专利名称：用固定化果糖基转移酶生产蔗果低聚糖的方法
技术领域：
本发明涉及一种功能性食品配料的制备方法，具体说是一种基于固定化果糖基转移酶法，以蔗糖为原料，工业化生产蔗果低聚糖(低聚果糖)的方法。
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背景技术：
蔗果低聚糖(fructooligosaccharide，FOS)，又称低聚果糖，是由1～3个果糖基通过β(2→1)糖苷键与蔗糖(用符号G-F表示)中的果糖基(用符号F表示)结合而生成的蔗果三糖(GF2)、蔗果四糖(GF3)和蔗果五糖(GF4)等一类的碳水化合物。FOS由于其具有优异的生理学功能如促进肠内双歧杆菌的生长、预防蛀牙等而普遍地被用作为保健食品配料使用。FOS存在于洋葱、香蕉等许多天然植物中，但含量很低。商品化的FOS首先被H.Hidaka于1988年用酶法生产开发成功，他从研究黑曲霉的果糖基转移酶开始，然后成功地应用于工业化生产FOS糖浆。果糖基转移酶(fructosyltransferase，FTase)，酶分类号为[EC、2、4、1、9]，能催化蔗糖(G-F)生成蔗果低聚糖，其酶促反应机理可用下式表示。 上式中G-F--蔗糖，G-葡萄糖，FTase-果糖基转移酶，GF2--蔗果三糖，GF3--蔗果四糖，GF4-蔗果五糖。
目前国内工业化生产FOS的现有技术只有液体深层发酵法，即用液体深层发酵法培养黑曲霉，这种微生物能分泌果糖基转移酶，从培养液分离收集黑曲霉菌丝体后，不经任何处理，直接投入蔗糖溶液中，使其转化为FOS。该法的缺点是产酶菌丝体只能利用一次，在FOS生产过程中，由于菌丝体及其培养基成分的存在并参与反应，使产品色度及盐份过高，需要活性碳脱色和离子交换塔脱盐等后处理工序，使整个工艺繁杂，成本提高。至于菌体细胞的代谢物就只能作为杂质留在FOS产品中，无法除去，影晌产品质量。
中国专利96106345.9公开了一种低聚果糖的制备方法，它包括采用能产生果糖基转移酶的菌种Aspergillus niger，将此微生物培养后，收集活性菌丝体，加入蔗糖溶液，于40℃-60℃接触反应20-40小时，然后经活性碳脱色，用阴阳离子交换树脂脱盐，再过滤、浓缩、消毒、包装，得到产品。但该专利所采用的方法也属于液体深层发酵法，它是将培养产物包括菌丝体和培养基、培养基中的无机盐一起投入反应罐中，产酶菌丝体也只能利用一次，得到的产品色度大，含盐分高，需要加入活性碳脱色和经过阴离子树脂和阳离子树脂脱盐，工艺过程复杂，生产成本也较高。
此外，虽有其他方法生产FOS的报导，如固定化细胞法，共固定化生产高含量的FOS研究等，但至今仍停留在实验室研究和试验阶段，未能用于我国工业化生产。其中固定化细胞法，即用海藻酸钙凝胶将产酶菌体包埋起来的方法，与本发明的方法不同，日本已产业化，该法不足之处是对生产环境和条件要求苛刻(例如空气净化)，而且细胞代谢物残留在产品中的问题仍未能解决。至于共固定化法，指的是将葡萄糖氧化酶或葡萄糖异构酶与菌体细胞共固定化，条件更复杂，难以控制，国内外学者对此尚有争议，而且至今未能实现产业化。
本发明人在实验室研究了固定化酶法合成蔗果低聚糖的方法，在《食品与发酵工业》1995年第四期提出了用壳聚糖为载体和以戊二醛为固定化试剂，使果糖基转移酶固定化，可多次使用，得到的蔗果低聚糖为透明的亮黄色，清香，蔗糖转化率达90％左右，开创了固定化酶法合成蔗果低聚糖的新路。但由于某种原因，当时该方法还没有应用于工业化生产。
技术内容为了克服上述现有技术的不足，本发明人经过几年的实验室研究和工业化实验，找到了一种固定化果糖基转移酶酶制剂的工业化生产方法，以及利用该酶制剂以蔗糖为原料进行工业化生产蔗果低聚糖(糖浆或干粉)的方法，该方法技术先进，工艺简单，操作便利，生产成本低。
