专利名称：转乙型肝炎表面抗原(HBsAg)基因盐藻的制备方法
(一)发明领域本发明涉及采用基因工程技术，制备转乙型肝炎表面抗原(HBsAg)基因盐藻的方法。
(二)发明背景乙型肝炎病毒感染是一种严重危害人类健康的传染病，慢性乙型肝炎容易发展为肝硬化和肝癌。乙型肝炎感染率很高，据估计全世界约有3.5亿人为乙型肝炎病毒慢性携带者。我国是乙型肝炎的高感染区，乙型肝炎病毒感染率为57.68％，乙型肝炎病毒慢性携带率为9.75％。控制乙型肝炎传染的主要手段是接种疫苗。目前临床上使用的疫苗主要由啤酒酵母表达的乙型肝炎表面抗原主蛋白颗粒组成，效果良好，对控制乙型肝炎传播起到了巨大作用。但这种疫苗有一些不足之处。部分人群对疫苗存在不反应或低反应性，疫苗接种后可能产生逃逸突变。且疫苗价格高，难于在贫穷的发展中国家普遍推广。因此开发效果好、使用方便而且价廉的疫苗，对于全球范围内控制乙型肝炎病毒传播具有重要意义。
众所周知，植物作为生产药用蛋白的生物反应器，为人类提供了一个更加安全和廉价的生产系统。与微生物发酵和转基因动物等生产系统比较，它具有许多优点1、一些微生物系统不能对真核生物蛋白进行准确的翻译后加工和蛋白糖基化；大肠杆菌发酵过程常常产生一些不溶性聚合物，而将这些聚合物重新溶解并折叠成天然蛋白质，难度极大；此外发酵常需要庞大的设备投资。2、动物细胞培育所需费用昂贵，用转基因动物生产重组蛋白，可能会污染动物病毒，这对人类可能造成潜在威胁。植物病毒不会感染人类，故用转基因植物生产重组蛋白更为安全。3、植物细胞培养不需要昂贵培养基和复杂的纯化系统，也不需要严格无菌的生产条件和冷藏保存。
盐藻(Dunaliella salina)，属绿藻门团藻目多睫毛藻科。为单细胞真核生物，个体呈梨形或椭圆形，细胞体积50-1000μm3。具有2条长鞭毛，可自由游动。盐藻细胞与其它一些单细胞真核藻类最大的不同点是它缺乏细胞壁，细胞外仅包被一薄层弹性浆膜。藻体内有一杯状叶绿体，内含一个造粉核。藻体前端有一红色眼点。其繁殖主要靠细胞纵裂的无性繁殖，有性生殖为同配接合。盐藻是目前所知耐盐性最强的单细胞真核生物，生长在海水或咸水湖等高盐环境下。由于无细胞壁，可通过快速的细胞体积变化来适应细胞外渗透压的变化，因此对环境适应性极强，可在低浓度(0.2％)和接近饱和的高浓度(35％)盐水中生长。盐藻具有很强的光合作用能力，能利用水和空气中的二氧化碳在阳光照射下合成蛋白质等多种有机物，因此盐藻的养殖容易，成本低廉。
发明内容
本发明的目的正是针对上述现有技术中所存在的问题而旨在研制一种转乙型肝炎表面抗原(HBsAg)基因盐藻的制备方法。将重组人HBsAg基因，通过目前国际上公认较为成熟的遗传转化技术(电激法，基因枪法等)导入盐藻细胞中，使其表达，建立盐藻生物反应器，用来制备或生产人口服型乙型肝炎疫苗。
本发明的目的是通过以下方式来实现的本发明的转HBsAg基因盐藻的制备方法，是将编码重组HBsAg蛋白的DNA序列和含有特定的筛选标记基因，利用转基因技术，将它们导入盐藻，通过继代选择培养，建立转HBsAg基因盐藻藻株，供制备乙型肝炎口服疫苗使用。
该方法包括编码重组HBsAg蛋白基因的CtxB-SS1融合基因的构建和盐藻表达载体构建。重组乙型肝炎表面抗原(HBsAg)蛋白基因包括乙型肝炎病毒S基因、PreS1基因和PreS2基因的全部或部分序列及其组合。SS1基因是指S基因和PreS1基因部分序列的融合；CtxB-SS1融合基因是指霍乱毒素B亚单位基因(CtxB)和SS1基因的融合。该CtxB-SS1融合基因的构建是将CtxB-SS1融合基因序列插入到盐藻Hsp70B5’启动子和T-Nos终止子之间，构成完整的表达盒，使CtxB-SS1融合基因在Hsp70B5’启动子控制下转录。
