专利名称：具有提高了的生长、生物物质产量和本质部纤维长度的转基因树木及其生产方法
技术领域：
本发明涉及具有改良了的特征，特别是诸如提高了的生长速度、生物物质产量和木质部纤维长度的在经济上重要的特征的转基因树木；转基因植物、种子、植物细胞和其他类型的繁殖材料，及其生产方法。背景传统的树木育种，特别是森林树种育种的一个主要缺陷是，由于其世代周期长而进展缓慢。不过，通过利用基因技术的最新发展，可以明显缩短生产出一个新品种所需要的时间。另外，通过生物技术方法可以在特定树种上将林业和纸浆行业上需要的性状更紧密地导向一致。
迄今为止，树木遗传工程的大多数应用主要集中在改变木质素生物合成，以便获得较少的木质素或改变了的木质素组成、较早开花、抗病虫害或抗除草剂的树木方面。为了改变树木的生长和发育过程，还对操纵植物激素含量或激素敏感性感兴趣。不过，改变树木的植物激素含量的例子还很少。这一目的主要是通过直接改变内源IAA生物合成或细胞分裂素生物合成或利用农杆菌属rolC基因间接改变各种激素源而实现的。尽管在所有场合下这种改良都会导致具有改变了的生长特征和木材特性的树木，但是，迄今为止还没有获得具有明确的实际用途的改良。
赤霉素(GAs)是由100个以上的四环双萜构成的一组，其中的一些是必需的内源调节剂，它们能在植物生命周期中影响生长和发育过程，例如，芽的伸长，叶的膨胀和成形，开花和种子发芽。说明GAs在控制芽伸长方面的重要性的最好的例子是拟南芥属、玉米和豌豆的GA-缺陷突变型。与野生型植物相比，这些突变型具有较低的活性GA水平，由于节间长度的降低而产生了矮化表型。通过使用活性GA可以完全恢复所述GA-缺陷突变型的表型。在细胞水平上，业已发现GAs能促进细胞分裂和细胞伸长。
在植物中，GAs的生物合成是通过类异戊二烯途径由甲羟戊酸开始的。赤霉素的含量主要是通过赤霉素生物合成基因的转录控制而调控的。具体地讲，多功能酶——赤霉素20-氧化酶(GA 20-ox)是控制GA生物合成的一种关键酶(
图1)。它能催化C-20赤霉素GA12/GA53的逐步转化，通过三次连续的氧化形成GA9/GA20，它们分别是活性赤霉素GA4和GA1的直接前体。GA14的作用是下调GA 20-氧化酶基因的表达，表明该基因的调控与直接最终产物抑制相关。另外，某些作者还提出GA 20-氧化酶在转录水平上受到光周期的调控。
传统农业和园艺的常用措施是使用能改变植物的GA水平的化合物。GA生物合成的抑制剂是谷物和园艺植物的特别常用的生长抑制剂。为了减少这些化合物的使用，诸如对内源GA生物合成进行遗传学修饰的生物学方法具有明确的优点。用拟南芥属作为模型生物，业已证实可以通过改变GA 20-氧化酶水平改变GA水平，并且，这样会产生具有改变了的生长和发育形式的植物。沿有义方向表达GA 20-氧化酶的转基因拟南芥属与野生型植物相比，表现出开花较早和茎干较长，而反义植物具有相反的特征[Coles.J.P.et ai.Modification ofgibberellin production and plant development in Arabidopsisby sense and antisense expression of gibberellin 20-oxidasegenes.Plant Jounal，17，547-556，1999]。
特别感兴趣的是，在诸如树木的高等植物上改变GA生物合成，因为它打开了改良木材的途径。以前的激素应用研究业已证实，木质部纤维的分化需要GAs，并且它对次生木质部纤维长度以及硬木树种和针叶树的纵向生长和径向生长有重要影响。
很明显，需要改良树木的生长特征，特别是诸如生长速度、生物物质增加和纤维长度的在技术上和经济上感兴趣的特征的改进方法。同样，需要具有诸如提高了的生长速度、茎干体积和木质部纤维长度的改良特征的转基因树木。因此，本发明的目的是提供所述改进方法和转基因树木。另外一个目的是在林业上减少或消除影响生长的化合物。
大多数双子叶植物和所有的裸子植物都进行某种程度的次生增厚。增厚的量取决于成熟的植物是草本植物或者是木本植物(乔木)。例如，拟南芥属植物只能在特殊条件下产生次生增厚，而木本植物，如杨属能进行高度的次生生长。草本植物的低度次生增厚，使得难以预测草本植物的遗传学变化会在木本植物中产生怎样的木材形成改变。
例如，Huang等证实(同上)，通过在拟南芥中超量表达GA 20-氧化酶，可以提高植物中GAs的含量。所述转基因植物表型包括在所有组织中明显的细胞伸长。叶柄、花序柄和叶均显示出细胞伸长。从这些结果可以看出，提高了的赤霉素含量对来自发芽的细胞伸长有作用。然而，根据这些结果无法预测GA 20-氧化酶超量表达会对木本植物产生什么样的影响。木本植物形成层分生组织中的细胞分裂是受几种不同的激素和诸如拟南芥的一年生植物所没有的物理限制的控制。
因此，令人惊讶地发现，源于形成层的细胞(纤维)存在提高了细胞伸长，并且，由于形成层细胞分裂的加强会导致生物物质的增加。对于本领域技术人员来说，通过超量表达GA 20-氧化酶来增加木材生物量和纤维长度并不是显而易见的。
