一种神经干细胞制剂、其制备方法及其用途的制作方法

专利名称：一种神经干细胞制剂、其制备方法及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种神经干细胞制剂、其制备方法以及在作为治疗人类脊髓疾病，属于生物制品领域。
背景技术：
人类脊髓疾病主要分为两大类，①运动神经元病(Motor neuron disease，MND)，运动神经元病是一组主要累及上下两级运动神经元的慢性变性疾病。由于受损部位不同，可分为下运动神经元型(进行性脊肌萎缩及进行性延髓麻痹)，上运动神经元型(原发性侧索硬化)，混合型(肌萎缩侧索硬化)等多种综合征。病程一般1-7年，平均5年。②原发和继发性脊髓损伤。原发脊髓损伤是指创伤本身造成的灰质和白质受损，神经通路中断；继发脊髓损伤是指创伤引起了局部一系列生化改变，使组织缺血、缺氧，膜脂质过氧化，最终导致脊髓细胞死亡或退变。脊髓损伤患者失去了自主运动，伴随着不自主的肌肉痉挛发作，肢体感觉平衡丧失，失去了自律的呼吸，血压，排尿，内脏运动，伴随着性功能的障碍，脊髓损伤导致神经元的缺失，上行下行纤维传导中断。据统计资料显示，在美国原发性脊髓损伤发病率约40例/100万，将近每年新增加11000例，不包括当场死亡的。原发性脊髓损伤的发病原因中，位居首位的是车祸伤，其次是暴力伤，主要是枪击伤。脊髓损伤患者生活质量极低，使家庭，乃至于社会承受着巨大的经济和精神负担。
目前，运动神经元病临床尚无有效的治疗方法，死亡率高达80-90％，患者最终由于呼吸肌麻痹，呼吸衰褐死亡；对于原发和继发性脊髓损伤，除了急性期内的临床复位固定手术外，只有使用一些神经营养因子，或做康复训练治疗，但均不能彻底恢复病人的生理功能，使病人的生活恢复至常人水平。
近年来，随着干细胞研究的不断深入以及越来越多的神经生长因子的发现，移植胚胎和成人的神经干细胞，应用神经生长因子以促进脊髓神经细胞再生、修复和重建，已成为脊髓疾病治疗的基础研究领域的重大课题，为脊髓运动神经元退行性变和脊髓损伤的临床治疗带来了新的曙光。Sally Temple在Nature杂志上发表文章The development of neural stem cells，认为神经干细胞可以为损伤的脊髓提供一种基质，使再生的脊髓神经纤维得以通过损伤区域，再建脊髓功能。
但是到目前为止还没有公开的文献报道神经干细胞制剂及其制备方法。

发明内容
本发明的目的在于公开一种神经干细胞制剂，所述神经干细胞制剂植入动物体内后，不用免疫抑制剂或在少量免疫抑制剂的辅助治疗下，可以在自体生理微环境下分化形成一种类似于schwann细胞样的细胞，通过使髓鞘再生而使脊髓功能获得重建。
本发明的另一目的在于公开一种神经干细胞制剂的制备方法，这种方法原料丰富，制备过程中无污染危险，方法简单。
本发明的另一目的在于公开一种神经干细胞制剂在作为治疗人类脊髓疾病，特别是运动神经元病药物方面的用途。
本发明的再一目的在于公开一种神经干细胞制剂在治疗脊髓疾病中的用途。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为一种神经干细胞制剂及其制备方法，采用从人胚胎脑组织中分离培养的神经干细胞，在体外传3-6代，并在传代过程中纯化神经干细胞，得到108细胞数量的神经干细胞制剂。
具体地说，本发明所述的神经干细胞制剂采用人胚胎脑组织，用消化液消化后加入试剂中止消化，离心后用培养基吹打为单细胞悬液，在5％CO2、37℃下培养。经过体外培养，筛选出神经干细胞球，即得到神经干细胞。
