专利名称：新型细胞色素p450单加氧酶及其在有机化合物的氧化方面的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及具有改良的底物特异性并能够氧化诸如N-杂环芳香化合物等有机底物的新型细胞色素P450单加氧酶、其核苷酸编码序列、含有这些序列的表达构建体和载体以及由其转化的微生物、诸如N-杂环芳香化合物等各种有机底物的微生物氧化方法，特别是靛蓝和靛玉红的制备方法。
利用对天然样品的筛选或对已知酶的蛋白质工程方法均可制备出具有新功能和新特性的酶。而在某些情况下，后一种方法更适于诱发一些用自然选择方法不大可能产生的特性。尽管在酶工程领域已进行了多次尝试，但迄今为止只有少数几项研究成功地提高了酶突变体对于某一底物的催化活性(1-10)。在这些已知的实例中，底物在结构上都与相应酶的天然底物密切相关。至今仍未见有关对酶进行成功改造而使其经修饰后可催化在结构上与其天然底物完全不同的化合物的反应的报道。
可由巨大芽孢杆菌分离的细胞色素P450单加氧酶通常能够催化长链饱和酸及其相应的酰胺类和醇类的近端羟基化反应或长链未饱和脂肪酸或中链饱和脂肪酸的环氧化反应(11-13)。饱和脂肪酸的最佳链长为14-16个碳原子。链长小于12的脂肪酸不被羟基化(11)。
利用X-射线结构分析方法已确定了P450 BM-3的血红素结构域的结构(14-16)。底物结合位点以长隧道状孔道形式存在，从分子表面延伸至血红素分子，其边界几乎完全由疏水性氨基酸残基构成。血红素结构域表面的带电残基只有Arg47和Tyr51残基。它们被认为参与了以氢键形式与底物的羰基基团的结合(14)。将Arg47突变成Glu可导致该酶对花生四烯酸失活(13)，但相比之下会提高其对C12-C14-烷三甲铵化合物的活性(17)。该酶以芳香化合物，特别是单环、二环或多环、甚至杂环芳香化合物、链烷、链烯、环烷烃和环烯烃，为底物的应用仍未见报道。因而专家们至今仍认为，除诸如吲哚等迄今所述的有机底物之外的底物由于与P450 BM-3的天然底物的明显结构差异，特别是由于缺乏能够与底物袋中的上述残基结合的功能基团，而不能作为一种底物。
本发明的目标是获得具有改进的底物特异性或底物总谱的新型细胞色素P450单加氧酶。特别是所提供的单加氧酶突变体与未突变的野生型酶相比，对结构明显不同的底物具有酶学活性。
与野生型酶相比，由本发明的突变体可获得“改进的底物总谱”。详细地说，在a)-d)组定义的至少一种可氧化化合物的转变反应中可观测到所述突变体的反应性有所改善，如比活(表示为被转变底物的nmol数/分钟/nmol P450酶)和/或选自Kcat、Km、Kcat/Km的至少一项动力学参数有所提高(例如至少1％，如10-1000％、10-500％或10-100％)。本发明的氧化反应包括至少一种外源性(即加到反应介质中的)或内源性(即已经存在于反应介质中的)有机底物由酶催化的加氧反应。详细地说，本发明的氧化反应包括脂肪族或芳香族C-H基团的单羟基化和/或多羟基化，如单羟基化和/或二羟基化，或C＝C基团，优选的为非芳香族C＝C基团，的环氧化。也可以是上述反应的组合。此外，直接反应产物还可以在不涉及酶作用的次反应或副反应环境中被进一步转化。这些酶作用与非酶作用的组合也同样构成本发明的主旨的一部分。
我们惊奇地发现，以上目标可借助于能够，例如，氧化N-杂环二环或多环芳香化合物的新型细胞色素P450单加氧酶来实现。
详细地说，本发明涉及那些通过定点诱变而使其底物结合区能够功能性摄取新型底物，如N-杂环型底物，的单加氧酶。
本发明的一项优选实施方案中的新型单加氧酶具有可溶性，即能够以非膜结合形式存在，并且在该形式下具有酶学活性。
优选地，本发明的单加氧酶衍生自源于细菌的细胞色素P450单加氧酶，特别是衍生自源于巨大芽孢杆菌的具有序列编号2所示氨基酸序列的细胞色素P450单加氧酶，并且在172-224(F/G环区)、39-43(β链1)、48-52(β链2)、67-70(β链3)、330-335(β链5)、352-356(β链8)、73-82(螺旋5)和86-88(螺旋6)之一的氨基酸序列区域内具有至少一种功能性突变，即促进新有机底物(特别是参考如下文定义的a)-d)组的化合物)的氧化，如N-杂环单环、二环或多环芳香化合物。
本发明提供的细胞色素P450单加氧酶突变体优选地能够实现以下至少一种反应a) 未取代的或取代的N-、O-或S-杂环单环、二环或多环芳香化合物的氧化；b) 未取代的或取代的单环或多环芳香化合物的氧化；c) 直链或支链烷烃和烯烃的氧化；以及d) 未取代的或取代的环烷烃和环烯烃的氧化。
