专利名称：微生物的培养方法
技术领域：
本发明涉及一种能在短时间内以高产率生产一种具有高的腈水合酶酶活性的培养微生物细胞的方法。
在具有产生腈水合酶能力的微生物中，已知的细菌有如属于诺卡氏(Nocardia)菌属[见日本专利申请公开特许54-129190]，红球菌(Rhodococcus)属[见日本专利申请公开特许2-470]，根瘤菌(Rhizobium)属[见日本专利申请公开特许5-236977]，克霍伯氏菌(Klebsiera)属，[见日本专利申请公开特许5-30982]，气单胞菌(Aeromonas)属[见日本专利申请公开特许5-30983]，农杆菌(Agrobacterium)属[见日本专利申请公开特许8-154691]，芽孢杆菌(Bacillus)属[见日本专利申请公开特许8-187092]，假诺卡氏菌(Pseudonocardia)属[见日本专利申请公开特许8-56684]等。在以上提及的每一个公开例中，都各自描述了一种能产生腈水合酶活性的微生物的培养方法。
此外，对于在培养中使用的碳源，在应用微生物和微生物技术(Applied Microbiology and Biotechololgy)(1991)34783-788中的“碳源的效果”部分描述到“用R.红球菌(rhodochrous)J1生产腈水合酶时，最合适的碳源为2％的葡萄糖。”
为了实现酶的诱导，根据日本专利申请公开特许2-470中描述的方法，向培养液中加入钴离子。可是，要想在短时间内以高产率获得具有腈水合酶舌性的培养的微生物细胞，欲通过使用这样的钴离子浓度而达到有效性和稳定性是有难度的。此外，将大量的钴离子加入到介质中将会引起显著的生长抑制，并且反而不可能在短时间内以高产率得到具有腈水合酶活性的培养的微生物细胞。
另外，为了在短时间内以高产率获得具有腈水合酶活性的培养的微生物细胞，葡萄糖和蔗糖被认为是优选的碳源，并且通常认为在科学上，使用酮醣如果糖或者糖醇如甘露醇是不可能的。
本发明的目的在于提供一种解决了上述问题的并能在短时间内以高产率生产一种具有腈水合酶活性的培养微生物细胞的方法。
本发明的发明人对在工业上能在短时间内以高产率获得具有腈水合酶活性的微生物细胞的培养条件进行了深入的研究，结果发现在培养液中，当有酮醣如果糖和/或糖醇如甘露醇存在时，即使含有大量的钴离子，也可能获得高活性的微生物细胞并且降低由钴离子引起的生长抑制。因此，完成了本发明。
即本发明涉及一种在含有糖醇和/或酮糖以及钴离子的培养基基质中培养一种能产生腈水合酶的微生物。这里，以CoCl2形式的钴离子浓度优选为15mg/L或者更大。此外，糖醇优选为用以下通式(I)表示 其中，n代表2-4的整数。
此外，酮糖由以下通式(II)表示
其中，n代表3。
根据本发明，使用一种糖醇和/或酮糖作为碳源。然而，通常人们却不知道在培养液中存在这些糖化合物能够降低由钴离子引起的生长抑制。
下面将对本发明进行详细描述。
对于本发明中关心的微生物并没有特别的限制，只要他们具有腈水合酶的产生能力即可。特别优选的微生物的例子包括在日本专利审查公布(kokoku)56-17918中描述的诺卡氏菌属(Nocardia sp.)N-775，在日本专利审查公布(kokoku)06-55148中描述的红球菌(Rhodococcus)rhodochrous J-1，在日本专利申请公开特许05-30982中描述的克雷伯(氏)杆菌属(Klebsiella sp.)MCl2609，在日本专利申请公开特许05-30983中描述的气单胞菌属(Aeromonas sp.)MCI2614，在日本专利申请公开特许05-30984中描述的弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacterfreundii)MCI2615，在日本专利申请公开特许05-103681中描述的毛根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)IAM13570和根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)，在日本专利申请公开特许05-161495中描述的Xanthobacter flavas JCM1204，在日本专利申请公开特许05-236975中描述的Erwinia