上的T1-4和T1-16位点、3H上的T10-6位点、4H上的T1-8位点和7H上的T1-36位点，图5)，但其余条带则表现为有/无图谱，正好41个条带来自于Lina亲本，41个条带来自于H.spontaneum亲本。在70个作图的TEM-1位点中，24个相对于预期的1∶1分离比有显著偏差。除了一个位点(7H上的T1-19位点)外，其余23个位点均定位在下述区域，所述区域中该作图群的RFLP标记也表现为分离比不正常。在18个TEM-10位点中，2个位点相对于预期的分离比率有显著偏差，它们也定位在RFLP标记也偏离预期的1∶1比率的那些区域。
总共对88个位点进行了作图。这些位点覆盖了所有7个连锁群(图5)。此外，这些位点的分布没有明显的聚集，并非如期望分布在通常较少发生重组的中心粒附近(例如1H、3H和7H，图5)。事实上，这种分布类似于RFLP检测的cDNA结果(L.S.O’Donoughue，未发表)。这说明MITE位于包含编码区的基因组中，用有限的基于MITE的引物组有可能覆盖整个基因组。
d)指纹分析包括大麦亲本品种Lina和H.Spontaneum亲本品种Canada Park和25个大麦品种的总共27个品种(表1)用于评估这些MITE引物在指纹分析中的应用。在琼脂糖上，引物和引物组合TEM-3、TEM-10、TEM1/TEM-3和TEM-1/TEM-4可有效区分这些品种。使用这些引物或引物组合中的每一个都可观察到1-3个多态性条带。图6显示了在琼脂糖上的指纹实验的一个实例。
图6中的3个分离带表明27个品种分为7群。M代表分子量标记λPstI。数字都同表1相对应。
TEM-1和TEM-10两种MITE引物在指纹分析中用荧光标记检测系统进行了研究。TEM-1总共有62个记分带，其中37个为多态性带，而其余22个在所有27个品种都相同。图7显示了该电泳的一部分结果。TEM-10总共有60个记分带，其中34个为多态性带，而其余26个在所有27个品种都相同。可在表1中发现图7中的品种。
泳道1-27分别表示Lina、Canada Park、Alexis、Angora、Ariel、Azhul、Ellice、Express、Fillipa、Goldie、Golf、High amylose glacier、Igri、Ingrid、Kinnan、Maud、Meltan、Mentor、Mette、Mona、Roland、Saxo、Svani、Tellus、Tofta、Trebon和Vixen的结果。短杠表示可至少将一个品种区别于其它品种的标记。
用Nei和Li的系数(Nei and Li，同上)，根据TEM-1、TEM-10及两个引物的组合数据来得到GS矩阵。用相同的数据来产生树状图。TEM-1和TEM-10的结合数据得到的树状图如图8。该树状图将H.Spontaneum品种和大麦品种很清晰的分开。除了Azhul(6排型)外，春季两排型聚集在一起，同本发明所包括的4个冬季型(Angora、Express、Igri和Vixen)分开。同冬季两排型聚集的High Amylose Glacier品种为六排型。GS矩阵同以前用RFLP分析获得的矩阵的比较显示二者有很好的正相关，Mantel统计数值Z＝0.69475。这种正相关在概率P＝0.0020时非常显著，该Z值可随机获得。
e)引物的通用性为了测定引物的通用性，将动物来源和植物来源的MITE主引物用于植物、昆虫和人的基因组DNA。
图9A、9B、9C和9D显示了11种不同DNA来源的PCR扩增图谱的典型结果，所用为主引物TEM-12(图9A)、主引物TEM-1(图9B)、主引物TEM-10(图9C)和主引物TEM-11(图9D)，可参照表2。DNA的来源(上述每一泳道所列)为1)正常人DNA，男。
2)正常人DNA，女。
3)人DNA，白化病男患者。
4)人DNA，白化病女患者。
5)昆虫赤眼蜂(Trichogramma)。
6)豆科植物大豆。
7)豆科植物苜蓿。
8)十字花科植物Canola。
9)谷类小麦。
10)谷类燕麦。
11)谷类大麦。
这些结果清楚的表明，基于MITE的标记可在较广泛的物种中使用。
f)主序列衍生的序列的多样性为了测定基于MITE的标记系统的多样性，在主引物序列的3’端添加一个额外的核苷酸。这可以增加扩增产物的特异性，且尤其适用于主序列的扩增表现过于复杂而难于解释的情况，如来源于Stowaway的TEM-1引物导致的那样。
图10A、10B、10C、10D和10E说明了在预扩增步骤中用主引物TEM-1和在扩增步骤中用表3所列其相应锚定引物所得到结果的一个示例。这些图显示谷类DNA(大麦)用不同引物进行聚合酶链反应(PCR)所得扩增图谱的比较，所用引物包括单用TEM-1(
图10A)、锚定引物TEM-1A，在其3’端加入一个额外的“A”(
图10B)、锚定引物TEM-1C，加入一个“C”(
图10C)、锚定引物TEM-1G，加入一个“G”(