优选的单加氧酶突变体至少在7 3-82、86-88和172-224之一的序列区域内具有至少一种功能性突变，特别是氨基酸置换。由此，举例来说，Phe87可被替换成一种带有脂肪族侧链的氨基酸，如Ala、Val、Leu，特别是Val；Leu188可被替换成一种带有酰胺侧链的氨基酸，如Asn或特别是Gln；而Ala74可被替换成另一种带有脂肪族侧链的氨基酸，如Val和特别是Gly。
此类型的特别优选的单加氧酶突变体是那些具有以下至少一种单氨基酸或多氨基酸置换的突变体1)Phe87Val；2)Phe87Val、Leu188Gln；或3)Phe87Val、Leu188Gln、Ala74Gly；及其功能等价物。数字表明突变的位置；原有氨基酸标于数字前，新引入的氨基酸标于数字后。
本文中的“功能等价物”或特别公开的突变体类似物是指不同的突变体，这些突变体至少相对于上文a)-d)所述氧化反应之一，即对例如杂环芳香化合物以及使，例如，吲哚羟基化的氧化反应，而言另具有特定的底物特异性，或是相对于野生型酶而言另显示出特定的“改进的底物总谱”。
根据本发明的意图，一些突变体也可被理解为“功能等价物”，这些突变体至少在上述序列位置之一具有除特别提到的氨基酸置换之外的另一种氨基酸置换，但该置换仍能够产生一种相对于野生型酶而言具有“改进的底物总谱”并能够催化上述至少一种氧化反应的与特别提到的突变体相似的突变体。功能等价还特别适用于对底物总谱作定性修改的情况，即，例如，转化相同的底物，但速率不同。
“功能等价物”自然也包括可通过衍生自其它生物体的P450酶的突变而获得的与特别提到的P450 BM3相似的P450单加氧酶突变体。举例来说，可通过序列比较来确定同源序列区的位置。然后根据本发明特别叙述的原则，由现代分子模拟方法实现可影响反应模式的等价突变。
“功能等价物”还包括可通过一个或多个额外的氨基酸添加、置换、缺失和/或倒位而获得的突变体，上述额外修饰可出现在任一序列位置，只要其能够产生一种具有上文所述意义上的改进的底物总谱的突变体。
根据本发明，可被氧化的a)组底物是未取代的或取代的杂环单环、二环或多环芳香化合物；特别是可被氧化或被羟基化的N-、O-或S-杂环单环、二环或多环芳香化合物。其优选地是2或3员，特别是2员，4-7员，特别是6或5员，构成的稠环，其中至少有1个环，优选的为所有环，具有芳香性，并且至少有1个芳香环中带有1-3个，优选的为1个，N-、O-或S-杂原子。整个环结构可另含有一种或两种相同的或不同的杂原子。芳香化合物的环碳原子或杂原子可另带有1-5个取代基。适当的取代基实例有C1--C4-烷基，如甲基、乙基、正-或异丙基、正-、异-或叔-丁基，或C2--C4-烯基，如乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基或3-丁烯基，羟基和卤素，如F、Cl和Br。所述烷基或烯基取代基还可带有一个酮基或醛基；例如丙烷-2-酮-3-基、丁烷-2-酮-4-基、3-丁烯-2-酮-4-基。详细地说，适当的杂环底物的非限定性实例有二环杂环，如吲哚、N-甲基-吲哚及其在碳原子上带有1-3个上述取代基的取代类似物，如5-氯-或5-溴-吲哚；还有喹啉和喹啉衍生物，如8-甲基喹啉、6-甲基-喹啉及喹哪啶；以及苯并噻吩及其在碳原子上带有1-3个上述取代基的取代类似物。此外还可包括三环杂芳化合物，如吖啶及其在碳原子上带有1-3个上述取代基的取代类似物。
根据本发明，可被氧化的b)组底物是未取代的或取代的单环或多环，特别是单环或二环，芳香化合物，如苯和萘。这些芳香化合物可以是未取代或单取代或多取代的，并且可以，例如，在环碳原子上带有1-5个取代基。适当的取代基实例有C1--C4-烷基，如甲基、乙基、正-或异丙基、或正-、异-或叔-丁基，或C2--C4-烯基，如乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基或3-丁烯基，羟基和卤素，如F、Cl和Br。所述烷基或烯基取代基还可带有一个酮基或醛基；例如丙烷-2-酮-3-基、丁烷-2-酮-4-基、3-丁烯-2-酮-4-基。该芳香化合物可与主干由4-7个原子构成的非芳香环融合。该非芳香环可带有1或2个C＝C双键，可被上述取代基单取代或多取代，并可带有1或2个杂环原子。特别适当的芳香化合物实例有单环芳香化合物，如异丙苯，以及二环底物，如茚和萘及其在碳原子上带有1-3个上述取代基的取代类似物。
