专利名称：1,3－丙二醇脱氢酶突变体的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种1，3-丙二醇脱氢酶突变体，其对于1，3-丙二醇的米氏常数有所改变。本发明提供了1，3-丙二醇脱氢酶突变体的核酸和氨基酸序列。本发明同时提供了1，3-丙二醇脱氢酶突变体的表达载体和宿主细胞。
在肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)和弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)中，编码甘油脱水酶(dhaB)、1，3-丙二醇氧化还原酶(dhaT)、甘油脱氢酶(dhaD)和二羟基丙酮激酶(dhaK)功能性相关活性的基因都存在于dha调节子中。柠檬酸杆菌和克雷伯氏菌的dha调节子已经在大肠杆菌(Escherichia coli)中进行了表达，并显示可以把甘油转化成1，3-丙二醇。
一种1，3-丙二醇脱氢酶的核酸和氨基酸序列已经在现有技术中被公布，包括肺炎克雷伯氏菌GenBank U30903号(Williard，1994，“肺炎克雷伯氏菌1，3-丙二醇途径的研究甘油脱水酶和1，3-丙二醇氧化还原酶的性质和表达”，化学工程学论点(Thesis ChemicalEngineering)，威斯康星大学曼狄逊)；弗氏柠檬酸杆菌GenBankU09771号(Daniel等，1995，从弗氏柠檬酸杆菌中纯化1，3-丙二醇脱氢酶克隆、测序和在大肠杆菌中表达相关基因，细菌学杂志(J.Bacteriol.)，1772151-2156)巴氏梭菌(Clostridiumpasteurianum)GenBank AF006034号(Luers等，1997，巴氏梭菌把甘油转化成1，3-丙二醇克隆和表达编码1，3-丙二醇脱氢酶的基因，FEMS Microbiol Lett.154337-345)。
因此，本发明提供了一种突变PDD，和野生型相比，其对于1，3-丙二醇的米氏常数有所提高。在一个实施例中，突变PDD对1，3-丙二醇的米氏常数大约是野生型PDD的3倍。在另一个实施例中，突变PDD对于1，3-丙二醇的米氏常数大约是80mM。在进一步的实施例中，突变PDD可以从蟑螂埃希氏菌ATCC保藏号PTA-92得到。
在本发明的另一个实施例中，突变PDD在相当于蟑螂埃希氏菌PDD第105位His处含有被Leu替换的突变，如图3所示。在又一个实施例中，突变PDD含有如SEQ ID NO2所示的氨基酸序列，编码的核酸序列如SEQ ID NO1所示。
本发明也提供了含有具SEQ ID NO1所示序列的分离核酸的表达载体和宿主细胞。在一个实施例中，宿主细胞包括柠檬酸杆菌(Citrobacter)、肠细菌(Enterobacter)、梭菌(Clostridium)、克雷伯氏菌(Klebsiella)、气杆菌(Aerobacter)、乳杆菌(Lactobacillus)、曲霉(Aspergillus)、酵母(Saccharomyces)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)、接合酵母(Zygosaccharomyces)、毕赤氏酵母(Pichia)、克鲁维酵母(Kluyveromyces)、假丝酵母(Candida)、汉森酵母(Hansenula)、德巴利酵母(Debaryomyces)、毛霉(Mucor)、球拟酵母(Torulopsis)、甲基细菌(Methylobacter)、埃希氏杆菌(Escherichia)、沙门氏菌(Salmonella)、芽孢杆菌(Bacillus)、链霉菌(Streptomyces)和假单胞菌(Pseudomona)。