树干直径的增加主要是由于维管形成层中的分生组织活性所导致的，维管形成层是位于茎干、分枝和木质根系的木质部和韧皮部之间的筒状侧向分生组织。在形成层中会发生两种类型的细胞分裂加性分裂和倍性分裂。加性分裂涉及纺锤形形成层原始细胞的平周分裂，以便形成木质部和韧皮部母细胞，这些细胞再分裂形成木质部和韧皮部细胞。倍性分裂涉及纺锤形形成层原始细胞的垂周分裂，它能提供形成层的周向膨胀。木质部细胞和韧皮部细胞在被形成层母细胞分割之后，它们以有顺序的事件序列分化，其中包括细胞增大、次生壁形成、木质素化和原生质体的丧失。这些事件并非是逐步发生的，相反是作为重叠的时期出现的。
通过下面的非限制性说明书和实施例，以及通过权利要求书可以理解本发明的其他特征和优点。
图2表示10个超量表达GA 20-氧化酶的品系(1-15号)和未转化过的对照(C)的Northern印迹分析。对来自每一种样品的18微克总RNA进行加样，并且用从拟南芥属GA 20-氧化酶(AtGA20ox1)cDNA或内源遍在蛋白(UBQ)EST序列(pttUBQ)上分离的标记过的片段检测。
图3表示转基因杂交白杨的生长加强在由组织培养物发芽，盆栽并且在生长箱中培养7周(0时间)之后，各种转基因GA 20-氧化酶超量表达品系的累加性芽伸长(上图)和直径增长(下图)。
图4是表示在生长箱中生长12周之后的对照和转基因(品系11)植物的照片。
图5表示GA 20-氧化酶超量表达对(A)细胞长度，(B)每个节间的细胞数量，(C)木质部纤维的数量和(D)木质部纤维长度的影响。细胞长度和细胞数量是用生长活跃的植物的完全伸长的节间测定的，木质部纤维的数量也是这样测定的。GA 20-氧化酶超量表达品系的数据是9个分别独立地产生的品系的平均值。非伸长植物的纤维长度值是3个独立产生的品系的平均值。垂直柱表示SE。
图6表示转基因杂交白杨在第二个生长季节也具有增强了的直径增长。对照(WT)和品系4和13的累加性直径增长，是在从打破休眠以后开始计算的2.5个月的时间内测定的。
发明内容
本发明令人惊讶地证实，GA 20-氧化酶基因在树木(本发明以温带落叶树为例)中的异位超量表达，会导致生长速度、树干体积和木质部纤维长度的显著改变。使用与拟南芥GA 20-氧化酶序列X83379(EMBL保藏号)同源的编码一种具有GA 20-氧化酶活性的多肽的cDNA序列(SEQ ID NO1)。因此，本发明人所获得的结果证实，在树木上对GA含量进行遗传学修饰，可用于改良对林业、纸浆业和造纸业来说极其重要的性状。
结果证实，在树木中具有生物学活性的赤霉素GA1和GA4的内源性增加会加速生长。通过在杂交白杨Populus tremula×P.tremuloides中表达来自拟南芥属的AtGA20ox1基因，能得到高度和直径生长更快、叶片更大、木质部纤维更长和生物物质增加的树木，证实了这一看法。这种表型是早先在超量表达相同的GA 20-氧化酶基因转基因拟南芥属植物上观察到的性状的部分再现(Coles.J.P.et ai.Modificationof gibberellin production and plant development in Arabidopsisby sense and antisense expression of gibberellin 20-oxidasegenes.Plant Jounal，17，547-556，1999)。与野生型植物相比，这种植物具有较长的下胚轴、较大的花结叶、较长的叶柄，并且开花更快。
不过，尚未报导过有关转基因拟南芥属生物物质增加和解剖学变化的研究。十分可疑的是在转基因拟南芥属上是否能实现生物物质的增加。
还有人认为GA 20-氧化酶是调控GA控制的生长的一种关键酶[Hedden，P.&Kamiya，Y.赤霉素生物合成酶基因及其调控，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.，48，431-460，1997]。GA 20-氧化酶基因的转录是受GAs的反馈调控这一事实表明，GA 20-氧化酶基因的组成型超量表达会破坏GA体内稳态的内源调控。在本发明中，GA20-氧化酶在杂交白杨中的超量表达会导致与早期13-羟化途径和非13-羟化途径相关的C19-GAs的增加(图1)。因此，在GA1和GA4的含量之间并没有一致的差别，这两者在杨属中都具有生物学活性。因此，本发明的结果与以前在超量表达GA 20-氧化酶的转基因拟南芥属植物上进行的GA测定吻合。另外，在杂交白杨和拟南芥属上，失活最终产物GA8的含量都明显增加(表1)。
有人认为这是因为GA8的转化比GA1慢。通过非13-羟化途径形成的另一种最终产物GA34的含量较低，可以通过该化合物的转化比GA8转化快来解释。与C19-GAs不同，在转基因植物上观察到了C20-GAs含量的降低。这一结果与以下事实吻合C20-GAs是GA 20-氧化酶的底物(表1) 。
另人惊讶的是加强了的GA 20-氧化酶表达对Populus tremula×P.tremuloides有如此显著的影响。这表明GA 20-氧化酶基因的组成型超量表达会破坏GA体内稳态的内源调控。