根据本发明，可被氧化的c)组底物为带有4-15个，优选的为6-12个，碳原子的直链或支链烷烃或烯烃。可提到的实例有正-丁烷、正-戊烷、正-己烷、正-庚烷、正-辛烷、正-壬烷、正-癸烷、正-十一烷和正-十二烷，以及这些化合物的分支一次或一次以上的类似物，如带有1-3个甲基侧基的类似化合物；或上述烷烃的单未饱和或多未饱和类似物，如单未饱和类似物。
根据本发明，可被氧化的d)组底物是带有4-8个环碳原子的未取代的或取代的环烷烃和环烯烃。其实例有环戊烷，环戊烯，环己烷环己烯，环庚烷，环庚烯。环结构可带有一个或多个，如1-5个，在a)和b)组化合物中所定义的取代基。非限定性实例有紫罗酮，如α-、β-及γ-紫罗酮，以及相应的甲基紫罗酮和异甲基紫罗酮。特别优选的为α-和β-紫罗酮。
本发明还涉及本发明所述单加氧酶之一的核酸编码序列。优选的核酸序列来源于序列编号1并具有至少一个可导致上述功能性氨基酸突变之一的核苷酸置换。本发明还涉及由单个或多个核苷酸的添加、置换、插入和/或缺失而获得的核酸的功能性类似物，该类似物可进一步编码一种具有所需底物特异性，如吲哚氧化活性，的单加氧酶。
本发明还包括那些含有所谓沉寂突变，或与特别提到的序列相比根据特定来源或宿主生物的密码子选择加以修改的核酸序列，以及这些核酸序列的天然变异体。本发明还包括由遗传密码简并(即不导致相应氨基酸序列的任何改变)或保守核苷酸置换(即相应的氨基酸被置换成另一种电荷、大小、极性和/或溶解性相同的氨基酸)而获得的核酸序列变体，通过核苷酸添加、插入、倒位或缺失而改变的可编码本发明所述具有“改进的底物总谱”的单加氧酶的序列，以及相应的互补序列。
本发明还涉及含有本发明所述突变体的核酸编码序列并处于调节核酸序列的遗传调控之下的表达构建体；以及至少含有这些表达构建体之一的载体。
优选地，本发明的构建体在所述编码序列的5’上游含有一种启动子，在3’下游含有一种终止子，还可选择性地含有其它常用调节因子，并且均与编码序列有效连接。有效连接的含义应理解为，启动子、编码序列、终止子以及适当情况下的其它调节因子的顺序排列方式能够使各调节因子实现其在编码序列表达方面的预定功能。可有效连接的序列的实例有导向序列、或翻译增强子、增强子、多腺苷酸化信号等。其它调节因子包括可选标记、扩增信号、复制起始点等。
除人工调节序列外，真正的结构基因上游还可存在天然的调节序列。如果需要，可通过遗传修饰将这种天然调节作用关闭，并且可以增强或减弱基因的表达。但也可以将基因构建体作为单一因子加以构建，也就是在结构基因的上游不插入任何额外的调节信号，同时不去除天然的启动子及其调节作用。反之，也可将天然调节序列突变，使其不再具有调节作用，并提高或减弱基因的表达。在基因构建体中可存在一个或多个核酸序列拷贝。
适当的启动子实例有利于使用在革兰氏阴性菌中的cos、tac、trp、tet、trp-tet、lpp、lac、lpp-lac、lacIq、T7、T5、T3、gal、trc、ara、SP6、1-PR或1-PL启动子；革兰氏阳性启动子amy和SPO2、酵母启动子ADC1、MFa、Ac、P-60、CYC1、GAPDH或植物启动子CaMV/35S、SSU、OCS、lib4、usp、STLS1、B33、nos或泛素启动子或菜豆球蛋白启动子。特别优选的是使用可诱导型启动子，例如光诱导型及特别是温度诱导型启动子，如PrPl启动子。
原则上讲，带有调节序列的所有天然启动子均可使用。此外还可通过有利的方式使用合成启动子。
上述调节序列可用来实现核酸序列以及蛋白的特定表达。这意味着，例如，可根据宿主生物的不同而选择只在诱导后才使基因进行表达或超表达，或是立即表达和/或超表达。
优选地，调节序列或调节因子可对表达具有正面效果，并可通过此方式加强或减弱表达。因此，使用诸如启动子和/或“增强子”等强转录信号可在转录水平上有利地加强调节因子。此外，还可通过提高，例如，mRNA稳定性来加强翻译。
通过将适当启动子与适当单加氧酶核苷酸序列及一种终止子信号或多腺苷酸化信号相融合可产生一种表达盒。为此，可按照，例如，T.Maniatis，E.F.Fritsch and J.Sambrook，分子克隆实验手册，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY(1989)和T.J.Silhavy，M.L.Berman and L.W.Enquist，基因融合实验，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY(1984)以及Ausubel，F.M.et al.，最新分子生物学实验技术，GreenePublishing Assoc.and Wiley Interscience(1987)中的描述使用常规的重组及克隆技术。