本发明的内容包括固定化果糖基转移酶制剂的制备以及利用该酶制剂进行工业化生产蔗果低聚糖的两部分，其工艺过程如下1、菌株培养和固定化酶的制备选择具有能分泌果糖基转移酶的优良菌株，在合适的培养基中培养，然后将培养得到的大量菌丝体进行破壁，用离心法和超滤法等将酶分离纯化，再用固定化试剂将酶固定下来。
上面所述的具有能分泌果糖基转移酶的优良菌株经本发明人进行实验和筛选，有以下几种可达到要求，它们是米曲霉(Aspergillus oryzae)、黑曲霉(Aspergillus niger)、出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)、海枣曲霉(Aspergillus phoenicis)和短梗帚霉(Scopulariopsisbrevicaulis_)。
上面所述的合适的培养基包括以下几种物质1～10％蔗糖，1～5％酵母提取物，0.1～0.3％NaNO3，1～5％玉米粉，其培养方法是在25～36℃，通气量200～600ml/min，搅拌速度50～200r/min条件下，经过20～60h，获得大量菌丝体。
上面得到的菌丝体必须先进行破壁，收集这些菌体细胞的胞内酶，才获得较好的果糖基转移酶，所述的菌体破壁可用已知的方法，如机械破壁法，冻融法，超声波破碎法，溶菌酶法等获得果糖基转移酶的粗酶，再用离心法和超滤法等将酶分离纯化和浓缩。
上面所述的用试剂将酶固定化的方法采用化学偶联法，用来固定酶的载体是天然有机高聚物，如交联琼脂糖凝胶，一定交联度的葡聚糖凝胶，壳聚糖凝胶等；所用交联剂为戊二醛。利用偶联反应可使果糖基转移酶和载体之间以化学健联接起来，达到固定化的目的。所用戊二醛浓度在0.05～0.3％，过低或过高都影响固定化效果。
固定化过程中，酶和载体的比例范围是每克载体需酶20～160u，当酶的用量＜20u/g载体时，固定化酶的酶活太低，酶促作用很难发挥出来，但当酶活＞160u/g载体时，酶的固定化效率太低，部分呈游离酶状态，使用一次后就流失掉。
固定化的条件是pH4～9，温度10～60℃，搅拌速度20～100r/min。
固定化操作果糖基转移酶酶液经纯化，浓缩后，用高效液相色谱法(HPLC)测定其酶活力，按一定的酶/载体比例，加入载体凝胶，混合，加入一定浓度的戊二醛溶液，在上述条件下，交联反应4～12h，充分洗涤，离心甩干，再成型和整型，可得固定化果糖基转移酶，于0～5℃保存。
2、以固定化果糖基转移酶法生产蔗果低聚糖(fructooligosaccharide，FOS)固定化果糖基转移酶法生产FOS过程可以采用以下两者之一分批反应法或柱式反应法。
(1)、分批反应法在反应罐中，加入22～65％(w/w)的蔗糖溶液，按每kg蔗糖(干)加入1000～4000U固定化果糖基转移酶的酶量，控制反应液在pH4.8～7.8，温度在32～55℃，搅拌速度在50～200r/min的条件下，反应12～48h调节固定化酶的数量、反应液温度和时间，可以获得合乎要求的FOS产品。反应完成后，用筛网过滤反应液，可以分离回收固定化酶，用于下一批原料的生产。
(2)、柱式反应法将固定化酶装入柱式反应器中，以22～68％(w/w)的蔗糖溶液在pH4.8～7.8，温度32～55℃下通过此反应柱，调节固定化酶的活性和数量，蔗糖溶液的流量、温度等，可以控制FOS成分达到质量标准的要求。