在本研究中，发明人发现了叶片和茎干组织之间GA含量的差异活性GA1和GA4的含量提高在茎干组织中最大。这可能是因为AtGA20ox1基因在茎干中的表达最强。不过，在杂交白杨中，CaMV35S启动子在叶片中的活性一般要高于在茎干中的活性，但是，也存在例外。因此，茎干中较高的GA1和GA4含量更有可能是因为在GAs转运方面或在GA前体的生物合成方面存在差别。然而，不能排除叶片中GA3β-羟化酶或GA2β-羟化酶活性存在差异的可能性。在拟南芥属中，业已证实2β-羟化是由活性GAs在转录水平上激活的。
在转基因GA 20-氧化酶杨属树木上观察到的高度生长的加强(图3)，显然不是因为细胞伸长的加强，因为没有发现细胞长度的明显变化(图5A)。不过，在每个完全伸长的节间上所观察到的细胞数量的差异清楚地表明，较高的GA含量会影响茎干组织中的细胞分裂(图5)。这是本发明的一个有趣的方面，它提供了为了不同目的而影响纤维性原材料和生物物质生产的多种可能性。
尽管业已发现GAs能影响细胞伸长，但是也知道GAs能在茎干的接近顶点的部位诱导有丝分裂活性。然而，必须指出的是，尽管用于细胞长度测定的样品是取自对照和转基因植物的相同部位(由顶点开始计算的节间数确定)，但是不能排除转基因植物的细胞比野生型植物的细胞处于更早的发育阶段的可能性，因此，这些细胞有可能仍然在伸长。还有人认为GAs在分生组织中的作用扩大了正在形成的器官的伸长区。
表1来自表达AtGA20ox1基因的转基因杂交白杨的第7和8个节间(详见正文)的茎干/叶片组织中的GA浓度(ng/g鲜重)。3次独立测定的平均值。基因型 GA12GA53GA19GA9GA20GA4GA1GA11GA8对照5.78/1.15 3.22/0.41 3.15/1.21 n.d./n.d. 0.45/0.43 0.84/0.88 0.63/0.63 1.63/1.23 15.0/9.4品系1 1.16/0.79 0.29/0.28 0.85/0.55 3.20/0.64 5.36/1.44 9.71/4.03 20.2/1.29 5.00/3.78 58.6/40.7品系2 3.02/0.90 1.04/1.25 3.55/0.59 4.34/1.24 3.69/2.84 9.04/6.60 10.2/2.47 8.37/5.94 77.4/43.8品系4 1.06/0.71 0.27/0.24 0.81/0.63 5.23/0.86 5.03/2.84 11.3/4.76 11.7/1.58 7.84/4.78 53.2/52.9品系7 1.00/0.73 0.29/0.28 1.21/0.60 5.38/0.78 4.74/2.36 20.7/6.29 14.0/1.35 6.03/4.69 68.4/32.7品系9 2.49/0.73 0.62/0.26 1.19/0.56 5.67/0.73 6.00/2.16 9.70/5.13 5.42/2.35 10.46/4.85 70.0/49.6品系11 1.67/0.62 0.57/0.28 2.04/0.60 4.31/1.42 5.77/3.31 10.7/5.30 14.2/1.81 9.43/4.28 72.6/42.6品系13 0.91/0.78 0.26/0.25 0.90/0.64 6.58/0.64 16.4/3.45 19.8/6.46 29.3/3.22 7.98/3.85 75.9/55.1品系14 1.26/0.64 0.27/0.25 0.62/0.55 3.2/0.41 4.01/1.48 6.99/2.36 11.6/1.38 5.52/4.69 78.6/37.5品系15 1.82/0.60 - 5.57/0.74 - 2.53/2.57 3.14/2.58 2.58/1.62 7.53/5.02 57.6/48.2
有关植物激素应用的研究业已证实，GAs能增强在树木中的形成层活性，特别是在与IAA组合时更是如此。此时，GA含量的工程提高会导致更快的茎干直径生长(图4)。还观察到了较高GA含量对次生生长的影响，会导致木质部纤维细胞数量和木质部纤维长度的增加(图5C，D)。在所述实验中测定的长度增加大约为8％，这种增加必须保持为显著增加，它对纤维特性有影响，并因此具有作为纤维性原材料的潜力。
这一结果与用GAs和GA生物合成抑制剂进行的应用研究的结果吻合。在杨属中，在新生木材和成熟木材之间的过渡区纤维和导管长度增加。因此，形成层区内细胞的成熟时间，即不同分化区的时间跨度，最终将决定其大小和细胞壁厚度。如果诸如GA1和/或GA4的GAs的作用能延长这一转变时间，就能解释在转基因植物成熟部分的纤维长度增加，以及在转基因和对照植物的新生茎干组织中木质部纤维长度没有差别。
转基因植物叶片体积的增加是径向和纵向伸长增加的结果(表2)。在早期阶段，纵向生长更为明显，形成长而细的叶片。不过，在晚期阶段，这些叶片的形态变的与对照植物相似，具有类似的叶片宽度和长度比。例如，在豌豆上业已证实了GAs能促进叶片伸长。在诸如大麦的sln变体和拟南芥属的spy变体的组成型GA信号变体上观察到的非常长而且细的叶片，也表明GAs能促进叶片伸长。不过对GAs在叶片发育中的更具体的调控作用的了解仍然很少。在拟南芥属中，叶片膨胀是由至少两个独立的并且极化的过程调控的长度和宽度发育由ROTUNDIFOLIA和ANGUSTIFOLIA基因发挥特殊作用。还不了解GAs是否调节对这些基因的细胞反应。不过，值得注意的是发育期间转基因GA20-氧化酶白杨的叶片表型的变化，这表明叶片长度和宽度生长的两个在发育上独立的过程都受GAs影响，不过是发生在不同的时期。