图10D)、锚定引物TEM-1T，加入一个“T”(
图10E)。
这些结果清楚表明，当在TEM-1的3’末端用A、C、T或G锚定时，可获得更简单的扩增图谱。还清楚的表明，用不同的3’末端锚定物可获得不同但却互补的扩增图谱。
一般目的和商业应用各种研究表明，可转座元件事实上存在于迄今研究的每一物种中。逆转录转座子则在植物基因组中存在高拷贝数。每个单倍体人基因组中估计存在5×105个拷贝的Alu家族序列，平均每5kb的DNA就可翻译为一个Alu元件。该元件在灵长类基因组占5％(Berg D.E.and M.M.Howe 1989.可移动DNA.Washington，American Society of Microbiology)。Tyl/copia组元件在Vicia种中每个基因组最多有106拷贝，占基因组的比例超过2％，但不同物种间的变异比较大(Pearce S.R.，H.Gill，D.Li，J.S.Heslop-Harrison，A.Kumar and A.J.Flavell1996，Vicia种中的Tyl-copia逆转录转座子群拷贝数、序列异质性和染色体定位。Mol. Gen. Genet. 250305-315)。BARE-1逆转录转座子含有3×104个拷贝，占大麦基因组的6.7％(Suoniemi A.，K.Anamthawat-Jonsson，T Arna and A.H.Schulman 1996.逆转录转座子BARE-1是大麦(Hordeum vulgare L.)基因组中散布的一种主要成分。PlantMolecular Biology 301321-1329)。在SanMiguel等的研究中(SanMiguel P.，A.Tikhonov，y.-k.Jin，N，Motchoulskaia，D.Zakharov，A.Melake-Berhan，P.S.Springer，K.J.Edwards，M.Lee，Z.Avramova and J.L.Benenetzen 1996.在玉米基因组中基因间区域内的嵌套逆转录转座子。Science 274765-768)，对在酵母人工染色体(YAC)上分离的玉米Adhl-F基因侧翼的280kb毗连区域的测序显示，有37类嵌套逆转录转座子重复序列，占该克隆的比例大于60％。
Tourist和Stowaway元件(Bureau T.E.And S.R.Wessler 1992.Tourist一种与玉米基因密切连锁的小分子反向重复元件大家族。Plant Cell 41283-1294；and Bureau T.E.and S.R.Wessler 1994.Stowaway一种同单子叶和双子叶植物基因密切连锁的反向重复元件的新家族。Plant Cell 6907-916)为TIR类转座元件的成员，尽管它们同传统的TIR转座元件家族如Ac和En/Spm有很大的不同。已发现象Tourist和Stowaway一样作为TIR转座元件家族新成员的Barfly与大麦木聚糖异构酶基因连锁。这些元件同该类型的一些其它元件共同被称为MITE(Bureau T.E.，P.C.Ronald，and S.R.Wessler 1996.一项基于计算机的系统调查显示在野生型水稻基因中存在大量小分子反向重复元件。Proc.Natl.Acad.Sci.938524-8529.)，它们在迄今研究的大量植物物种中都有发现。可以预期MITE在真核生物基因组中也含有大量拷贝。
可转座元件在基因组中的普遍性和散布的特征，可使之开发为基于PCR的作图工具。事实上，Sinnet等(Sinnet D.，J.M.Deragon，L.R.Simard and D.Labuda 1990.Alumorphs-用Alu特异引物进行聚合酶链反应来检测人DNA多态性。Genomics 7331-334)利用Alu特异的引物寻找不同人DNA样品中的多态性。这些作者清楚的表明，利用这些多态性(术语为Alu多态性(alumorphs))作为基因组分析工具是可行的(Sinnet et al.同上)，并成功的用这些alumorphs检测到一种alumorph与一种人类疾病相关(Zietkiewicz E.，M.Labuda，D.Sinnet，F.H.Glorieus and D.Labuda 1992.用Alu寡核苷酸定向PCR同时筛选多个多态性位点来进行连锁作图。Proc. Natl. Acad. Sci. 898448-8451)。一种类copia逆转录转座子PDRl也被成功的用于研究多态性，并通过与其它特异引物组合来鉴定Pisum中不同的品系(Lee D.，T.H.N.Ellis，L.Turner，R.P.Hellens and W.G.Cleary 1990.Pisum中的类copia元件表明分散的重复序列可用于遗传分析。Plant Molecular biology 15707-722)。