nigrifluens MAFF03-01435、肠杆菌属(Enterobacter sp.)MCI2707，在日本专利申请公开特许05-236976中描述的链霉菌属(Streptomyces sp.)MCI2691，在日本专利申请公开特许05-236977中描述的根瘤菌(Rhizobium sp.)MCI2610、根瘤菌(Rhizobium sp.)MCI2643、根瘤菌激流群落(Rhizobium loti)IAM13588、Rhizobium legminosarum IAM12609和Rhizobium meriotiIAM12611，在日本专利申请公开特许05-15384中描述的Candidaguilliermondii NH-2、Pantoea agglomerans NH-3和肺炎克氏杆菌亚种Pneumoniae(Klebsiella pneumoniae subsp.Pneumoniae)NH-26T2，在日本专利申请公开特许06-14786中描述的农杆菌放射菌(Agrobacterium radiobacter)SC-C15-1，在日本专利申请公开特许07-25494中描述的斯密氏杆菌(Bacillus smithii)SC-J05-1，在日本专利申请公开特许08-56684中描述的嗜热式假诺卡氏菌(Pseudonocardia thermophila)ATCC19285，在日本专利申请公开特许09-275978中描述的嗜热式假诺卡氏菌(Psoudonocardiathermophila)JCM3095。
另外，本发明中关心的微生物也包括可以作为任何宿主的转化株，其中由上述微生物克隆得到的腈水合酶的基因可得以表达。
其中的优选例包括在美国专利5,807,730中描述的使用大肠杆菌(Escherichia coli)作为典型宿主的MT-10822细菌株(FERMBP-5785)。
作为培养基基质，碳源包括了由通式(I)表示的糖醇和/或由通式(II)表示的酮糖。其中，果糖、甘露醇和山梨醇是特别优选的。另外，还可以一种合适的方式来结合使用这些碳源。 (其中，n代表2-4的整数) (其中，n代表3)钴离子可以选自二价或三价的钴盐。例如氯化钴、硫酸钴、乙酸钴、溴化钴和硼酸钴。此外，维生素B12等也可作为钴源。并且，以CoCl2形式的钴离子浓度为15mg/L或者更大，优选为15-300mg/L。
在制备培养基时，选用的氮源如氨、硫酸铵、氯化铵、硝酸铵；选用的有机营养源如酵母提取物、肉提取物、麦芽提取物、胨和大豆水解产物选月的无机盐如磷酸盐、镁盐、钾盐、钠盐、铁盐、钴盐和其他微量金属盐。当需要时，可以加入酶诱导剂如尿素或其衍生物。
此外，在需要的情况下，可以在培养时，按分加入碳源、钴离子或其类似物。
在培养时，pH值通常维持在5-10，优选为7-10。培养温度通常为25-50C，优选为30-40℃，并且培养在需氧下持续1-3天。
(1)培养微生物①预培养的条件(培养基组成)果糖2％(w/v)、聚合胨5％(w/v)(Nihon Pharmaceuticai Co.，Ltd.)、酵母提取物0.3％(w/v)(Oriental Yeast Co.，Ltd.)、KH2PO40.1％(w/v)、K2HPO40.1％(w/v)、MgSO4·7H2O 0.1％(w/v)pH7(培养方法)将100ml介质分散到500ml的锥形烧瓶中，并用棉花塞封住瓶口。培养基在高压灭菌器中于121℃下灭菌20分钟。然后，将Rhodococcusrhodochrous J-1菌株(FERM BP-1478)接种于其中，并将混合物在30℃下进行振荡培养48小时。
②主培养条件(培养基组成)初培养基酵母提取物0.2％(w/v)、KH2PO40.1％(w/v)、K2HPO40.1％(w/v)、MgSO4·7H2O 0.1％(w/v)、CoCl2·6H2O 0.002％(w/v)、硫酸铵0.025％(w/v)、果糖2％(w/v)、尿素2％(w/v)、乙醇0.4％(v/v)、聚丙二醇与环氧乙烷的加聚物(聚醚)L61 0.1％(w/v)(Asahi Denka KogyoK.K.)，pH7后加培养基果糖20％(w/v)，乙醇5％(v/v)，硫酸铵6％(w/v)，pH6.5。