表2.野生型和表达AtGA20ox1基因的转基因杂交白杨的形态学鉴定。用于测定的对照、品系2和品系11的植株数量分别为10、5和6。在生物物质测定中，对照、品系2、品系11以及所有取样转基因植物的组合的取样植株数量分别为7、2、3和23。对于所有统计学分析来说，用ANOVA比较植株和基因型。统计学上显著的差异表示为1％(*)和5％(**)的可能性水平(Fisher’s PLSD)。
基因型对照 品系2 品系11节间长度(cm＝SE) 2.19±0.053.06±0.09*3.07±0.09*叶片长度和宽度(cm±SE)叶片长度10 8.34±0.369.52±0.38**9.17±0.28叶片宽度10 7.25±0.416.28±0.20 5.85±0.24**叶片长度14 9.52±0.4511.18±0.60**10.78±0.41叶片宽度14 8.00±0.388.35±0.39 8.52±0.25叶片长度18 9.90±0.7911.06±1.0011.68±0.56叶片宽度18 7.48±0.648.80±0.47 8.88±0.43叶片长度20 7.75±0.3411.94±0.44*11.25±0.48*叶片宽度20 6.07±0.469.44±0.41*8.85±0.41*生物物质干重(g)对照 品系2.11 转基因叶片 5.45±0.516.38±0.58 6.14±0.28茎干 4.58±0.4310.42±1.01*10.34±0.49*根系 43.05±4.71 38.36±2.6337.81±2.06生物物质鲜重(g)叶片 17.10±1.63 23.10±2.01**22.05±0.91**茎干 12.04±1.19 31.39±2.88*30.58±1.28*
对转基因和野生型植物进行的生物物质测定发现GA 20-氧化酶活性的提高会导致生长的普遍加强。这种作用在径干部分特别明显，表明GAs对径干生长有显著影响。先前用各种GAs进行的喷洒实验业已证实，这种激素倾向于以牺牲根系生长为代价增加杨属苗的生物物质。早先业已在树木上证实了较高的GA含量会导致根系形成的减弱。在本研究中，较差的根系形成是转基因植物在组织培养中和种植到土壤中之后存活的主要问题。在随后的发育阶段，根系发育仍然会受影响，但是受影响的程度较低(表2)。还发现GAs对长根的影响随着根系发育阶段而变化。
总而言之，在这里本发明人业已证实GA 20-氧化酶活性在GA-控制的杨属生长方面的重要作用。另人惊讶的是，迄今为止只能通过诸如喷洒的外部使用实现，在某些场合下只能部分实现的所述作用，可以通过内源表达而实现。同样另人惊讶的是，本发明的方法可应用于高等生物，本发明以杂交白杨Populus tremula×P.tremuloides为代表。因此，本发明的一个重要优点是，可以减少或消除在林业上使用影响生长的化合物。
本发明打开了通过简单地增加内源GA含量，用遗传工程方法生产出生长更快并且能产生更多生物物质的树木的途径。所述结果具有实践意义(有助于生产对纸浆、纸张和林业有价值的改良树种)和科学意义，它能预先对GAs控制树木生长和发育的机制进行研究。
通过体外诱变去掉了GA 20-氧化酶翻译起点前面的上游ATG序列。在PCR反应中使用一种正向引物和一种反向引物，正向引物与GA20-氧化酶基因的5’-末端配对，但缺乏额外的ATG，并且具有BamHI和XbaI位点，而反向引物跨越GA 20-氧化酶基因上的一个HindIII位点。用AtGA20ox1作为模板获得一种PCR产物，并且亚克隆到pOK12载体上，形成了质粒pOK12.GA20ox5’。重建了缺乏额外ATG的完整的GA20-氧化酶cDNA，通过消化AtGA20ox1，分离含有GA 20-氧化酶基因3’末端的片段，并且将该片段连接到pOK12.GA20ox5’上，得到了质粒pOK12/AtGA20ox1。然后，通过用BamHI消化，从pOK12/AtGA20ox1中分离了GA20-氧化酶cDNA，并且，沿有义方向连接到二元载体pPCV702.kana[Walden.R.，Koncz.C.&schell，J.分子细胞生物学方法，1，175-194，1990，基因载体在植物分子生物学中的应用，Methods Mol.Cell Biol.，1，175-194，1990]的BamHI位点上，使其受CaMV35S启动子控制。
植物转化和生长条件基本上按照以前披露的方法，转化并且再生杂交白杨Populustremula×P.tremuloides Michx克隆T89[Nilsson，O.等，通过酶促分析和非破坏性显像监测的CaMV35S启动子-荧光素酶在转基因杂交白杨中表达的空间形式，Transgenic Research，1，209-220，1992]。从14个独立的品系中选择10个通过体外芽培养在含有矿物质和维生素的1/2浓度的MS培养基上繁殖[Murashige，T.&Skoog，F.A.用于烟草组织培养物的快速生长和生物分析的改良培养基，Plant Physiol.，15，473-479，1962]。