其中，所述人胚胎脑组织可以为室管膜下区(SVZ)、海马、中脑组织或视网膜。
所述的消化液可以采用的胰蛋白酶+的EDTA、胰蛋白酶或胶原酶中的一种；其中胰蛋白酶0.1wt％-0.5wt％、胶原酶150u/ml-250u/ml，EDTA的用量为0.005-0.02％。优选消化液为胰蛋白酶0.25％或0.25％胰蛋白酶+0.01％EDTA。
所述的中止消化的培养基可以采用DMEM/F12+10-20V％胎牛血清、DMEM+10-20V％胎牛血清中的一种；优选采用DMEM/F12+10-20V％胎牛血清。培养基的用量为25-70ml所述的培养基也可以为含有添加剂N2或B27的DMEM/F12、(N2、B27分别为GiBco公司，Sigma公司市售商品)。
体外培养的培养基为下述组合物(1)N2添加剂， 0-1ml N2/100ml培养基或B27添加剂，0-1ml B27/100ml培养基DMEM/F12 8-20mg/ml(2)bFGF(碱性成纤维细胞生长因子) 10-20ng/ml(3)EGF(表皮生长因子)10-20ng/ml(4)transferring(转铁蛋白) 0.05-0.5mg/ml
(5)Sodium Selenite(硒酸钠) 2-10ng/ml(6)Putresine(腐胺) 5-10μg/ml(7)Insulin(胰岛素) 0.01-0.05mg/ml(8)L-Glutamine(谷氨酸胺) 0.1-0.5mg/ml(9)Progerterone(孕酮)5.0-10ng/ml(10)抗生素庆大霉素 800-1300U/ml。
所述的培养条件为每3-5天换一次液(培养基)。在CO2，37℃下继续培养传至第三-六代即获得神经干细胞制剂。
人胚胎脑各区形成神经细胞球的时间大约为2-7天，具体为室管膜下区(SVZ)2-3天、海马3-5天、中脑组织5-7天、视网膜1-2天。
本发明的神经干细胞经形态学检测可以看到细胞成球状生长，染色体核型检测SVZ区获得，并经培养得到的第三代神经干细胞染色体数量为46条，核型正常；免疫组化检测第三代神经干细胞的nestin表达，可见大部分细胞呈nestin阳性表达；细胞周期检定可以得出，第二代、第三代细胞中S期细胞数量所占比例逐渐增大，S期是细胞进行DNA复制的阶段，该期细胞数量增加表明细胞增殖能力旺盛；动物试验表明本发明的神经干细胞制剂可以作为药物有效治疗脊髓损伤。
本发明的神经干细胞制剂植入动物体内，不用免疫抑制剂或在少量免疫抑制剂的辅助治疗下，神经干细胞可以在自体生理微环境下分化形成一种类似于schwann细胞样的细胞，使髓鞘再生，脊髓功能获得重建，可以作为药物用于治疗人类脊髓疾病，特别是运动神经元病。本发明方法简单，产量高，每次可以得到108细胞数量的神经干细胞制剂，如果以每人治疗用量为106个单位，那么本发明每批产品可以用于治疗100例患者。
下面结合附图和实施例详细描述本发明，所述的实施例是用于描述本发明而不是限制本发明。


图1为人胚胎脑分离培养SVZ区神经干细胞球；图2为SVZ区第三代神经干细胞球；图3为SVZ神经干细胞体外培养第三代细胞染色体核型分析；图4为第三代神经球Confocal检测nestin表达；图5为BrdU掺入后，具有增殖能力的细胞表达BrdU；图6a为SVZ区神经干细胞第一代应用流式细胞仪检测细胞周期的结果；
图6b为SVZ区神经干细胞第二代应用流式细胞仪检测细胞周期的结果；图6c为SVZ区神经干细胞第三代应用流式细胞仪检测细胞周期的结果；图6d为人SVZ神经干细胞传代细胞的细胞培养周期分析；图7为脊髓损伤后运动诱发电位；图8为脊髓损伤模型1周的MEP结果；图9为脊髓损伤模型3周的MEP结果；图10为脊髓损伤模型4周的MEP结果；图11为移植后BBB评分结果；图12a、b、c为大鼠神经干细胞移植术前术后的照片；图13a、b为冰冻切片显示移植3周后脊髓内有预先进行Hoechst标记的神经干细胞的示意图。