在本发明中，TIR转座元件成员MITE被用于大麦的作图和指纹分析工具，并成功的用常规琼脂糖系统和LI-COR自动DNA分析系统来检测多态性、将这些MGMs定位在现有的遗传连锁图谱中以及对大麦物种内的品种进行指纹分析。
在常规琼脂糖系统中，我们显示，利用3种MITE引物和一种逆转录转座子引物可检测到15个清晰的可记分多态性，其中的13个定位在大麦的4个连锁群中。每种MITE引物或引物组合可产生10个以上记分带，其中2-5个带为多态性。在LI-COR自动DNA分析系统中，两种MITE引物中的每一种可产生近100个记分带，其中多达75个为多态性。用这两种引物对所有7个大麦连锁群进行了标记作图。这表明基于MITE的标记在基因组中是随机分布的。
利用基于计算机的序列相似性搜索可不断发现新的MITE。随着MITE数量的增加，事实上任何具有高拷贝MITE的物种都可仅基于MGMs来轻易构建详细的连锁图。也可很容易地利用MGM进行重要基因的连锁研究。用这些基于MITE的引物在相同物种的不同品种之间检测出高水平变异，说明这些引物具有实际的应用价值。
一些转座元件例如Alu(Berg and Howe，supra；Makalowski W.，G.A.Michell and D.Labuda 1994.mRNA编码区中的Alu序列蛋白变异的来源。Trends Genet.10188-193)，和小鼠B2元件(Clemens M.J.1987.从B2重复序列转录的RNA在调节mRNA稳定性方面的潜在作用。Cell 49157-158)已被发现与基因密切连锁。在植物和其它真核生物基因内也经常鉴定出MITE成员。Stowaway首先是作为玉米wx位点突变因素被发现(Bureau andWessler，同上)。已经发现超过100个基因在它们的编码区或非编码区含有MITE(Bureau et al.，同上)。逆转录元件同动物和植物基因的密切连锁，以及MITE同农作物和其它植物中基因的密切连锁为鉴定基因或基因序列提供了新途径。事实上，已有人利用其它类型的转座元件在分离基因序列(Nelson D.L.，S.A.Ledbetter，L.Corbo，M.F.Victoria，R.Ramirez-Solis，T.D.Webster，D.H.Ledbetter and C.T.Caskey 1989.Alu聚合酶链反应一种从复杂DNA源中快速分离人特异性DNA序列的方法。Proc.Natl.Acad.Sci.866686-6690；Souer E.，F.Quattrocchio，N.De Vetten，J.Mol and R.Koes 1995.一种用高拷贝转座元件作标记分离基因的通用方法。Plant Journal 7677-685)、基因组分析(Hirochika H.1997.水稻逆转录转座子它们的调控及在基因组分析中的应用。Plant Molecular Biology 35231-240；Lee D.，T.H.N.Ellis，L. Turner，R.P.Hellens and W.G.Cleary 1990.Pisum中的类copia元件表明分散的重复序列可用于遗传分析。Plant Molecular biology 15707-722)、分析基因结构和表达(White S.E.，L.F.Habera and S.R.Wessler 1994.正常植物基因侧翼区的逆转录转座子类copia元件在基因结构和表达的进化中的作用。Proc.Natl. Acad.Sci.9111792-11796)方面进行了研究。
本发明的方法可用于几个方面。
1)在连锁研究中a)如本申请所述，可以用MITE标记来构建连锁图谱。这需要一个分离群以及多个亲本。根据分离来构建连锁图谱。
b)也可对表型性状或基因进行连锁分析。这可以通过进行大量的分离分析来完成。在这种情况下，将利用两种亲本和具有表型(性状)或遗传(基因)差异的两种群体以MITE引物进行PCR扩增来鉴定多态性标记，并因此推测连锁。
c)根据相同的原理，可以使用各种统计分析，例如单点方差分析(ANOVA)、间隔作图和复合间隔作图，来检测MGM或IMP同数量性状位点(QTL)控制的性状在复杂遗传控制下的关联性。
d)如果已经知道农作物重要性状同标记的关联性，这些标记可用在基于标记的筛选(MAS)中，从而加速育种。
2)在指纹研究中MGM和IMP方法可用于帮助构建大插入片断文库，例如YAC (酵母人工染色体)和BAC(细菌人工染色体)，从而可以有助于品种鉴定、基因分离和标记转换。
a)所产生的MGM和IMP标记可用作重叠群的排列和染色体步移的标志。
b)MGM和IMP方法可很容易的用于对品种进行指纹分析和培育品系，来测定它们的谱系和遗传关系，测定亲本对子系的贡献，来鉴定新的品系和品种。
MGM方法可有助于基因分离和亚克隆基因组序列。