本发明的优点是技术先进，果糖基转移酶经过固定化后，可以提高其利用率，采用分批反应法时，可以反复使用70次以上。柱式反应法，每公斤酶可以生产白利糖度(Brix)≥50的FOS糖浆1000kg以上，而且FOS产品不必经过活性碳脱色，不需离子交换柱脱盐，经浓缩后可以获得Brix≥75，固形物中总低聚糖≥50％的FOS糖浆，整个工艺简化，操作便利，生产成本明显下降。
图1为本发明菌株培养和固定化酶制备的工艺流程图；图2为本发明以固定化果糖基转移酶法生产蔗果低聚糖的工艺流程图。
图1中，菌株接种斜面培养，再接种至摇瓶培养，继而种子罐培养，接至工业发酵罐培养，过滤收集菌丝体，洗涤，破壁，收集游离酶液，纯化浓缩后加入载体和固定化试剂，可获得固定化酶。
图2中，在分批反应法条件下，于反应罐中加入蔗糖和净化水，按比例投入固定化酶，恒温搅拌反应一定时间，放料，用粗滤网分离固定化酶，作下一批反应用；滤液经过滤和浓缩，灭菌包装得FOS产品。
具体实施例方式
实施例一1.固定化酶的制备选取米曲酶(Aspergillus oryzae)菌种接入含2％蔗糖，3％玉米粉，10％酵母提取物和0.2％NaNO3培养基的100升种子发酵罐中。于33℃发酵16h，得种子培养液。在3000升发酵罐中，加入培养基溶液，其中含7％蔗糖，2％酵母提取物，1.5％玉米粉和0.3％NaNO3，于120℃灭菌30min，加入种子培养液80升，在33℃，200r/min的条件下，培养30h，得含菌丝体的发酵液，经离心机离心，分离收集菌丝体，洗涤，破壁，离心取酶液，超滤浓缩后得果糖基转移酶酶液，经HPLC测定酶活力之后，按每400U酶液加入1.0克载体(干)的比例。在100升反应罐中，加入300万U的酶液和7.5Kg的壳聚糖凝胶(干)，搅拌混匀加入戊二醛，使其终浓度为0.1％，在pH7.0，30℃下反应10h，过滤取固态物，充分洗涤，离心甩干水分，成型，即得固定化果糖基转移酶制剂。
2.固定化酶法生产FOS在2M3的反应罐中，加入50％(w/w)蔗糖溶液2000kg，加入固定化酶制剂200万(约50Kg)，在pH5.0～5.5，47～48℃，100r/min条件下，反应12h，经HPLC检测，FOS产品合格后，放料，用60目筛网回收固定化酶，用板框过滤机过滤反应液，经真空浓缩机浓缩成Brix＝75的FOS糖浆。
实施例二1.固定化酶的制备黑曲霉(Aspergillus niger)菌种接入含5％蔗糖，3％玉米粉，1％酵母提取物和0.2％MgSO4培养基的100升种子罐中，32℃发酵14h，得种子培养液，在2000升发酵，加入含有8％蔗糖，2％玉米粉，2％酵母提取物和0.3％MgSO4的培养基溶液，120℃灭菌30min，加入种子培养液60升，在32℃，200min，通气量1000L/min条件下，培养36h，得含菌丝体的发酵液，经离心机离心分离，收集菌丝体，洗涤，破壁，离心取酶液，超滤浓缩后得果糖基转移酶的酶液，经HPLC测定酶活力之后，按每500U酶液加入1.0克载体(干)的比例，在100升反应罐，加入300万U的酶液和6Kg的交联琼脂糖凝胶(干)，搅拌混匀，加入戊二醛，使其终浓度为0.15％，在pH6.5，35℃下反应15h，过滤取固态物，充分洗涤，离心甩干水分，成型，即得固定化果糖基转移酶制剂。
2.固定化酶法生产FOS在1M3的反应罐中，加入52％(w/w)蔗糖溶液1100Kg，加入固定化酶制剂80万u，(约20Kg)，在pH5.1～5.4，48～50℃，100r/min条件下，反应20h，经PHLC检测FOS合格后，放料，用40网筛网回收固定化酶，用板框过滤机过滤反应液，经真空浓缩机浓缩成Brix＝75的FOS糖浆。
权利要求