具体实施例方式
下面是本发明的具体实施例，其中除通用试剂外，均购自Sigma或GiBco公司。
实施例1从11周死亡胎儿脑中，分离室管膜下区(SVZ)，用0.01％EDTA和0.25％胰酶消化液消化3分钟，加50ml含10％的胎牛血清的DMEM/F12培养基终止消化，离心后用培养基吹打为单细胞悬液，5％CO2、37℃培养。
体外培养，筛选出神经干细胞球，即神经干细胞。室管膜下区(SVZ)2-3天形成神经细胞球。
培养基条件为(1)DMEM/F12 12mg/ml(2)bFGF(碱性成纤维细胞生长因子) 10ng/ml(3)EGF(表皮生长因子)20ng/ml(4)transferring(转铁蛋白) 0.1mg/ml(5)Sodium Selenite(硒酸钠)5.2ng/ml(6)Putresine(腐胺)9.6μg/ml(7)Insulin(胰岛素)0.025mg/ml(8)L-Glutamine(谷氨酸胺)0.3mg/ml(9)Progerterone 6.3ng/ml(10)抗生素庆大霉素1000U/ml
每3-5天换一次液。CO2，37℃继续培养传至第三代即获得神经干细胞制剂。进行检测，检测方法及结果见实验例。
实施例2从15周死亡胎儿脑中，分离海马组织，用0.20％的胰蛋白酶消化液消化4分钟，加70ml含20％的胎牛血清的DMEM/F12培养基终止消化，1200RPM，10min离心后加培养基机械吹打为单细胞悬液培养，5％CO2、37℃培养。
体外培养，筛选出神经干细胞球，即神经干细胞。海马组织5天形成神经细胞球。传3代。
培养基条件为(1)DMEM/F12(Hyclone) 20mg/ml(2)bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)15ng/ml(3)EGF(表皮生长因子) 10ng/ml(4)transferring(转铁蛋白)0.5mg/ml(5)Sodium Selenite(硒酸钠) 2ng/ml(6)Putresine(腐胺) 7μg/ml(7)Insulin(胰岛素) 0.05mg/ml(8)L-Glutamine(谷氨酸胺) 0.1mg/ml(9)Progerterone(孕酮)10ng/ml(10)抗生素庆大霉素 800U/ml每3天换一次液。CO2，37℃继续培养传至第三代即获得神经干细胞制剂。
检测方法及结果见实验例。
实施例3从14周死亡胎儿脑中，分离中脑组织，用200u/ml的胶原酶消化液消化3分钟，加30ml含15％的胎牛血清的DMEM培养基终止消化，1200RPM，10min离心后加培养基机械吹打为单细胞悬液培养，5％CO2、37℃培养。
体外培养，筛选出神经干细胞球，即神经干细胞。中脑组织7天形成神经细胞球。传5代。
培养基条件为(1)DMEM/F12(Hyclone) 8mg/ml(2)bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)20ng/ml