a)当用转座元件标记基因时，可以利用MGM在基因组中的普遍分布对其加以开发。MITE引物可与根据标记的转座子而设计的引物结合使用。可扩增得到侧翼序列，然后其可以用于分离野生型基因。同常规的转座子标记型基因的克隆方法相比，该方法节省了一轮DNA文库筛选。
b)在与基因分离相似的情形中，MGM可用于分离已知基因序列的侧翼序列。可用MITE引物以及根据已知基因序列而设计的引物结合经PCRs扩增得到侧翼序列。
c)用来自检测RFLP的DNA克隆的引物以及MITE引物经扩增可将RFLP标记转换为基于PCR的标记。
尽管上述内容是结合具体实施方案对本发明进行的描述，但是本领域技术人员应当理解的是，本发明还可以做进一步改动，本申请应当包括遵循本发明所述原理而进行的任一变动、应用和调整，其中应当包括符合下述条件的改进方案落入本发明所述技术领域中已知或常规实践中的技术方案、具有本发明上述基本特征的技术方案、以及落入下述权利要求范围内的技术方案。
序列表<110>麦吉尔大学(MCGILL UNIVERSITY)DNA兰德马克斯公司(DNA LANDMARKS INC.)贝努特兰德里(LANDRY，Benoit)<120>一种基于转座子的新型遗传标记<130>1770-222PCT<150>60/127，460<151>1999-01-04<160>35<170>适用于Windows 3.0的FastSEQ<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工引物<400>1rtatttwgga acggagggag 20<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工引物<400>2ttkcccaaaa gaactggccc 20<210>3<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工引物<400>3tccccaytrt gaccabcc18<210>4
<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工引物<400>4gtyttnacrt ccatytg 17<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工引物<400>5tcyccattgy grccagccta 20<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工引物<400>6ccttytaamn gaacaasccc20<210>7<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工引物<400>7aattmytttt gcaccaacct 20<210>8<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工引物<400>8rtatttwgga acggagggag a 21<210>9<211>21
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工引物rtatttwgga acggagggag c 21<210>10<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工引物<400>10rtatttwgga acggagggag g 21<210>11<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工引物<400>11rtatttwgga acggagggag t21<210>12<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工引物<400>12ccttytaamn gaacaasccc a21<210>13<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
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<213>人工序列<220>
<223>人工引物<400>14ccttytaamn gaacaasccc g21<210>15<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工引物<400>15ccttytaamn gaacaasccc t 21<210>16<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工引物<400>16ttkcccaaaa gaactggccc a 21<210>17<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