在开始长根之后，将植株浸泡在Weibufix长根粉(Svalof WeibullAB.Hammenhog，瑞典)中，并且用消毒泥炭∶珍珠岩(5∶1)盆栽，并且保持在18℃的生长箱中，光周期为18小时，相对湿度为90％。主要光周期(10小时)的光子通量密度为175μmol m-2s-1，波长为400-750nm(Osram Power Staw HQI-TS400W/D灯，Osram，德国)，并且光照期是由低强度光线(20μmol m-2s-1)提供的。每天给植物浇水，并且在需要时重新盆栽，并用完全营养液施肥(Superba S.Supra HydroAB，Landskrona，瑞典)。108天之后，将某些植物转移到短光周期条件下(10小时)，以便诱导生长终止。然后对这些植物进行冷驯化，并且在8℃下保持休眠4周，在该时间点上采集样品用于纤维长度测定。
生长测定和取样在7周大小时，对所有植株的大体上相同部位的生长最活跃的节间进行标记。将该标记用作直径生长测定和计数节间的参考点。每隔3-4天测定所述植物的直径、高度和节间数量。节间数量是从顶部到所述参考点计数的第一个节间被确定为位于最上方的至少1cm长的叶片下面的节间。100天之后收获在长日照条件下生长的植物，使用7个对照植物和25个代表9个转基因独立品系的植物(排除品系6)。对包括上部叶片叶片在内的节间7和8进行采样，用于GA分析，并且将来自第9和10节间的叶片用于Northern分析。在取样之后，马上将所有组织放在液态氮中冷冻。为了进行解剖学研究，测定节间15和16的长度，然后切除，并马上在FAA中固定。在取样之后，将剩余的所有部分分成叶片、茎干和根部分，并用于鲜重生物量测定。干重量是在55℃下将所述样品干燥5天之后测定的。包括3个对照和5个转基因植物(代表品系2、11、14)的休眠植物的样品，取自从所述参考点计数的节间1、10和20。将所述样品用于浸解，然后测定纤维长度。
解剖学鉴定在进行常规化学固定之后，将样品包埋在LR Whitez中[Regan，S.Bourquin，V.，Tuominen，H.&Sundberg，B.A.，在对次生茎干组织中的基因表达进行原位杂交分析时的精确度和高分辨率，植物杂志，19，363-369，1999]。获得厚度为0.2微米的用于细胞计数的纵向切片(节间15和16)和用于纤维计数的横向切片(节间30)，并用甲苯胺兰染色。测定每个节间的3个切片在1mm的纵向切片上的表皮细胞和髓细胞数量。细胞长度和每个节间的细胞数量是作为节间15和16的平均值计算的。木质部纤维的数量是在每个个体的3个独立的径向行(从髓芯到形成层)中计数的，并计算每种基因型(品系4、11和13)的平均值。
纤维长度测定为了进行纤维长度测定，制备特定节间外侧木质部的切片。通过在10％过氧化氢和50％冰醋酸溶液中煮沸4-6小时，浸解所述样品。在完全漂白之后，用蒸馏水漂洗三次，用碳酸钠中和，并再次用水洗涤。最后，通过在水中振荡将纤维彼此分离，并用纤维分析仪(KAJAANI纤维实验室，Valmet Automation Kajaani Ltd.，Kajaani，芬兰)测定。测定每个样品30800根纤维的平均长度。
Northern分析用Chang等的基于氯仿和十六烷基三甲基溴化胺的方法从叶片中提取总RNA[Chang，S.，Puryear，J.&Cainey，J.，从松树中分离RNA的简单而又有效的方法，Plant Mol.Biol.Rep.，11，113-116，1993]。按照Sambrook等的方法[Sambrook，J.，Fritsch，E.&Maniatis，T.，“Molecular CloningA laboratory Manual”，ColdSpring HarborPress，1989]，在甲醛琼脂糖凝胶上分离每种样品的大约18微克的总RNA，并按照生产商的方法吸印到尼龙Hybond N膜(Amersham，LittleChalfont，英国)上。将从pOK12/AtGA20ox1上获得的BamHI/XhoI片段和在杨属测序项目中获得的遍在蛋白样表达序列标记(ESTA046p57)[Sterky，F.等，白杨木质形成组织中的基因发现5.269表达序列标记的分析，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95，13330-13335，1998]用作探针，分析AtGA20ox1和参考基因的异位表达。杂交是在65℃下，在Church缓冲液中进行一夜[Church，G.M.&Gilbert，W.，基因组测序，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81，1991-1995，1984]。在65℃下分别用下列溶液各洗涤所述膜2次，每次3分钟2XSSPE，0.1％SDS1XSSPE，0.1％SDS0.5XSSPE，0.1％SDS和0.1XSSPE，0.1％SDS。为了观察表达形式，用所述膜对磷成像仪(分子成像仪，GS-525，Bio-Rad实验室，Hercules，CA，美国)暴光一夜。