在一个增加的实施例中，本发明涉及使用含有突变PDD的微生物生产1，3-丙二醇的方法。
图2提供了突变1，3-丙二醇脱氢酶(PDD)的氨基酸序列(SEQ IDNO2)。
图3提供了来自不同微生物的PDD的氨基酸序列的比对。Eb_GEBT代表ATCC保藏的蟑螂埃希氏菌突变PDD，Eb_429T和Eb907T是野生型蟑螂埃希氏菌(ATCC 33429号)；Kpn是肺炎克雷伯氏菌(GenBankU30903号)；Cfu是弗氏柠檬酸杆菌(Genbank U09771号)；Cpast是巴氏梭菌(Clostridium Pasteurianum)(Genbank AF006034号)。
根据布达佩斯条约保藏的微生物的描述申请人基于布达佩斯条约中国际承认用于专利申请的程序进行了下面的微生物保藏。
详述定义术语“1，3-丙二醇脱氢酶”或“PDD”(本领域中也被称为“氧化还原酶”)是指具备能够催化3-羟基丙醛发生还原反应，生成1，3-丙二醇的酶活性多肽。例如1，3-丙二醇脱氢酶就包括dhaT基因编码的多肽。本发明包含任何来源的1，3-丙二醇脱氢酶，包括但不只限于蟑螂埃希氏菌、肺炎克雷伯氏菌、弗氏柠檬酸杆菌、巴氏梭菌。
这里所用到的术语“突变”或“突变体”是指微生物核酸上发生的任何遗传性改变，而不一定反映微生物表型上的改变。突变可能包含一个碱基对的替换、删除或插入；突变也可能包含一大片DNA区域的改变，比如重复或倒置。突变1，3-丙二醇脱氢酶的氨基酸序列可能是由1，3-丙二醇脱氢酶前体，经过替换、删除或插入天然1，3-丙二醇脱氢酶中的一个或多个氨基酸得到的。基因突变方法在本领域中已有描述(比如定点寡核苷酸诱变)。
这里所用到的术语“相当于”是指图3所示1，3-丙二醇脱氢酶的氨基酸相关性。这里提到的特定残基都带有参照图3中显示的蟑螂埃希氏菌GEB PDD编号的氨基酸残基号。His突变成Leu在图3中显示的是105位残基。图3显示了可以采用CLUSTALW方法比对多种微生物来源的1，3-丙二醇脱氢酶序列。本发明并非只限制于
图1和图2所示的蟑螂埃希氏菌PDD突变，或者ATCC保藏的PTA-92号蟑螂埃希氏菌的突变，而是指所有在相当于蟑螂埃希氏菌已鉴定残基位点具有类似氨基酸PDD。如果残基和蟑螂埃希氏菌PDD中特定残基或残基部分是同源的(例如，一级结构或者三级结构位置相似)或相似的(例如，有相同或相似的结合能力、反应能力或者化学或结构上相互作用能力)，那么该残基就是相当的。
为了确定一级结构的同源性，直接把PDD的氨基酸序列和蟑螂埃希氏菌PDD的一级序列进行比较(如图2所示)，尤其是与已知在所有PDD中均无变化的一系列残基相比较(见图3)。本发明包含所当有来源的1，3-丙二醇脱氢酶的相当残基突变，条件是该突变形式能够改变对1，3-丙二醇的活性的Km值。在一个优先实施例中，突变体对于1，3-丙二醇的米氏常数有所增加。通过PCR技术得到了如SEQ IDNO1所示的核酸序列。PCR技术经常会产生序列错误。因此，本发明也包含了ATCC PTA-92号的蟑螂埃希氏菌的1，3-丙二醇脱氢酶，及其他微生物来源的1，3-丙二醇脱氢酶的相关突变。
术语“米氏常数”是指酶和底物的亲和性。高米氏常数反应了低亲和性；低米氏常数反应了高亲和性。
术语“碳底物”或“碳源”是指能够被本发明的宿主微生物代谢的含碳物质，尤其指选自单糖、低聚糖、多糖和一碳底物或它们的混合物的碳源。