为了在适当的宿主生物中表达，可将重组核酸构建体或基因构建体插入到有利于在宿主内实现最佳基因表达的宿主特异性载体中。载体已为该领域的技术人员所熟知，并且可在，例如，《克隆载体》(Pouwels P.H.et al.，Ed.，Elsevier，Amsterdam-New York-Oxford，1985)中查明。对载体含义的理解不应只限于质粒，而是包括为技术人员所了解的所有其它载体，举例来说，如噬菌体、病毒，如SV40、CMV、杆状病毒及腺病毒，转座子、IS因子、噬粒、粘粒以及线状或环状DNA。这些载体能够在宿主生物内自主复制或通过染色体复制。
本发明的载体可用来产生重组微生物，这些微生物被，例如，至少一种本发明的载体所转化并可用于突变体的产生。本发明的上述重组构建体可被有利地引入到适当的宿主系统中而加以表达。为了实现上述核酸在所述表达系统中的表达，优选的是采用技术人员所了解的常用克隆及转染方法。适当的系统在，例如，最新分子生物学实验技术，Ausubel，F.M.et al.，Hrsg.and Wiley Interscience(New York1997)中有所描述。
原则上讲，适当的宿主生物包括能够表达本发明的核酸、其等位变异体及其功能等价物或衍生物的所有生物。宿主生物的含义应被理解为包括，例如，细菌、真菌、酵母或植物或动物细胞。优选的生物为诸如埃希氏菌属的细菌，例如大肠杆菌、链霉菌、芽胞杆菌或假单胞菌、真核微生物如酿酒酵母、曲霉，以及来自动物或植物的更高等真核细胞，如Sf9或CHO细胞。
如果需要，还可在诸如转基因动物，如特别是小鼠、绵羊，或转基因植物等转基因生物中实现基因产物的表达。转基因生物也可以是通过，例如，突变或部分缺失或完全缺失而去除相应内源基因的基因敲除动物或植物。
利用亦包含于载体或表达盒中的标记基因可筛选成功转化的生物。此类标记基因的实例有抗生素抗性基因和能够使被转化细胞着色的颜色反应催化酶基因。然后可利用自动的细胞分拣器对这些转化细胞进行筛选。利用含有适当抗生素的培养基或底物可筛选被载体成功转化并带有适当抗生素(例如G418或潮霉素)抗性基因的微生物。也可通过亲和层析利用存在于细胞表面的标记蛋白来进行筛选。
宿主生物与诸如质粒、病毒或噬菌体，例如带有RNA聚合酶/启动子系统的质粒、噬菌体λ、噬菌体μ或其它温和噬菌体或转座子和/或其它有利的调节序列，等适用于该生物的载体的组合构成一种表达系统。术语“表达系统”是指，举例来说，诸如CHO细胞等哺乳动物细胞与诸如pcDNA3neo载体等适用于哺乳动物细胞的载体的组合。
如上文所述，基因产物也可在诸如小鼠、绵羊等转基因动物或转基因植物中有利地表达。也有可能用来自核酸的RNA来设计无细胞翻译系统。
本发明还提供一种方法，用于制备本发明的单加氧酶，该方法包括培养产单加氧酶的微生物，在适当情况下诱导单加氧酶的表达，以及由培养物分离单加氧酶。如果需要，对本发明的单加氧酶还可进行工业规模的生产。
微生物可利用已知方法进行培养和发酵。举例来说，细菌可在20-40℃及pH 6-9的条件下在TB或LB培养基中生长。适当的培养条件在诸如T.Maniatis，E.F.Fritsch and J.Sambrook，分子克隆实验手册，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY(1989)中有详细描述。
如果单加氧酶不被分泌到培养基中，则可将细胞裂解并利用已知的蛋白分离方法由裂解物获取单加氧酶。作为选择，也可利用高频超声、高压如弗氏细胞压碎器、渗透裂解、去污剂作用、裂解酶或有机溶剂、匀化或多种所述方法的组合将细胞裂解。单加氧酶的纯化可通过已知的层析方法来实现，如分子筛层析(凝胶过滤)，如Q-Sepharose层析、离子交换层析和疏水层析，以及诸如超滤、结晶、盐析、透析和天然凝胶电泳等其它常用方法。适当的方法在诸如Cooper，F.G.，Biochemische Arbeitsmethoden[生化方法]，Verlag Walter deGruyter，Berlin，New York或Scopes，R.，蛋白纯化，Springer Verlag，New York Heidelberg，Berlin中均有所描述。