赤霉素的定量在液态氮中将200-300毫克样品研磨成均匀的粉末，并且使用做过一些改进的早先由Peng等所披露的方法分析GAs[Peng，J.R.，Richards，D.E.，Moritz，T.，CanoDelgado，A.&Harbert，N.P.，拟南芥属gai突变的基因外抑制剂能改变不同赤霉素反应的剂量依赖关系，植物生理学，119，1199-1207，1999]。降低了用于提取和分配的溶剂的体积，以及阴离子交换柱的体积。另外，在HPLC步骤之前，将样品甲基化，最后，用JEOL SX/SX102A四扇区质谱仪(JEOL，东京，日本)通过GC/MS-选择性反应监测(SRM)分析样品。用[2H2]-GAs作为内部标准物。
结果转基因GA 20-氧化酶杂交白杨的制备从14个独立的转化品系中再生了10个，选择这10个作进一步分析。Southern分析证实，所有选择的转基因品系在其基因组中都插入了1-3个拷贝的AtGA20ox1基因，品系6例外，它具有至少4个拷贝(资料未发表)。对从叶片中分离的RNA进行的Northern分析证实，AtGA20ox1基因在品系2、7、9、14、和15中表达最强。在品系1、4、11和13中的表达稍弱一些，而在品系6中的表达几乎检测不到(图2)。一般，无论是在组织培养条件下还是用土壤盆栽，与对照植物相比，转基因品系都表现出长根较差。例如，在盆栽时，100％的对照植物都能存活，形成对比的是，只有32％的转基因植物存活。
GA含量测定叶片和节间中活跃生长的组织中的GA含量。在叶片和茎干中，转基因植物表现出高水平的13-羟化C19-GAs(GA20、GA1和GA8)和非13-羟化C19-GAs(GA9、GA4和GA34)(表1)。与野生型叶片相比，含量的增加在茎干组织中比在叶片组织中更明显。与对照相比，在品系7的茎干组织中具有生物学活性的GA1和GA4的含量分别提高了22和24倍。另外，所有转基因品系都具有较低含量的GA 20-氧化酶的底物。例如，品系7茎干组织中GA12和GA53的含量分别为对照中含量的17％和9％。
芽的生长和形态学与野生型相比，所有转基因品系都表现出较快的高度和直径生长(图3)，这构成了这种树木的特有表型(图4)。尽管不同转基因品系之间GA 20-氧化酶mRNA的含量不同(图2)，但是，在表达水平和生长之间没有严格的相关性。对两个转基因品系所做的详细研究(表2)发现，高度生长的差异主要是因为节间长度的不同。没有发现节(叶片)数量有统计学上显著的差别(资料未发表)。不过，转基因品系上的叶片发育不同。与对照植物的叶片相比，转基因植物新生的膨大叶片具有不同的形态和较高的叶片长度与宽度比(表2)。在第14节之后，即完全展开的叶片中，这种形态学比例没有显著差别，但是，对照植物和转基因植物的叶片大小仍然有明显差别。转基因植物具有更长和更宽的叶片，并因此具有更高的平均叶片鲜重(表2)。另外，与对照相比，转基因品系的叶柄较长(资料未发表)。
在以鲜重或干重为基础进行测量时，转基因植物和对照植物的芽生物量存在显著差别(表2)。与对照植物相比，转基因植物芽的干重量平均高出64％。这种差别在茎干中尤其明显，其中，与对照植物相比，转基因植物的干重量高出126％。因此，转基因植物还具有改变了的仅为2∶1的根∶芽重量比，与之对应的是，对照植物的比例为4∶1。尽管转基因植物的起始长根能力较低，但是，转基因植物和对照植物的根系干重量没有明显差别(表2)。
转基因植物的细胞长度和细胞数量在生长活跃的转基因品系的推测为完全伸长的节间中(有关定义参见实验方法)，AtGA20ox1基因的表达不会影响表皮细胞和髓细胞的长度(图5A)。然而，在所述伸长的节间中表皮细胞和髓细胞的数量，大约比野生型对照高55％(图5B)。
通过计数横截面上木质部纤维细胞的数量，还测定了形成层活性(图5C)。与对照植物相比，转基因品系木质部纤维细胞的数量表现出提高了71％。木质部纤维是从休眠植物的三个不同部位取样的，并测定其长度。没有检测到来自树木不同高度的纤维长度有差别(资料未发表)，但是，转基因品系的木质部纤维大约比对照植物长8％(图5C)。
虽然业已对本发明的优选实施方案(这些方案是本发明人目前已知的最佳形式)进行了说明，但是，应当理解的是，在不超出所附权利要求书所规定的本发明的范围的前提下，可以作出对本领域技术人员来说显而易见的各种改变和改进。
序列表序列表<110>瑞典树木基因改良公司(Swetree Genomics AB)<120>转基因植物及其生产方法<130>MH42953<140><141><160>2<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>1259<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明拟南芥GA 20-氧化酶cDNA结构<400>1aatctctcaa aatggccgta agtttcgtaa caacatctcc tgaggaagaa gacaaaccga 60agctaggcct tggaaatatt caaactccgt taatcttcaa cccttcaatg cttaaccttc 120aagccaatat cccaaaccaa ttcatctggc ctgacgacga aaaaccttcc atcaacgttc 180tcgagcttga tgttcctctc atcgaccttc aaaaccttct ctctgatcca