高效转化与稳定表达的依据(1).盐藻核基质结合序列[Chromatin matrix(Scaffold)attachment region[(MAR or SAR)]指导下的同源交换重组。MAR是染色体中的中、高度重复序列，并且处于转录活跃区。将目的基因插入MAR序列之中，可以提高基因转化的效率；MAR序列位于转录活跃区，整合于该位点的目的基因可以稳定、高效表达。(2).诱导型高效启动子热激蛋白启动子为诱导型启动子，可以提高目的基因的表达效率，可以经济、有效的获得表达产物。(3).高效终止子胭脂碱合成酶基因终止子(T-Nos)。
表达载体构建中含有两个同向的核基质结合序列(Matrix attachmentregion，MAR)MAR1和MAR2，而在MAR1和MAR2间插入Nit15’-Nit1-T-Nos表达盒，能表达盐藻硝酸盐还原酶，供筛选转化藻用。
硝酸还原酶基因作为选择标记理由是，硝酸盐是真核绿藻杜氏盐藻培养中最常使用的氮源。Milk和Grant等人认为NaNO3对于盐藻是最好的氮源。因此，以硝酸还原酶基因作为转基因硝酸盐还原缺陷型盐藻的基因选择标记是最理想的。在硝酸盐作为唯一氮源的情况下，硝酸盐既是其必需的营养元素，又是其选择剂，具有双重作用。同时以硝酸盐作为唯一N源和选择剂，还解决了以抗生素、除草剂作为选择剂成本高及环境(土壤、水质、作物等)污染等问题。
该盐藻表达载体，同时加入了除草剂(PPT)抗性基因-Bar基因作为辅助或第二选择标记，保证工程盐藻的纯度和质量。工程盐藻在开放环境中生产，自然界中的杂藻污染，以及自然环境(土壤、水体等)亚硝酸盐的污染，可能会使培养的工程盐藻纯度降低。为保证工程盐藻的纯度，在生产中可建立工程盐藻“种子培养池”。培养工程盐藻时，可加入硝酸盐和PPT双重选择剂。这种“种子”培养池规模很小，可控制，培养液可反复处理使用。从而保证工程盐藻的纯度，又可避免污染环境。
此外，该载体加入蓝、白斑选择标记LacZ基因及多克隆位点MCS，可使目的基因在载体中的克隆、选择和鉴定更为容易、方便。该载体以NPT II(Kanr)作为在E.coli中的选择标记；pUC18中的ColE1复制子，使其作为高拷贝质粒，便于基因操作和使用。
在本发明中，通过转基因技术中的遗传转化生物学方法，将重组HBsAg外源目的基因导入盐藻细胞并得到表达，以获得转基因盐藻藻株。常用物理和化学方法包括聚乙二醇(PEG)处理法、电激法和基因枪法等。
本发明以转基因盐藻生产人口服型乙型肝炎疫苗，与现有的转基因可食性植物如马铃薯、莴苣等比较，具有以下优点1、盐藻为单细胞真核生物，无细胞壁，易于遗传操作，基因工程下游产品工艺简便。2、单细胞盐藻生长快，无季节性限制。3、培养条件简单，生产成本低，易于工业化生产。4、盐藻细胞本身无毒性，而且富含多种对人体有益的维生素、多不饱和脂肪酸等营养成分。
本发明主要包括四方面技术1、盐藻培养技术。2、盐藻表达载体构建，3、将外源基因导入盐藻的技术。4、转基因盐藻转化子的筛选。
图1重组HBsAg盐藻表达质粒pCAMBIA-CtxB-SS1的构建图2盐藻表达载体pCAMBIA-DS1664图3重组HbsAg盐藻表达质粒pCAMBIA-CtxB-SS具体实施例方式本发明结合以下实施例做进一步描述，但并不限制本发明。
实施例一、盐藻培养技术1、液体培养藻种接种于Mclachlan培养液，培养条件如下温度25±2℃，光照强度3000lux，每天光照培养14小时，黑暗培养10小时。
2、固体培养Mclachlan培养液中加入琼脂浓度为0.5-0.8％，于超净台用消毒白金耳从液体培养液取藻种立即接种到固体培养基面上，置恒温箱内培养，恒温箱中需配置荧光管照射，按液体培养条件要求进行培养。
二、HBsAg盐藻表达质粒pCAMBIA-CtxB-SS1的构建1.重组乙肝表面抗原SS1融合基因的构建质粒pBS-SK-HBS上克隆有乙肝病毒S基因、Pre-S2基因和Pre-S1基因序列，设计四条引物引物15’-GCAGTCGACCCAATG GAGAGCAC-3’；Sal I引物25’-GCGGGTACCAGG AATGTATACCC-3’；Kpn I引物35’-CTGGGTACCCCA AATCCTCTGGG-3’；Kpn I引物45’-GCGGCATGCTTA GTTGGGGTTG-3’；Sph I分别以引物1和2扩增SHBsAg(1-226aa)，以引物3和4扩增PreS1 Ag(20-48aa)DNA片段，经酶切、回收后连接到质粒pUC18的Sal I/Sph I位点，构建成编码重组乙肝表面抗原SS1[包括SHBsAg(1-226aa)和PreS1 Ag(20-48aa)]的融合基因片段，质粒命名为pUC18-SS1。