(培养方法)将2升初培养基分散到3升的微型发酵缸(Takasügi Seisaküsho)中，并在高压灭菌器中于121℃下灭菌20分钟。但与上述不同的是，果糖、乙醇和尿素被无菌过滤(使用0.45微米滤纸，由Advantec Toyo Kaisha，Ltd.制造)，然后再加入到培养基中。在上述的预培养结束后，将20ml的预培养液接种于其中，将得到的培养基在30℃下，在缸内压力为0.098Mpa，搅拌速率为600rpm，空气流量为1vvm和pH7的条件下培养44小时。
此外，从开始培养的第20小时开始以20ml/hr的流速加入后加培养基直到培养结束。
(2)腈水合酶活性的确定将0.1ml的培养液和4.90ml的1/20M的磷酸盐缓冲液(pH7.7)混合，然后，再加入5ml含有5.0％(w/v)的丙烯腈的1/20M的磷酸盐缓冲液(pH7.7)，混合物在10℃下反应10分钟。反应结束后，离心过滤和分离微生物细胞。用气相色谱(GC-14B，由Shimadzu公司制造)对浮于上层的丙烯酰胺进行定量。分析测试条件如下使用填充了Porapack Ps(柱填充材料由Waters公司制造)的1m玻璃柱；柱温为230℃；在250℃下使用FID检测器检测。
下面，在上述活性确定中的一个单位的酶活性被定义为在1分钟内，1μmol的丙烯腈转化为丙烯酰胺的转化量。对于这种活性，对每一种培养液和每一种微生物细胞都进行了研究。结果显示于表1中。在表中，取含有0.002％(w/v)的CoCl2·6H2O的培养条件下的活性值为100，在其他培养条件下的活性值为相对活性值(％)。
实施例2-5在与实施例1相同的条件下进行，与之不同的是向主培养基中加入的CoCl2·6H2O的浓度不是0.002％(w/v)，对实施例2，此浓度为0.005％(w/v)，对实施例3，此浓度为0.01％(w/v)，对实施例4，此浓度为0.02％(w/v)，对实施例5，此浓度为0.03％(w/v)。结果示于表1。
实施例6和7在与实施例3相同的条件下进行，与之不同的是同时使用了预培养和主培养基，且向其中加入了甘露醇(实施例6)或山梨醇(实施例7)而不是果糖。结果示于表1。
对比实施例1在与实施例1相同的条件下进行，与之不同的是同时使用了预培养和主培养基，而且向其中加入葡萄糖而不是果糖。结果示于表1。
对比实施例2-5在与对比实施例1相同的条件下进行，与之不同的向主培养基中加入的CoCl2·6H2O的浓度不是0.002％(w/v)，而是对比实施例2为0.005％(w/v)，对比实施例3为0.01％(w/v)，对比实施例4为0.02％(w/v)，对比实施例5为0.03％(w/v)。结果示于表1。
实施例8在与实施例1相同的条件下进行，与之不同的是使用的菌株是诺卡氏菌属(Nocardia sp.)N-775菌株(保藏号FERM BP-961)，而不是Rhodococcus rhodochrous J-1菌株。结果示于表2。
实施例9在与实施例8相同的条件下进行，与之不同的是使用的主培养基中加入的CoCl2·6H2O的浓度是0.01％(w/v)，而不是0.002％(w/v)。结果示于表2。
实施例10和11与实施例9相同的条件下进行，与之不同的是同时使用了预培养和主培养基，且向其中加入了甘露醇(实施例10)或山梨醇(实施例11)而不是果糖。结果示于表2。
对比实施例6在与实施例8相同的条件下进行，与之不同的是同时使用了预培养和主培养基，且向其中加入葡萄糖而不是果糖。结果示于表2。
对比实施例7在与对比实施例6相同的条件下进行，与之不同的是使用的主培养基中加入的CoCl2·6H2O的浓度是0.01％(w/v)，而不是0.002％(w/v)。结果示于表2。
表1每种微生物细 每种培养液糖 CoCl2浓度胞活性活性实施例1 果糖0.002100 100实施例2 果糖0.005215 195实施例3 果糖0.01 252 229实施例4 果糖0.02 259 230实施例5 果糖0.03 259 231实施例6 甘露醇 0.01 250 252实施例7 山梨醇 0.01 259 247对比实施例1 葡萄糖 0.002100 18对比实施列2 葡萄糖 0.005100 16对比实施例3 葡萄糖 0.01 486对比实施例4 葡萄糖 0.02 373对比实施例5 葡萄糖 0.03 7 0.2表2每种微生物每种培养液糖 CoCl2浓度细胞活性 活性实施例8 果糖 0.002100 100实施例9 果糖 0.01 207 188实施例10 甘露醇 0.01 217 197实施例11 山梨醇 0.01 230 209对比实施例6 葡萄糖 0.0028315对比实施例7 葡萄糖 0.01 5510 (1)培养微生物①预培养的条件(培养基组成)聚合胨1％(w/v)、酵母提取物0.5％(w/v)、NaCl 0.5％(w/v)、氨比西林-Na 100μg/ml，pH7(LB培养基)(培养方法)将100ml培养基分散到500ml的锥形烧瓶中，并用棉花塞封住瓶口。