tcctccactt 240tagatgcttc gagactgatc tctgaggcct gtaagaagca cggtttcttc ctcgtggtca 300atcacggcat cagcgaggag cttatatcag acgctcatga atacacgagc cgcttctttg 360atatgcctct ctccgaaaaa cagagggttc ttagaaaatc cggtgagagt gttggctacg 420caagcagttt caccggacgc ttctccacca agcttccatg gaaggagacc ctttctttcc 480ggttttgcga cgacatgagc cgctcaaaat ccgttcaaga ttacttctgc gatgcgttgg 540gacatgggtt tcagccattt gggaaggtgt atcaagagta ttgtgaagca atgagttctc 600tatcattgaa gatcatggag cttctcgggc taagtttagg cgtaaaacgg gactacttta 660gagagttttt cgaagaaaac gattcaataa tgagactgaa ttactaccct ccatgtataa 720aaccagatct cacactagga acaggacctc attgtgatcc aacatctctt accatccttc 780accaagacca tgttaatggc cttcaagtct ttgtggaaaa tcaatggcgc tccattcgtc 840ccaaccccaa ggcctttgtg gtcaatatcg gcgatacttt catggctcta tcgaacgata 900gatacaagag ctgcttgcac cgggcggtgg tgaacagcaa gagcgagagg aagtcacttg 960cattcttctt gtgtccgaaa aaagacagag tagtgacgcc accgagagag cttttggaca 1020gcatcacatc aagaagatac cctgacttca catggtctat gttccttgag ttcactcaga 1080aacattatag agcagacatg aacactctcc aagccttttc agattggctc accaaaccca 1140tctaagaaat aaaatattca tgtcttgtct tgttagttac tagtatcttc tttatatttc 1200atgtatgtat atggtaatag gcaataacac cttttagcat ctcaaaaaaa aaaaaaaaa 1259<210>2<211>377<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列说明拟南芥GA 20-氧化酶cDNA结构<400>2Met Ala Val Ser Phe Val Thr Thr Ser Pro Glu Glu Glu Asp Lys Pro1 5 10 15Lys Leu Gly Leu Gly Asn Ile Gln Thr Pro Leu Ile Phe Asn Pro Ser20 25 30Met Leu Asn Leu Gln Ala Asn Ile Pro Asn Gln Phe Ile Trp Pro Asp35 40 45Asp Glu Lys Pro Ser Ile Asn Val Leu Glu Leu Asp Val Pro Leu Ile50 55 60Asp Leu Gln Asn Leu Leu Ser Asp Pro Ser Ser Thr Leu Asp Ala Ser65 70 75 80Arg Leu Ile Ser Glu Ala Cys Lys Lys His Gly Phe Phe Leu Val Val85 90 95Asn His Gly Ile Ser Glu Glu Leu Ile Ser Asp Ala His Glu Tyr Thr100 105 110Ser Arg Phe Phe Asp Met Pro Leu Ser Glu Lys Gln Arg Val Leu Arg115 120 125Lys Ser Gly Glu Ser Val Gly Tyr Ala Ser Ser Phe Thr Gly Arg Phe130 135 140Ser Thr Lys Leu Pro Trp Lys Glu Thr Leu Ser Phe Arg Phe Cys Asp145 150 155 160Asp Met Ser Arg Ser Lys Ser Val Gln Asp Tyr Phe Cys Asp Ala Leu165 170 175Gly His Gly Phe Gln Pro Phe Gly Lys Val Tyr Gln Glu Tyr Cys Glu180 185 190Ala Met Ser Ser Leu Ser Leu Lys Ile Met Glu Leu Leu Gly Leu