术语“宿主细胞”或“宿主生物”是指能够接受外来或异源基因，并且能够表达这些基因，产生有活性的基因产物的微生物。
这里用到的“核酸”是指核苷酸或者多核苷酸序列，序列的片断或者一部分，基因组成合成来源的DNA或RNA，可以是双链或单链，有义链或无义链。术语“天然”或“野生型”是指自然中发现的带有自己调控序列的基因。这里用到的“氨基酸”是指肽或蛋白质序列或者它们的部分。
术语“表达”是指由编码基因产物序列的基因经过转录和翻译，形成基因产物。
术语“质粒”、“载体”和“盒”是指染色体外的元件，它们常常携带并非细胞重要代谢一部分的基因，而且常常为环状双链DNA分子形式。这些元件可能是自身复制序列、基因组整合序列、噬菌体或核苷酸序列、线性或环状、单链或双链的DNA或RNA，可以是任何来源，其中已经将一些核苷酸序列连接或重组成独特的结构，能够把启动子片段和选定基因产物的编码DNA序列与适当的3′非翻译序列整合入细胞。“转化盒”是指特殊的含有外源基因及有助于转化特定宿主细胞的元件的载体。“表达盒”是指含有外源基因和能够使该基因在外源宿主中大量表达的元件的载体。
这里用到的术语“分离”或“纯化”是指已经将其与天然相关的至少一种成分相分离的核酸或者氨基酸。发明详述本发明涉及特征在于对于1，3-丙二醇的米氏常数有所提高的突变1，3-丙二醇脱氢酶(PDD)。1，PDD序列如SEQ ID NO1所示的多核苷酸序列编码在105位的His突变成Leu的1，3-丙二醇脱氢酶(SEQ ID NO2)，如图3所示。本领域技术人员都知道，由于密码子的简并性，有多个多核苷酸能够编码SEQ IDNO2。本发明包含所有这些多核苷酸。本发明包含具有相当于如图3所示蟑螂埃希氏菌105位残基His被Leu替换的突变的PDD的编码核酸。肺炎克雷伯氏菌PDD的核酸和氨基酸序列见GenBank U30903号；弗氏柠檬酸杆菌PDD的核酸和氨基酸序列见GenBank U09771号；巴氏梭菌PDD的核酸和氨基酸序列见GenBank AF00034号。本发明也包含可从ATCC PTA-92号蟑螂埃希氏菌的获得的突变PDD。
从微生物基因组中得到目的基因的方法是分子生物学领域中的常见方法。例如，如果已经知道某一基因的序列，就可以用限制性内切酶制作合适的基因组文库，然后用互补于目的基因序列的探针来筛选该基因。一旦分离到基因序列，就可以通过诸如多聚酶链式反应(PCR)等标准引物介导的扩增方法扩增DNA，得到适于用合适载体进行转化的DNA量。
或者，采用粘粒载体转化合适细菌宿主的方法详述于Sambrook等，分子克隆，第二版(1989)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor NY。
进行PDD基因突变的方法是熟练的技术人员所共知的，例如包括定点诱变，实验程序如1988年7月26日颁发的美国专利US4760025号所述。载体和表达盒本发明提供了多种适于在合适宿主细胞中克隆、整合和表达突变PDD的载体和转化与表达盒，同时这些载体和盒也适用于其他1，3-丙二醇生产相关蛋白的表达。适合的载体可以是与所用细菌相容的那些。适合的载体可能衍生于例如细菌、病毒(比如噬菌体T7或M13衍生的噬菌体)、粘粒、酵母或植物。获得和使用这种载体的方法是熟练的技术人员所共知的。(Sambrook等，分子克隆，第1、2、3卷，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor NY，1989)一般来说，载体或盒含有介导相关基因转录和翻译的序列、筛选标记、促使自主复制或染色体整合的序列。适合的载体在基因的5’端含有转录起始控制区域，3’端含有转录终止控制区域。虽然一般人们认为这两个控制区域并不需要来自选作生产宿主的具体物种的天然基因，但是本发明最优选两种控制区都来源于和转化宿主细胞同源的基因。