使用在cDNA中另加有特定核苷酸序列从而可编码能够简化纯化方法的改良多肽或融合蛋白的载体系统或寡核苷酸特别有利于重组蛋白的分离。适当的此类修饰有，例如，可作为锚定物的所谓“标签”，如6-组氨酸锚定物修饰，或能够作为抗原被抗体识别的抗原决定簇(例如在Harlow，E.and Lane，D.，1988，抗体实验手册，Cold SpringHarbor(N.Y.)Press中有所描述)。这些锚定物可用来将蛋白连接到诸如多聚体基质等能够，例如，被填装在层析柱中的固体支持物或微量滴定板或其它支持物上。
同时，这些锚定物还可用于蛋白的识别。也可使用诸如荧光染料、酶标记物等能够在与底物反应后形成可检测反应产物的常规标记来识别蛋白，或单独使用放射性标记或与锚定物组合使用来衍生化蛋白。
本发明还涉及一种方法，用于诸如上文定义的N-杂环单环、二环或多环芳香化合物等有机化合物的微生物氧化，该方法包括a1) 在可被本发明所述单加氧酶氧化的外源(添加)底物或中间形成底物存在的情况下，在培养基中培养上文定义的重组微生物，优选的是在存在氧气(即有氧)的条件下进行；或a2) 将含有底物的反应介质与本发明的一种酶共保温，优选的是在存在氧气和电子供体的情况下进行；以及b) 由培养基中分离所形成的氧化产物或其副产物。
反应所需的氧气可由大气进入反应介质，如果需要，也可通过已知的方式直接添加氧气。
可氧化的底物优选地选自a) 未取代的或取代的N-杂环单环、二环或多环芳香化合物；b) 未取代的或取代的单环或多环芳香化合物；c) 直链或支链烷烃和烯烃；d) 未取代的或取代的环烷烃和环烯烃。
优选的工序变化可参考靛蓝/靛玉红的形成方法，其特征在于底物是中间形成的吲哚，并且由培养基内分离出通过氧化中间形成的羟基吲哚而产生的靛蓝和靛玉红。
如果利用重组微生物来实现本发明的氧化，则优选的微生物培养方法是，首先在存在氧气的情况下于培养温度约20-40℃、pH约6-9的条件下在复合培养基，如TB或LB培养基，中将微生物培养至达到足够的细胞密度。通常情况下并非必须添加外源吲哚，因为微生物可形成中间形式的吲哚。但若使用其它底物，则可能要添加外源的该底物。为了能更好地控制氧化反应，优选的是使用可诱导型启动子，特别是温度诱导型启动子。此时可温度提高至所需的诱导温度，如在PrPl启动子的情况下是42℃，并将其保持足够的时间，例如对表达单加氧酶活性而言为1-10或5-6小时，然后再将温度降低至约30-40℃。然后在存在氧气的情况下继续培养12小时-3天。特别是在吲哚氧化的情况下，可通过添加NaOH将pH提高至，例如，9-10，由此可通过酶催氧化产物2-羟基吲哚及3-羟基吲哚的空气氧化来进一步促进靛蓝或靛玉红的形成。
以下反应图式说明本发明的靛蓝/靛玉红形成 但若利用纯化的或浓缩的酶突变体来实现本发明的氧化，则可将本发明的酶溶解在含有外源底物，如吲哚，的介质中(浓度约0.01-10mM或0.05-5mM)并使其发生反应，优选的是在存在氧气的情况下发生反应，反应条件为温度约10-50℃，例如30-40℃，pH约6-9(举例来说，可使用，例如，100-200mM的磷酸缓冲液或Tris缓冲液来确定)并且存在还原剂，相对于要被氧化的底物而言，含有底物的介质中另含有摩尔数约1-100或10-100倍过量的等效还原剂。优选的还原剂为NADPH。如果需要，也可分步添加还原剂。
在类似的方式下，优选使用的可氧化底物有正-己烷、正-辛烷、正-癸烷、正-十二烷、异丙苯、1-甲基吲哚、5-Cl-或Br-吲哚、茚、苯并噻吩、α-、β-及γ-紫罗酮、吖啶、萘、6-甲基或8-甲基喹啉、喹啉以及喹哪啶。
本发明的酶催氧化反应可在，例如，以下条件下进行底物浓度 0.01-20mM酶浓度0.1-10mg/ml反应温度 10-50℃pH6-8缓冲液0.05-0.2M磷酸钾缓冲液或Tris/HCl缓冲液电子供体 优选的为分步添加方式(起始浓度约0.1-2mg/ml)在通过，例如，添加电子供体(如NADPH)使反应开始前，可将混合物简短地(1-5分钟)预保温(约20-40℃)。反应在有氧条件下进行，也可在适当情况下额外引入氧气。
本发明的底物氧化方法可通过酶将存在于或添加到反应介质中的氧还原分解。通过添加还原剂(电子供体)可提供所需的等效还原剂。
然后可利用常规方法，如提取或层析方法，由介质中分离并纯化所形成的氧化产物。
本发明的主题还涉及生物反应器，该生物反应器含有固定化形式的本发明所述酶或本发明所述重组微生物。
最后，本发明的主题涉及本发明所述细胞色素P450单加氧酶或本发明所述载体或微生物在选自a)-d)组的底物，特别是N-杂环单环、二环或多环芳香化合物，的微生物氧化方面的应用，优选的则是在靛蓝和/或靛玉红的制备方面的应用。