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<220>
<223>人工引物<400>19ttkcccaaaa gaactggccc t 21<210>20<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>人工引物<400>21gtyttnacrt ccatytgc 18<210>22<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工引物<400>22gtyttnacrt ccatytgg 18<210>23<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工引物<400>23gtyttnacrt ccatytgt 18<210>24<211>19<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>人工引物<400>24tccccaytrt gaccabcca 19<210>25<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工引物<400>25tccccaytrt gaccabccc19<210>26<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工引物<400>26tccccaytrt gaccabccg19<210>27<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工引物<400>27tccccaytrt gaccabcct19<210>28<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工引物<400>28tcyccattgy grccagccta a 21<210>29<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工引物<400>29tcyccattgy grccagccta c21<210>30<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工引物<400>30tcyccattgy grccagccta g 21<210>31<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工引物<400>31tcyccattgy grccagccta t 21<210>32<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工引物<400>32aattmytttt gcaccaacct a 21<210>33<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工引物<400>33aattmytttt gcaccaacct c 21<210>34<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工引物
<400>34aattmytttt gcaccaacct g 21<210>35<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工引物<400>35aattmytttt gcaccaacct t 2权利要求
1.一种检测目的核酸序列的多态性的方法，该方法包括下述步骤a)用一对引物扩增该目的核酸序列，其中第一引物与微型反向重复可转座元件(MITE)，其片段或其衍生物同源，该第一引物可与所述目的核酸序列中的MITE退火，第二引物可与第一引物相同或不同，并可与MITE序列同源或不同源；b)分离步骤a)中扩增的目的核酸序列的片段；c)分析步骤b)中所获片段与对照片段的关系，所述对照片段是用至少一个用于测定步骤b)中所获片段与对照片段之间核酸序列差异的引物扩增核酸序列得到的，所述差异即表示所述目的核酸的多态性。
2.一种真核生物基因分型方法，该方法包括下述步骤a)用一对引物扩增该真核生物中的目的核酸序列，其中第一引物与MITE，或其片段或其衍生物同源，该引物可与目的核酸序列中所述MITE退火，第二引物可与第一引物相同或不同，并与MITE同源或不同源；b)分离步骤a)中扩增的核酸序列的片段；c)比较步骤b)中所获片段与所述真核生物中对照核酸序列的片段，其中步骤b)中的片段与对照核酸序列的片段的同一性在携有所述核酸序列的所述真核生物中存在或不存在。