(3)EGF(表皮生长因子) 15ng/ml(4)transferring(转铁蛋白)0.05mg/ml(5)Sodium Selenite(硒酸钠) 10ng/ml(6)Putresine(腐胺) 5μg/ml(7)Insulin(胰岛素) 0.01mg/ml(8)L-Glutamine(谷氨酸胺) 0.5mg/ml(9)Progerterone(孕酮)5.0ng/ml(10)抗生素庆大霉素 1300U/ml每3-5天换一次液。CO2，37℃继续培养传至第三代即获得神经干细胞制剂。
检测方法及结果见实验例。
实施例4从18周死亡胎儿脑中，分离视网膜组织，用0.20％胰蛋白酶+0.01％EDTA消化液消化5分钟，加含10％胎牛血清DMEM/F12，N2培养基终止消化，1200RPM，10min离心后加培养基机械吹打为单细胞悬液培养，5％CO2、37℃培养。
体外培养，筛选出神经干细胞球，即神经干细胞。视网膜组织1天形成神经细胞球。
每3-5天换一次液。CO2，37℃继续培养传至第三代即获得神经干细胞制剂。
检测方法及结果见实验例。
实施例5同实施例1，不同之处在于消化液采用0.005％EDTA，0.5％胰酶，加20％的胎牛血清的DMEM/F12培养基终止消化，体外培养的培养基中加入1ml B27/100ml培养基传至第六代即获得神经干细胞制剂。
实施例6同实施例2，不同之处在于消化液采用0.5％的胰蛋白酶，加含20％的胎牛血清DMEM/F12 B27培养基终止消化，5天传至第四代形成神经细胞球。
实施例7同实施例3，不同之处在于消化液采用250u/ml的胶原酶，加含12％的胎牛血清的DMEM培养基终止消化，5天传至第5代形成神经细胞球。
实施例8同实施例4，培养基为40ml DMEM/F12加N2，N2与DMEM/F12的比为1∶99(wt)。培养传至第六代即获得神经干细胞制剂。
实施例9同实施例1，不同之处在于消化液采用0.001％EDTA和0.1％胰酶消化液消化10分钟，加含10％的胎牛血清的DMEM/F12培养基终止消化。传至第五代即获得神经干细胞制剂。
实施例10同实施例9，不同之处在于所述培养基为50ml DMEM/F12加B27，B27与DMEM/F12的比为1∶99(wt)。
实施例11同实施例3，不同之处在于所述培养基为(1)N2添加剂， 1ml N2/100ml培养基DMEM/F12 18mg/ml培养基条件为(1)DMEM/F12(Hyclone)8mg/ml(2)bFGF(碱性成纤维细胞生长因子) 20ng/ml(3)EGF(表皮生长因子)15ng/ml(4)transferring(转铁蛋白) 0.05mg/ml(5)Sodium Selenite(硒酸钠)10ng/ml(6)Putresine(腐胺)5μg/ml(7)Insulin(胰岛素)0.01mg/ml(8)L-Glutamine(谷氨酸胺)0.5mg/ml(9)Progerterone(孕酮) 5.0ng/ml(10)抗生素庆大霉素1300U/ml实验例1.形态学检测图2为SVZ区第三代培养细胞照片，可以看到细胞成球状生长。
2.染色体核型检测由图3中可以看到SVZ区获得，并经培养得到的第三代神经干细胞染色体数量为46条，核型正常。
免疫组化检测Confocal检测第三代神经干细胞的nestin表达，可见图4中大部分细胞呈nestin阳性表达。
细胞周期检定BrdU掺入(图5)证明体外培养的神经干细胞具有增值能力，应用流式细胞仪检测SVZ区的传代细胞的细胞周期，进而判定细胞增殖能力。流式细胞仪通过监察细胞DNA含量的不同，从而区分细胞所处的不同细胞周期阶段，并计算各阶段细胞数量；图6a、6b、6c分别为SVZ区神经干细胞第一、二、三代应用流式细胞仪检测细胞周期的结果。图6d为人SVZ神经干细胞传代细胞的细胞培养周期分析，从图6a、6b、6c、6d可以得出，第二代、第三代细胞中S期细胞数量所占比例逐渐增大，S期是细胞进行DNA复制的阶段，该期细胞数量增加表明细胞增殖能力旺盛。