以下实施例作为参考用于本发明的更详细描述。
酶的制备性生产可由300ml细胞培养物(OD578nm＝0.8-1.0)开始。至于酶的分离，可将细胞4000rpm离心10分钟，然后重悬于pH7.4的0.1M KxPO4缓冲液。利用Branson超声波仪W25(Dietzenbach，Germany)将冰冷的细胞小心地破碎，能量输出为80W，超声3次，每次2分钟。悬浮液于32570×g离心20分钟。粗提物可用于活性测定或酶的纯化。酶的纯化在(21)中已有所描述，在此特别引入作为参考。纯化酶的浓度根据450nm与490nm下的消光差值来确定，该方法在(11)中已有所描述，消光系数ε的值为91mM-1cm-1。
用水清洗细胞并在500g下反复离心，然后将形成的蓝色沉淀用四氢呋喃(THF)抽提。将抽提物蒸发至几乎干燥，再用50ml无水乙醇数次抽提红色颜料。将剩余的蓝色固体溶解在THF中，并利用薄层层析(TLC)进行分析。将乙醇溶液蒸发并通过硅胶层析(TLC 60，Merck，Darmstadt，Germany；2cm×30cm)加以纯化，然后用比率为1∶2的THF与石油醚进行清洗。将获得的红色溶液蒸发并利用TLC测定其纯度。利用Ultraspec 3000分光光度计(Pharmacia，Uppsala，Sweden)在400-800nm范围内测定蓝色及红色颜料的吸收光谱。再利用质谱和1H-NMR对蓝颜色和红颜色进行分析。实验结果1.通过P450 BM-3诱变提高蓝色颜料的生产率天然P450 BM-3不能产生含靛蓝的蓝色颜料或前体物质2-或3-羟基吲哚。为了能制备出足够的蓝色颜料，将P450 BM-3进行受控方式的演变。将所有可产生蓝色颜料的突变体测序。发现至少有以下3个位点之一被突变Phe87、Leu188和Ala74。以此可认为这3个位点对P450 BM-3产生蓝色颜料的活性至关重要。通过与十六烯酸复合的细胞色素P450 BM-3血红素结构域的结构可看出，Phe87会阻止底物更接近血红素基团(14)。Phe87Val突变体在对(14S，15R)-花生四烯酸的环氧化作用中显示出很高的区域选择性和立体专一性(13)，而Phe87Ala突变体可将ω-1、ω-2和ω-3的羟基化位置移至ω处(22)。因此，位置87被选定为PCR定点随机诱变的第一个位置。在管培养物中获得了7个可在诱导后产生少量蓝色颜料的菌落。选择可产生最大量蓝色颜料的菌落进行DNA测序。测序结果显示Phe87被Val替代。然后以Phe87Val突变体为模板在Leu188位置进行第二轮定点随机诱变。与十六烯酸复合的血红素结构域的结构显示，F螺旋和G螺旋的位置变化会使Leu188残基与底物直接接触(14)。因此，该位置在底物的结合或定向过程中具有重要的作用。在第二次筛选后获得了31个可产生蓝色颜料的菌落。可产生最大量颜料的突变体则含有Phe87Val及Leu188Gln置换。然后将该突变体对Ala74位置进行第三次定点随机诱变。此时获得的三重突变体F87L188A74(Phe87Val、Leu188Gln和Ala74Gly)可在含有300ml TB培养基的2升三角瓶中产生数毫克的蓝色颜料。这一产量足以对蓝色颜料进行分离和定性。2.蓝色颜料的分离与鉴定清洗细胞之后，用THF抽提剩余的蓝色沉淀，并通过TLC进行分析。蓝色颜料被分离成迁移迅速的蓝色组分和迁移较慢的红色组分。这两种组分与商品化靛蓝样品的组分具有完全相同的迁移率参数。
在DMSO中测定纯化后的两种组分的吸收光谱。蓝色组分显示出与商品化靛蓝样品相同的光谱。利用质谱测定法对纯化的蓝色及红色组分进行分析。两种颜料的质谱均在m/e＝262位置显示出一个很强的分子离子峰，并在m/e＝234及205位置显示出两个碎片峰(两个峰的相对强度均为10％)。该模式是靛蓝类化合物的典型模式。利用高分辨率质谱法确定这些离子的元素组成为C16H10N2O2、C15H10N2O和C14H9N2。这也是靛蓝类的特有结构。因此，蓝色颜料被鉴定为靛蓝，而红色颜料被鉴定为靛玉红。为了对结构进行证实，在DMSO-D6溶液中对两种颜料进行了500MHz1H-NMR谱测定。其结果与文献资料相符(23)。3.利用分离的酶产生靛蓝已知靛蓝可通过微生物转化由吲哚获得(24-26)。但这些微生物系统均不包含P450单加氧酶。根据本发明，首先测定纯酶对吲哚的催化活性。将F87L188A74突变体与吲哚相混合。未观察到任何颜色反应。只有在反应混合物中加入NADPH约20分钟后才形成蓝色颜料。在添加NADPH 30秒后，通过将反应混合物的pH值调整到约11，可在数秒钟内即观测到蓝颜色。使用天然P450 BM-3的对照实验始终为阴性反应，甚至提高酶、吲哚和NADPH的浓度也是如此。用乙酸乙酯抽提蓝色颜料，并利用TLC进行分析。蓝色颜料再次被分离成迁移迅速的蓝色组分和迁移较慢的红色组分。其Rf值和吸收光谱与提自发酵肉汤的提取物的值完全相同。因此，P450 BM-3的F87L188A74突变体是一种吲哚羟化酶。