3.一种用于对真核生物进行指纹分析的方法，该方法包括下述步骤a)用一对引物扩增真核生物中的核酸序列，其中第一引物与MITE，或其片段或其衍生物同源，该引物特异于MITE序列，第二引物可与第一引物相同或不同，并与MITE同源或不同源；b)分离步骤a)中扩增的核酸序列的片段，如此分离的片段即可代表该真核生物。
4.权利要求1、2或3中的方法，其中的扩增步骤通过PCR实现。
5.权利要求1、2、3或4中的方法，其中所述第一引物来自Tourist、Stowaway、Barfly或HSMarl Mariner和MADE1元件的共有核酸序列。
6.权利要求1、2、3、4或5中的方法，其中所述第一引物含有选自下组的核酸序列SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9、SEQ ID NO10、SEQ ID NO11、SEQ ID NO12、SEQ ID NO13、SEQID NO14、SEQ ID NO15、SEQ ID NO16、SEQ ID NO17、SEQ ID NO18、SEQ ID NO19、SEQ ID NO20、SEQ ID NO21、SEQ ID NO22、SEQID NO23、SEQ ID NO24、SEQ ID NO25、SEQ ID NO26、SEQ ID NO27、SEQ ID NO28、SEQ ID NO29、SEQ ID NO30、SEQ ID NO31、SEQID NO32、SEQ ID NO33、SEQ ID NO34和SEQ ID NO35。
7.权利要求1、2、3、4、5或6中的方法，其中所述第二引物选自MITE特异性引物、基于SSR序列的引物、逆转录元件、可检测RFLP的克隆核酸的序列、随机基因组序列、载体序列或基因序列。
8.可利用权利要求1、2、3、4、5、6或7的方法检测的多态性在追踪真核生物的子代方面的应用。
9.可利用权利要求1、2、3、4、5、6或7的方法检测的多态性在测定真核生物的杂种性方面的应用。
10.可利用权利要求1、2、3、4、5、6或7的方法检测的多态性在鉴定真核生物中连锁表型性状的变异方面的应用。
11.可利用权利要求1、2、3、4、5、6或7的方法检测的多态性作为用于构建遗传图谱的遗传标志方面的应用。
12.可利用权利要求1、2、3、4、5、6或7的方法检测的多态性在鉴定杂交子代方面的应用，其中所述子代含有来自亲本供体和/或亲本受体的所需遗传特征。
13.权利要求1、2、3、4、5、6或7方法在分离与基因编码序列或非编码序列相邻的基因组DNA序列方面的应用。
14.权利要求13中的方法，其中所述与基因编码序列相邻的基因组DNA序列为启动子或调控序列。
15.一种核酸片段或其衍生物，该片段是通过用至少一个与MITE同源的引物对真核生物的核酸序列扩增而来，其中MITE作为核酸序列上的探针使用。
16.权利要求15中的核酸片段或其衍生物的应用，其用于利用标记进行的筛选(MAS)、基于作图的克隆、杂合子鉴定、指纹分析、基因分型和等位基因特异性标记。
17.权利要求2的方法，其中所述真核生物为植物、动物或真菌。
18.权利要求3的方法，其中所述真核生物为植物。
19.一种基因组作图方法，包括下述步骤a)分级分离真核生物的基因组；b)将所分离的基因组克隆到载体中；c)通过用同源于微型反向重复可转座元件(MITE)的第一引物以及一个第二引物扩增所克隆载体中的DNA，从而检测该载体，其中所述第一引物能与所述DNA中的微型反向重复可转座元件(MITE)杂交，所述第二引物可与第一引物相同或不同，并与MITE序列同源或不同源；d)根据大小来分离扩增步骤中的延伸产物；e)测定延伸产物的图谱；f)从重叠图谱来重建基因组。
20.一种对多态性遗传标记作图的方法，包括a)提供真核生物样品中核酸序列的限制酶消化混合物；b)用同源于微型反向重复可转座元件(MITE)或其片段或其衍生物的第一引物以及一个第二引物扩增所述限制酶消化的核酸序列混合物，其中第一引物特异于MITE，第二引物可与第一引物相同或不同，并与MITE序列同源或不同源；c)鉴定该混合物中一组差异扩增的核酸序列；d)对其中至少一个差异扩增的核酸序列进行特有遗传多态性的作图，由此为所述多态性提供一个标记。
全文摘要
本发明涉及与MITE同源的DNA引物在用于检测核酸序列多态性的方法中的应用。该方法包括下述步骤:用一对引物扩增核酸序列(其中第一引物与MITE同源,第二引物与MITE同源或不同源),分离所扩增的核酸片段,分析所获得片段同对照片段的关系,其中对照片段是核酸序列的扩增产物,该扩增所用引物与用于检测核酸序列多态性的MITE序列同源。根据本发明,与MITE同源的DNA引物也可用于基因分型、指纹分析、作图或克隆方法。
文档编号C12N15/09GK1351671SQ00807651
公开日2002年5月29日 申请日期2000年3月30日 优先权日1999年4月1日
发明者托马斯·布若, 常茹英, 路易丝·S·奥多诺休, 贝努特·兰德里 申请人:麦吉尔大学, Dna兰德马克斯公司