Ser195 200 205Leu Gly Val Lys Arg Asp Tyr Phe Arg Glu Phe Phe Glu Glu Asn Asp210 215 220Ser Ile Met Arg Leu Asn Tyr Tyr Pro Pro Cys Ile Lys Pro Asp Leu225 230 235 240Thr Leu Gly Thr Gly Pro His Cys Asp Pro Thr Ser Leu Thr Ile Leu245 250 255His Gln Asp His Val Asn Gly Leu Gln Val Phe Val Glu Asn Gln Trp260 265 270Arg Ser Ile Arg Pro Asn Pro Lys Ala Phe Val Val Asn Ile Gly Asp275 280 285Thr Phe Met Ala Leu Ser Asn Asp Arg Tyr Lys Ser Cys Leu His Arg290 295 300Ala Val Val Asn Ser Lys Ser Glu Arg Lys Ser Leu Ala Phe Phe Leu305 310 315 320Cys Pro Lys Lys Asp Arg Val Val Thr Pro Pro Arg Glu Leu Leu Asp325 330 335Ser Ile Thr Ser Arg Arg Tyr Pro Asp Phe Thr Trp Ser Met Phe Leu340 345 350Glu Phe Thr Gln Lys His Tyr Arg Ala Asp Met Asn Thr Leu Gln Ala355 360 365Phe Ser Asp Trp Leu Thr Lys Pro Ile370 37权利要求
1.一种具有至少一个改善了的生长参数的转基因木本植物，其特征在于编码具有GA 20-氧化酶活性的多肽表达的DNA序列被功能性地插入该植物的基因组中。
2.如权利要求1的转基因木本植物，其特征在于所述改善了的生长参数是提高了的生长速度、生物物质产量和/或木质部纤维长度中的一种。
3.一种具有至少一个改善了的生长参数的转基因杨属木本植物，其特征在于编码具有GA 20-氧化酶活性的多肽表达的DNA序列被功能性地插入该植物的基因组中。
4.如权利要求3的转基因杨属植物，其特征在于所述改善了的生长参数是提高了的生长速度、生物物质产量和/或木质部纤维长度中的一种。
5.一种具有至少一个改善了的生长参数的属于Populus tremula×P.tremuloides的转基因杨属植物，其特征在于编码具有GA 20-氧化酶活性的多肽表达的DNA序列被功能性地插入该植物的基因组中。
6.如权利要求5的转基因杨属植物，其特征在于所述改善了的生长参数是提高了的生长速度、生物物质产量和/或木质部纤维长度中的一种。
7.如权利要求1-6中任意一项的转基因植物的种子。
8.如权利要求1-6中任意一项的转基因植物的细胞。
9.如权利要求1-6中任意一项的转基因植物的繁殖材料。
10.如权利要求1-6中任意一项的转基因植物，其特征在于编码具有GA 20-氧化酶活性的多肽表达的DNA序列是SEQ ID NO1或其同系物。
11.如权利要求7的转基因植物的种子，其特征在于编码具有GA20-氧化酶活性的多肽表达的DNA序列是SEQ ID NO1或其同系物。
12.如权利要求8的转基因植物的细胞，其特征在于编码具有GA20-氧化酶活性的多肽表达的DNA序列是SEQ ID NO1或其同系物。
13.如权利要求9的转基因植物的繁殖材料，其特征在于编码具有GA 20-氧化酶活性的多肽表达的DNA序列是SEQ ID NO1或其同系物。
14.一种增强树木的至少一种生长参数的方法，其特征在于编码具有GA 20-氧化酶活性的多肽表达的DNA序列被功能性地插入该植物的基因组中。
15.如权利要求14的方法，其特征在于所述生长参数是提高了的生长速度、生物物质产量和木质部纤维长度中的一种。
16.如权利要求14的方法，其特征在于编码具有GA 20-氧化酶活性的多肽表达的DNA序列是SEQ ID NO1所示序列或其同系物。
全文摘要
在世界范围内，几乎所有树木育种项目的重要目标都是生产具有提高了的生长速度和茎干体积，以及较短的换茬时间的植物。这样的树木能在每一个单位面积上更多的生物物质。在这里，本发明人业已证实，在杂交白杨(Populus tremula×P.tremuloides)中超量表达植物激素赤霉素(GA)生物合成中的一个关键的调控基因，可以实现诸如生长速度和生物量的有价值的特征的改善。另外，与未改良过的野生型植物相比，这些树木还具有比较长的木质部纤维。在生产强力纸张时，长纤维是非常必要的，但是，一直未能(迄今)证实可以通过传统育种技术影响这一特征。本发明的另外一个优点是，在林业上可以减少使用或不使用对影响生长的化合物。
文档编号C12N5/10GK1416468SQ01806289
公开日2003年5月7日 申请日期2001年3月2日 优先权日2000年3月7日
发明者M·艾利松, T·莫里茨, M·伊斯雷尔松, O·奥尔松 申请人:瑞典树木基因改良公司