根据前人的描述，已有两条途径可经酶的作用将吲哚转化成靛蓝。一个是双加氧酶催化，另一个是苯乙烯单加氧酶催化(24，25)。NADPH在这两种情况下的化学当量均为2。因此可认为，与双加氧酶相比，本发明的F87L188A74突变体能够只在一个位置使吲哚羟基化，从而可形成羟吲哚(2-羟基吲哚)或吲哚酚(3-羟基吲哚)。4.吲哚羟基化作用的动力学参数吲哚羟基化作用的动力学参数测定使用了野生型P450 BM-3酶纯样品和Leu188Gln、Phe87Val、F87L188及F87L188A74突变体纯样品。结果概述于下表1中。表1P450 BM-3突变体的吲哚羟基化动力学参数突变体Kcat(S-1)Km(mM) Kcat/Km(M-1s-1)WT-a)--Leu188Gln n.d.b)n.d. n.d.
Phe87Val 2.03(0.14) 17.0(1.0)119F87L188 2.28(0.16) 4.2(0.4) 543F87L188A742.73(0.16) 2.0(0.2) 1365a)未观测到活性；b)未测定(活性过低，无法测量)甚至使用过量的纯化酶和高浓度的吲哚，野生型酶也无法氧化吲哚。Leu188Gln突变体显示出很低的活性。Phe87Val突变体对吲哚羟基化的催化活性为119M-1s-1。F87L188双突变体(Phe87Val、Leu188Gln)的催化效率提高到543M-1s-1，而引入另一置换Ala74Gly后则提高到1365M-1s-1。三重突变体与Phe87Val相比，Kcat值共提高了35％，而Km值降低了约7倍。这表明Ala74Gly和Leu188Gln主要参与了底物的结合。对三重突变体F87L188A74而言，其吲哚转换率(Kcat＝2.73s-1)比大多数P450酶都高出10倍以上(18)。
选定的底物为正-辛烷。正-辛烷的羟基化使用以下有氧反应混合物P450 BM-3突变体17.5mg(冻干剂)反应缓冲液 9.1ml(磷酸钾缓冲液50mM，pH7.5)底物50μl的60mM溶液(溶于丙酮)温度25℃将酶冻干剂溶解于500μl反应缓冲液，并在开始时与底物和反应缓冲液室温保温5分钟。然后加入300μl DADPH溶液(5mg/ml)。再重复两次添加NADPH。通过测量340nm下的吸收来监控反应的进度，这样可观测到NADPH的下降。将NADPH以300μl为一组分步添加，因为反应溶液中过高的NADPH浓度会导致酶的失活。然后用5ml乙醚将反应溶液抽提3次以分离产物。合并有机相，用MgSO4干燥并浓缩。然后利用DC、GC/MS和NMR对产物进行定性。
对反应混合物的GC/MS分析获得了以下结果
1)温度设置40℃ 1分钟等温/3℃/分钟95℃/10℃/分钟275℃；仪器Finnigan MAT 95；GCHP 5890 Series II Split Injector；柱HP-5MS(甲基硅氧烷)30m×0.25mm；载气0.065ml He/分钟未发现有原材料。
萘反应的分析方法GC仪器Carlo Erba Strumentazion Typ HRGC 4160 on ColumnInjector；柱DB5 30m×0.2mm；材料5％联苯-95％二甲聚硅氧烷；载气0.5bar H2；温度设置40℃1分钟等温/10℃/分钟直至300℃Rt(1-萘酚)＝16.68NMR利用1H NMR鉴定出1-萘酚和顺-1，2-二羟基-1，2-二氢化萘。b) 重复实施例6，但底物不是正-辛烷，而是8-甲基喹啉。主要产物被鉴定为5-羟基-8-甲基喹啉，此外还有其它一些衍生物(产物比率5∶1)。35％的所用原材料被转化。c) 重复实施例6，但底物不是正-辛烷，而是α-紫罗酮。主要产物被鉴定为3-羟基-α-紫罗酮，此外还有其它一些衍生物(产物比率76∶24)。60％的所用原材料被转化。d) 重复实施例6，但底物不是正-辛烷，而是异丙苯(异丙基苯)。
共鉴定出5种单羟基化产物和1种二羟基化产物。70％的所用原材料被转化。