1.一种用固定化果糖基转移酶生产蔗果低聚糖(低聚果糖)的方法，包括果糖基转移酶的制备以及利用该酶制剂进行工业化生产蔗果低聚糖的两部分，所说的果糖基转移酶的制备采用固定化工艺，其特征在于(1)、选择具有能分泌果糖基转移酶的优良菌株，在合适的培养基中培养，然后将培养得到的大量菌丝体进行破壁，用离心法和超滤法将酶分离纯化，再用固定化工艺将酶固定下来(2)、用分批反应法或柱式反应法以固定化果糖基转移酶生产蔗果低聚糖。
2.根据权利要求1所述的用固定化果糖基转移酶生产蔗果低聚糖的方法，其特征在于选择具有能分泌果糖基转移酶的优良菌株是米曲霉(Aspergillus oryzae)、黑曲霉(Aspergillusniger)、出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)、海枣曲霉(Aspergillus phoenicis)和短梗帚霉(Scopulariopsis brevicaulis_)。
3.根据权利要求1所述的用固定化果糖基转移酶生产蔗果低聚糖的方法，其特征在于所述的合适的培养基包括以下几种物质1～10％蔗糖，1～5％酵母提取物，0.1～0.3％NaNO3，1～5％玉米粉，其培养方法是在25～36℃，通气量200～600ml/min，搅拌速度50～200r/min条件下培养20～60小时。
4.根据权利要求1所述的用固定化果糖基转移酶生产蔗果低聚糖的方法，其特征在于所述的菌丝体破壁方法采用机械破壁法或者冻融法，超声波破碎法，溶菌酶法。
5.根据权利要求1所述的用固定化果糖基转移酶生产蔗果低聚糖的方法，其特征在于所述的用工艺酶将酶固定下来的方法采用化学偶联法，用来固定酶的载体是天然有机高聚物一交联琼脂糖凝胶或者一定交联度的葡聚糖凝胶、壳聚糖凝胶；所用交联剂为戊二醛。
6.根据权利要求1和5所述的用固定化果糖基转移酶生产蔗果低聚糖的方法，其特征在于所述的固定化的条件是pH4～9，温度10～60℃，搅拌速度20～100r/min，酶和载体的比例范围是每克载体需酶20～160u，交联剂戊二醛浓度为0.05～0.3％。
7.根据权利要求1所述的用固定化果糖基转移酶生产蔗果低聚糖的方法，其特征在于以固定化果糖基转移酶生产蔗果低聚糖所采用的分批反应法是在反应罐中，加入22～65％(w/w)的蔗糖溶液，按每kg蔗糖(干)加入1000～4000U固定化果糖基转移酶的酶量，控制反应液在pH4.8～7.8，温度在32～55℃，搅拌速度在50～200r/min的条件下反应12～48h，反应完成后，用筛网过滤反应液，分离回收固定化酶，用于下一批原料的生产。
8.根据权利要求1所述的用固定化果糖基转移酶生产蔗果低聚糖的方法，其特征在于以固定化果糖基转移酶生产蔗果低聚糖所采用的柱式反应法是将固定化酶装入柱中，以22～68％(w/w)的蔗糖溶液在pH4.8～7.8，温度32～55℃下通过此柱。
全文摘要
本发明阐述了一种以蔗糖为原料,工业化生产蔗果低聚糖(低聚果糖)方法,它包括固定化果糖基转移酶制剂的工业化生产以及利用该酶制剂进行工业化生产FOS两部分:一、选择具有能分泌果糖基转移酶的优良菌株,在合适的培养基中培养,然后将培养得到的大量菌丝体进行破壁,用离心法和超滤法将酶分离纯化,再用试剂将酶固定下来;二、分批反应法或柱式反应法以固定化果糖基转移酶生产蔗果低聚糖;采用本发明方法得到的蔗果低聚糖产品不必经过活性碳脱色,不需离子交换柱脱盐,可以获得Brix≥75,固形物中总低聚糖≥50%的FOS糖浆,生产工艺简化,操作便利,成本明显下降。
文档编号C12N11/00GK1335402SQ0112834
公开日2002年2月13日 申请日期2001年8月12日 优先权日2001年8月12日
发明者魏远安, 谢庆武, 姚评佳, 董毅宏, 梁锦添 申请人:广西大学, 广西南宁奥立高食品生化有限公司