起始控制区域或启动子，对于启动PDD在目的宿主细胞中的表达是非常重要的。熟练的技术人员知道大量的启动子，对它们都比较熟悉。事实上，能够启动这些基因的任何启动子都可以用于本发明，包括但并不只局限于CYC1、HIS3、GAL1、GAL10、ADH1、PGK、PHO5、GAPDH、ADC1、TRP1、URA3、LEU2、ENO、TPI(适用于酵母中的表达)；AOX1(适用于在毕赤酵母中的表达)、lac、trp、IPL、IPR、T7、tac、trc(适用于在大肠杆菌中的表达)。
终止控制区域也可能来自优选宿主天然的多个基因。任选地，终止位点可能不是必须的，然而，包括有则最为优选。
为了使本发明酶能够高效表达，编码酶的DNA通过起始密码子与选定的表达控制序列可操作连接，使得表达形成适当的mRNA。PDD转化适当的宿主和表达一旦合适的盒构建成功之后，就被转化到适当的宿主细胞。采用众所周知的方法把只含有1，3-丙二醇脱氢酶突变体或含有突变体以及1，3-丙二醇生产中的其他必需蛋白的盒转化到宿主细胞，例如经转化(例如，用钙透化细胞转化或者电穿孔转化)或用重组噬菌体病毒转染。(Sambrook等，如上)宿主细胞合适用于1，3-丙二醇重组生产的宿主细胞可能是原核生物或者真核生物，具体的选择取决于宿主细胞表达有活性酶的能力。优先选用的宿主通常是可用于生产甘油或1，3-丙二醇的宿主，比如柠檬酸杆菌、肠杆菌、梭菌、克雷伯氏菌、气杆菌、乳杆菌、曲霉、酵母、裂殖酵母、接合酵母、毕赤氏酵母、克鲁维酵母、假丝酵母、汉森酵母、德巴利酵母、毛霉、球拟酵母、甲基细菌、埃希氏杆菌、沙门氏菌、芽孢杆菌、链霉菌和假单胞菌。本发明最优选采用的是大肠杆菌、克雷伯氏菌属和酵母属的种。培养基和碳源本发明的发酵培养基必须含有合适的碳底物。合适的底物可能包括但并不局限于以下几种单糖比如葡萄糖和果糖、寡糖比如乳糖和蔗糖、多糖比如淀粉和纤维素，或者上面几种的混合物，或可再生原料的粗制混合物比如奶酪乳清浸取物、玉米浆、甜菜糖蜜或大麦芽。另外，碳底物也可能是一碳底物，比如二氧化碳或可以代谢转化成关键生化中间体的甲醇。
首选的碳源是单糖、寡糖、多糖和一碳化合物。更优选的是糖类比如葡萄糖、果糖、蔗糖和一碳底物比如甲醇和二氧化碳。最优选的是葡萄糖。
除了合适的碳源，发酵培养基必须含有合适的矿物质、盐、辅助因子、缓冲液和其他成分，这些是熟练技术人员都知道的，适于培养物生长和促进甘油生产必需酶促途径。还要注意加入Co(II)盐和/或维生素B12或它的前体。培养条件一般，细胞用合适培养基在30℃培养。本发明中首选的生长培养基是常见的市售培养基如LB培养基、SD(Sabouraud Dextrose)培养基或YM(Yeast Malt Extract)培养基。其他已知成分或合成的生长培养基可能也会用到。熟悉微生物或发酵生物学的人知道适于某种微生物生长的合适培养基。反应介质中可以掺入可能会直接或间接调节代谢的物质，比如2’-3’cAMP(环腺苷一磷酸)或2’-5’cAMP。同样，可以单独或与遗传操作一起使用可调节酶活性的物质(例如亚硫酸盐、亚硫酸氢盐和碱)，增强甘油的生成。
发酵的合适pH从5.0到9.0，发酵早期pH一般为6.0到8.0。
反应可以在有氧或者无氧的环境下进行，其中优选厌氧或微好氧条件。
通过参考下面的实施例，熟练技术人员就很容易理解本发明中所采用的方式和方法。下面的实施例并没有限制本发明范围以及后面的权利要求述及的范围。