2.CtxB-SS1融合基因的构建(1)根据文献报道的霍乱毒素B亚单位基因(CtxB)序列，设计两条引物正向引物5’-GCGGGATCCATG ATTAAATTAAAATTTGG-3’BamH I反向引物5’-GCGGTCGACAGG ATTTGCCATACTAATTGC-3’Sal I以古典霍乱小川型疫苗菌CVC 0139基因组DNA为模板，PCR扩增CtxB基因序列约380bp，经BamH I/Sal I酶切后克隆到质粒pUC18上，构建成质粒pUC18-CtxB。
(2)以Sal I/Sph I双酶切割质粒pUC18-SS1，切下SS1融合基因片段约770bp，连接入质粒pUC18-CtxB的Sal I/Sph I位点，构成含CtxB基因和SS1基因片断的融合基因质粒pUC18-CtxB-SS1。
3、Hsp70B5’-CtxB-SS1-T-Nos表达盒的构建质粒pSP72-Hsp-Nos中克隆有盐藻(D.Salina UTEX1664)热休克蛋白Hsp70B5’启动子和T-Nos终止子。用BamH I/Sph I双酶切割质粒pSP72-Hsp-Nos和pUC18-CtxB-SS1，将CtxB-SS1融合基因序列连接到Hsp70B5’启动子和T-Nos终止子之间，构成完整的表达盒，使CtxB-SS1融合基因在Hsp70B5’启动子控制下转录。
4、盐藻表达质粒pCAMBIA-CtxB-SS1的构建盐藻表达载体pCAMBIA-DS1664中含有两个同向的核基质结合系列(MAR1和MAR2，在MAR1与MAR2序列间顺序连接有Nit5’-Nit1-T-Nos表达盒(可表达盐藻硝酸盐还原酶，用于转化藻的筛选)、多克隆位点MCS(来源于pUC18)和Nit5’-BAR-T-Nos表达盒(可表达PPt抗性，用于转化藻的辅助筛选)，将构建完整的Hsp70B5’-CtxB-SS1-T-Nos表达盒用EcoR I/Xho I切下后，连入载体pCAMBIA-DS1664的EcoR I/Sal I位点，构建成表达质粒pCAMBIA-CTP-SS1，该质粒可由MAR1和MAR2序列介导同源重组，使Nit1表达盒和CtxB-SS1表达盒及BAR表达盒整合于盐藻染色体活跃转录区，经PPt抗性筛选和硝酸盐选择培养筛选鉴定转化藻，转化藻可经由温度诱导高效表达CtxB和SS1的融合蛋白。
三、将外源目的基因导入盐藻1、用电激法将外源目的基因导入盐藻取培养第5天的盐藻培养液，1000rpm离心15min，弃上清，用含有0.2M甘露醇和0.2M山梨醇液处理后加入电激缓冲液，调整盐藻密度在108个/mm3。继之加入终浓度为10μg/ml的含外源基因的质粒及25μg/ml的鲑精DNA，混匀后，置冰上5-10min，吸取0.5ml置于轰击小室中待用。电激仪(Backon 2000型)电激时电压为9.5KV，每次电激时间为0.05μs，次数为210，循环次数100次，电激高度2mm，每次电激间隔时间为62.5sec。
2、用基因枪法将外源目的基因导入盐藻取培养第5天的盐藻培养液，1000rpm离心15min，弃上清，用盐藻培养液将盐藻密度调整在108个/mm3，再取0.5ml盐藻培养液铺于含抗生素的固体培养基中央，直径为3cm的圆形有效轰击范围内，置超净台下吹干待用。