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1.一种细胞色素P450单加氧酶，该酶能够实现以下至少一种反应a) 未取代的或取代的N-、O-或S-杂环单环、二环或多环芳香化合物的氧化；b) 未取代的或取代的单环或多环芳香化合物的氧化；c) 直链或支链烷烃和烯烃的氧化；以及d) 未取代的或取代的环烷烃和环烯烃的氧化。
2.权利要求1的一种单加氧酶，该酶衍生自源于细菌的细胞色素P450单加氧酶。
3.权利要求2的一种单加氧酶，该酶衍生自源于巨大芽孢杆菌的具有序列编号2所示氨基酸序列的细胞色素P450单加氧酶BM-3，该酶至少在172-224、39-43、48-52、67-70、330-335、352-356、73-82和86-88之一的氨基酸序列区域内具有至少一种功能性突变。
4.权利要求3的一种单加氧酶，该酶至少在73-82、86-88和172-224之一的序列区域内具有至少一种功能性突变。
5.权利要求4的一种单加氧酶，该酶具有以下的至少一种单氨基酸或多氨基酸置换a)Phe87Val；b)Phe87Val、Leu188Gln；或c)Phe87Val、Leu188Gln、Ala74Gly；及其功能等价物。
6.编码上述权利要求之一的单加氧酶的一种核酸序列。
7.一种表达构建体，该构建体含有处于调节核酸序列的遗传调控之下的一种编码序列，该序列含有权利要求6的核酸序列。
8.一种载体，该载体至少含有权利要求7的表达构建体。
9.一种至少由权利要求8的载体转化的重组微生物。
10.权利要求9的一种微生物，该微生物选自埃希氏菌属的细菌。
11.一种方法，用于如权利要求1所定义的化合物的微生物氧化，该方法包括a1) 在存在外源底物或中间形成底物(intermedir gebildetenSubstrats)的情况下于培养基中培养权利要求9或10要求的重组微生物；或a2) 将含有底物的反应介质与权利要求1-5之一所要求的酶共保温；以及b) 由介质中分离所形成的氧化产物或其副产物。
12.权利要求11的方法，其中的外源底物或中间形成底物选自a) 未取代的或取代的N-、O-或S-杂环单环、二环或多环芳香化合物；b) 未取代的或取代的单环或多环芳香化合物；c) 直链或支链烷烃和烯烃；d) 未取代的或取代的环烷烃和环烯烃。
13.权利要求12的方法，其中的底物为中间形成的吲哚，并且由培养基中分离出通过氧化中间形成的吲哚而产生的靛蓝和靛玉红。
14.权利要求13的方法，其中吲哚氧化的实现方法是在氧气存在的情况下于培养温度约20-40℃且pH约6-9的条件下培养微生物。
15.权利要求11的方法，其中至少有一种选自上述a)-d)化合物组所定义的化合物作为外源底物被添加到介质中，并且氧化的实现方法是在氧气存在的情况下于培养温度约20-40℃且pH约6-9的条件下通过酶的作用将含有底物的介质转化，其中含有底物的介质另含有基于底物，约1-100或10-100倍摩尔数过量的等效还原剂。
16.权利要求15的方法，其中使用的外源底物选自吲哚、正-己烷、正-辛烷、正-癸烷、正-十二烷、异丙苯、1-甲基吲哚、5-Cl-或Br-吲哚、茚、苯并噻吩、α-、β-及γ-紫罗酮、吖啶、萘、6-甲基或8-甲基喹啉、喹啉以及喹哪啶(Chinaldin)。
17.一种生物反应器，该生物反应器含有固定化形式的 1-5之一的一种酶或权利要求9或10之一的一种重组微生物。
18.权利要求1-5之一的一种细胞色素P450单加氧酶或权利要求8的一种载体或权利要求9或10之一的一种微生物在a) 未取代的或取代的N-、O-或S-杂环单环、二环或多环芳香化合物；b) 未取代的或取代的单环或多环芳香化合物；c) 直链或支链烷烃和烯烃；和/或d) 未取代的或取代的环烷烃和环烯烃的微生物氧化方面的应用。
19.权利要求18的在靛蓝和/或靛玉红的制备方面的应用。
全文摘要
本发明涉及具有改良的底物特异性的新型细胞色素P450单加氧酶、其核酸编码序列、含有这些序列的表达构建体和载体,由其转化的微生物、对各种有机底物的微生物氧化方法,举例来说,如靛蓝和靛玉红的制备方法。
文档编号C12N1/21GK1365393SQ00810918
公开日2002年8月21日 申请日期2000年7月27日 优先权日1999年7月27日
发明者B·豪尔, J·普莱斯, U·施瓦尼贝格, J·施密特, M·菲舍尔, R·施密德, Q·S·李, S·卢茨－瓦尔, D·阿佩尔 申请人:Basf公司