这里提到的所有参考文献，包括专利、专利申请、序列和出版物都全部引入本文作为参考。
权利要求
1.一种突变1，3-丙二醇脱氢酶，与相应的野生型1，3-丙二醇脱氢酶相比，其对1，3-丙二醇的米氏常数有了提高。
2.权利要求1的突变1，3-丙二醇脱氢酶，其米氏常数大约是野生型的3倍。
3.权利要求1的突变1，3-丙二醇脱氢酶，其对1，3-丙二醇的米氏常数大约是80mM。
4.权利要求1的突变1，3-丙二醇脱氢酶，其可从ATCC编号PTA-92的蟑螂埃希氏菌获得。
5.权利要求1的突变1，3-丙二醇脱氢酶，其具有相当于蟑螂埃希氏菌中如图3所示的105位残基从His到Leu的突变。
6.权利要求1的突变1，3-丙二醇脱氢酶，其包含如SEQ ID NO2所示序列的氨基酸。
7.编码具有如SEQ ID NO2所示序列的突变1，3-丙二醇脱氢酶的分离的核酸。
8.权利要求7的分离的核酸，其具有如SEQ ID NO1所示的序列。
9.表达载体，其包含权利要求7的分离的核酸。
10.宿主细胞，其包含权利要求9的表达载体。
11.权利要求10的宿主细胞，其包括柠檬酸杆菌属、肠杆菌属、梭菌属、克雷伯氏菌属、气杆菌属、乳杆菌属、曲霉属、酵母属、裂殖酵母属、接合酵母属、毕赤氏酵母属、克鲁维酵母属、假丝酵母属、汉森酵母属、德巴利酵母属、毛霉属、球拟酵母属、甲基细菌属、埃希氏杆菌属、沙门氏菌属、芽孢杆菌属、链霉菌属和假单胞菌属。
12.权利要求10的宿主细胞，其中所述突变1，3-丙二醇脱氢酶包含相当于蟑螂埃希氏菌中如图3所示105位残基从His到Leu的突变。
13.权利要求12的宿主细胞，其中所述的突变1，3-丙二醇脱氢酶具有SEQ ID NO2的氨基酸序列。
14.在微生物中生产1，3-丙二醇的方法，包括以下步骤I，得到含有和相应野生型PDD相比其对1，3-丙二醇的米氏常数有所提高的突变1，3-丙二醇脱氢酶(PDD)的微生物，该微生物含有至少一种能表达脱水酶活性的基因，和II，将该微生物和碳底物一起培养。
15.权利要求14的方法，其中所述突变1，3-丙二醇脱氢酶包含相当于蟑螂埃希氏菌中如图3所示的105位残基从His到Leu的突变。
16.权利要求15的方法，其中所述突变1，3-丙二醇脱氢酶包含如SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
17.权利要求14的方法，其中所述突变1，3-丙二醇脱氢酶可以从ATCC保藏号为PTA-92的蟑螂埃希氏菌获得。
18.权利要求14的方法，其中所述微生物包括柠檬酸杆菌属、肠杆菌属、梭菌属、克雷伯氏菌属、气杆菌属、乳杆菌属、曲霉属、酵母属、裂殖酵母属、接合酵母属、毕赤氏酵母属、克鲁维酵母属、假丝酵母属、汉森酵母属、德巴利酵母属、毛霉属、球拟酵母属、甲基细菌属、埃希氏杆菌属、沙门氏菌属、芽孢杆菌属、链霉菌属和假单胞菌属。
19.ATCC保藏号为PTA-92的分离的微生物。
全文摘要
本发明涉及突变1,3－丙二醇脱氢酶和能够在浓度至少为105克/升的1,3－丙二醇存在下生长的新型微生物,其中这个浓度对于野生型微生物来说通常是致死的。本发明也提供了包含突变1,3－丙二醇脱氢酶基因的表达载体和宿主细胞,以及生产1,3－丙二醇的方法,包括使用含有突变1,3－丙二醇脱氢酶的细胞。
文档编号C12N1/15GK1352688SQ00807743
公开日2002年6月5日 申请日期2000年5月16日 优先权日1999年5月19日
发明者D·E·特林伯, G·M·威蒂德, O·V·塞里弗诺瓦 申请人:金克克国际有限公司