培养基在高压灭菌器中于121℃下灭菌20分钟。然后，将MT-10822菌株(FERM BP-5785)接种于其中，并将混合物在37℃下进行振荡培养6小时。
②主培养条件(培养基组成)酵母提取物0.5％(w/v)、聚合胨2％(w/v)、NaCl 0.06％(w/v)、KCl 0.02％(w/v)、MgCl2·6H2O 0.2％(w/v)、CoCl2·6H2O 0.002％(w/v)、MgSO4·7H2O 0.243％(w/v)、果糖4％(w/v)、聚丙二醇与环氧乙烷的加聚物(聚醚)L61 0.02％(w/v)，pH7(培养方法)将2升初培养基分散到3升的微型发酵缸中，并在高压灭菌器中于121℃下灭菌20分钟。但与上述不同的是，果糖和MgSO4·7H2O被无菌过滤(使用0.45微米滤纸，由Advantec Toyo Kaisha，Ltd.制造)，然后再加入到培养基中。在上述的预培养结束后，将20ml的培养液接种于其中，将得到的培养基在37℃下，在缸内压力为0.025Mpa，搅拌速率为800rpm，空气流量为1vvm和pH7的条件下培养12小时。
(2)腈水合酶活性的确定腈水合酶活性的确定用与实施例1(2)中相同的方法进行测试。对于这种活性，对每一种培养液和每一种微生物细胞都进行了研究。结果显示于表3中。在表中，取含有0.002％(w/v)的CoCl2·6H2O的培养条件下的活性值为100，在其他培养条件下的活性值为相对活性值(％)。
实施例13与实施例12相同的条件下进行，与之不同的是使用的主培养基中加入的CoCl2·6H2O的浓度是0.01％(w/v)，而不是0.002％(w/v)。结果示于表3。
实施例14和15与实施例13相同的条件下进行，与之不同的是在使用的主培养基中加入了甘露醇(实施例14)或山梨醇(实施例15)而不是果糖。结果示于表3。
对比实施例8在与实施例12相同的条件下进行，与之不同的是在使用的主培养基中加入葡萄糖而不是果糖。结果示于表3。
对比实施例9在与对比实施例8相同的条件下进行，与之不同的是使用的主培养基中加入的CoCl2·6H2O的浓度是0.01％(w/v)，而不是0.002％(w/v)。结果示于表3。
表3每种微生物每种培养液糖 CoCl2浓度细胞活性 活性实施例12果糖 0.002 100 100实施例13果糖 0.01 342 363实施例14甘露醇0.01 528 113实施例15山梨醇0.01 436 363对比实施例8 葡萄糖0.002 8787对比实施例9 葡萄糖0.01 3835工业应用性在培养一种能产生腈水合酶活性的微生物过程中，酮醣如果糖，糖醇如甘露醇的使用能够降低在该过程中由于使用钴离子而引起的生长抑制。结果，就可能在短时间内以高产率获得具有腈水合酶活性的微生物细胞。
权利要求
1.一种在含有糖醇和/或酮糖以及钴离子的培养基基质中培养一种能够产生腈水合酶的微生物的方法。
2.根据权利要求1所述的方法，其中糖醇由通式(I)表示 其中，n代表2-4的整数。
3.根据权利要求1所述的方法，其中的酮糖由通式(II)表示 其中，n代表3。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中CoCl2形式的钴离子浓度为15mg/L或者更大。
全文摘要
在培养一种能够产生腈水合酶的微生物时，当有至少一种酮糖，如果糖，和一种糖醇，如甘露醇存在下，由钴离子引起的生长抑制将会被阻止，因此可以在高浓度下获得高活性的产物。
文档编号C12N1/32GK1419596SQ01807072
公开日2003年5月21日 申请日期2001年3月21日 优先权日2000年3月21日
发明者龙野孝一郎, 小林悦子 申请人:三菱丽阳株式会社