在无菌条件下，用基因枪(Bio-Rad公司产的PDS-1000型)轰击。具体步骤如下取50μl(60μg/ml)金粉悬浮液加入6μg含有外源基因的质粒以及50μl 2.5M Cacl2和20μl 0.1M亚精胺，振荡3min，12000rpm离心10sec，弃上清。用无水乙醇洗一次，振荡，12000rpm离心，弃上清，共二次。最后将附有金粉的质粒悬浮于60μl无水乙醇中。每次轰击取6-8μl，每皿轰击3次，轰击后将培养皿放入盐藻适宜培养条件下培养。
3、用PEG法将外源目的基因导入盐藻取0.5ml盐藻培养液(细胞密度107-108个/ml)，在超净台内接种于含抗生素的固体培养基上，直径为3cm，吹干待用。
构建携带外源目的基因的农杆菌Ti质粒和盐藻细胞原生质体。尔后将新制备的原生质体悬浮液与Ti质粒DNA一起保温培养，同时加入分子量4000-6000的PEG，在pH8-9下促进原生质体摄取DNA，从而使细胞转化，为促进转化，在转化培养时加入运载DNA(小牛胸腺DNA)，培养后离心收集原生质体，并重新悬浮到原生质体培养基中继续培养。
四、转基因盐藻转化子的筛选取电激法或基因枪法转化的盐藻细胞团，用1ml培养液A(5mM NH4Cl、5mMNaNO2)洗下，3001ux弱光培养2-3天，转入含3μg/ml PPt的培养液A中继续培养5-7天，光照周期为12小时/天，光强为1600lux；之后转入培养液B(10mM NaNO3)中继续光照培养7-10天。继之涂布于培养液B平板上(1.0％琼脂)光照培养10-15天至转化藻落出现。
权利要求
1.一种转乙型肝炎表面抗原(HBsAg)基因盐藻的制备方法，其特征在于编码重组HBsAg蛋白的DNA序列和含有特定的筛选标记基因，利用转基因技术，将它们导入盐藻，通过继代选择培养，建立转HBsAg基因盐藻藻株，供制备乙型肝炎口服疫苗使用。
2.根据权利要求1所述的转乙型肝炎表面抗原(HBsAg)基因盐藻的制备方法，其特征在于编码重组HBsAg蛋白基因的CtxB-SS1融合基因的构建和盐藻表达载体pCAMBIA-CtxB-SS1的构建。
3.根据权利要求2所述的转乙型肝炎表面抗原(HBsAg)基因盐藻的制备方法，其特征在于重组乙型肝炎表面抗原(HBsAg)蛋白基因包括乙型肝炎病毒S基因、PreS1基因和PreS2基因的全部或部分序列及其组合。SS1基因是指S基因和PreS1基因部分序列的融合；CtxB-SS1融合基因是指霍乱毒素B亚单位基因(CtxB)和SS1基因的融合。
4.根据权利要求2所述的转乙型肝炎表面抗原(HBsAg)基因盐藻的制备方法，其特征在于将CtxB-SS1融合基因序列插入到盐藻Hsp70B5’启动子和T-Nos终止子之间，构成完整的表达盒，使CtxB-SS1融合基因在盐藻Hsp70B5’启动子控制下转录。
5.根据权利要求2所述的转乙型肝炎表面抗原(HBsAg)基因盐藻的制备方法，其特征在于表达载体中含有两个同向的核基质结合序列(Matrixattachment region，MAR)MAR1和MAR2，在MAR1和MAR2间插入能表达硝酸盐还原酶的Nit15’-Nit1-T-Nos表达盒，供筛选转化藻用。
全文摘要
本发明涉及一种转乙型肝炎表面抗原(HBsAg)基因盐藻的制备方法，即将外源基因HBsAg重组到真核单细胞盐藻细胞中，从而利用获得的转基因盐藻，供制备乙型肝炎口服疫苗使用。本发明以含有HBsAg基因的具有真核表达元件的质粒为转化载体，通过常规方法对盐藻细胞进行转化处理，再进行继代选择性培养，最终得到转HBsAg基因盐藻，本发明与现有的转基因可食性植物如马铃薯、莴苣等比较，具有以下优点盐藻为单细胞真核生物，繁殖快，无季节性生长限制；培养条件简单，成本低；盐藻细胞无毒性，富含多种维生素、不饱和脂肪酸等对人体有益成分，适于工业化生产口服疫苗。
文档编号C12N1/13GK1410525SQ0112848
公开日2003年4月16日 申请日期2001年9月21日 优先权日2001年9月21日
发明者薛乐勋, 潘卫东, 姜国忠, 陈占宽, 严海燕, 王建民, 吕玉民, 张贵星, 谢华, 郭玉忠, 牛向丽, 侯桂琴, 李 杰, 王建人, 杜保华 申请人:薛乐勋