3.动物试验鉴定通过移植人神经干细胞治疗大鼠脊髓损伤模型，验证神经干细胞制剂治疗脊髓损伤的疗效。一实验步骤1.动物分组选用SD大鼠，雌性，体重230-260g。采用改良Allen法(重物坠落法)进行脊髓损伤模型制作，损伤强度为5g×15cm，损伤部位胸椎10。完全截瘫为24只，部分截瘫为42只，模型成功率为60％左右。
A组空白对照组，只进行椎板切除。
B组实验对照组，进行脊髓损伤模型制作，不进行细胞移植治疗。
C组实验组，模型制作，移植神经干细胞制剂治疗。
2.细胞移植采用微注射法，5-10×104/μl，3-4μl/只。
3.检测指标形态学指标有冰冻切片，观察脊髓内有无神经干细胞和其分化细胞的存在。
功能学指标有神经电生理检查和BBB神经功能评分。二实验结果实验动物分别于移植后3周和4周时取材。
1.参见图13，冰冻切片显示移植3周后脊髓内有预先进行Hoechst标记的神经干细胞，说明细胞移植方法是成功的。图13a、b上有荧光的就是染有Hoechest的细胞。
进一步的免疫组化染色可以证实干细胞分化的细胞类型。
2.神经电生理检查采用运动诱发电位(MEP)来反映脊髓神经传导的情况，是脊髓神经功能恢复最敏感的指标。
脊髓损伤后的MEP结果见图7。
脊髓损伤模型1周，损伤强度5g×15cm，损伤部位T10，BBB评分1/0，参见图8。
脊髓损伤模型3周(神经干细胞移植前)，损伤强度5g×15cm，损伤部位T10，BBB评分4/4，参见图9。
脊髓损伤模型进行神经干细胞移植后4周行运动诱发电位检查(C1组，BBB评分7/5)，图示右下肢可记录到电活动，但潜伏期延长，波幅减低，参见图10。
脊髓损伤模型进行神经干细胞移植后4周行运动诱发电位检查(C组，BBB评分6/3)，图示双下肢可记录到电活动，但潜伏期延长，波幅减低。
3.BBB神经功能评分采用BBB评分来判断细胞移植后脊髓运动功能恢复的情况。移植神经干细胞制剂和伪移植组于的大鼠，分别于1周、3周和4周评分，对照组也是。
移植后BBB评分结果图示如下BBB评分表(取各组在移植后不同时间段的BBB神经功能评分与移植前的评分的差取平均值)

注A组空白对照组，只进行椎板切除。
B组实验对照组，进行脊髓损伤模型制作，不进行细胞移植治疗。
C组实验组，模型制作，移植神经干细胞制剂治疗。
图11中显示各组在移植后不同时间段的BBB神经功能评分的变化，其中C组持续保持增长的趋势。
图12表明脊髓损伤后大鼠经干细胞移植后一至四周后基本恢复。
图12a正常大鼠。
图12b脊髓中度损伤大鼠。
图12c干细胞移植后一周干细胞移植后四周大鼠。
图13a、b为冰冻切片显示移植3周后脊髓内有预先进行Hoechst标记的神经干细胞的示意图。
权利要求
1.一种神经干细胞制剂，采用从人胚胎脑组织中分离培养的神经干细胞，在体外传3-6代，并在传代过程中纯化神经干细胞，得到的神经干细胞制剂。
2.根据权利要求1所述的一种神经干细胞制剂，其特征在于所述人胚胎脑组织用消化液消化后加入培养基中止消化，离心后加入培养基机械吹打为单细胞悬液，在CO2、37℃下经过体外培养，筛选出神经干细胞球，即得到神经干细胞。
3.根据权利要求2所述的一种神经干细胞制剂，其特征在于所述所述的消化液可以采用的胰蛋白酶+的EDTA、胰蛋白酶或胶原酶中的一种；其中胰蛋白酶用量为0.1wt％-0.5wt％、胶原酶150u/m1-250u/m1，EDTA的用量为0.005-0.02wt％；优选消化液为胰蛋白酶0.25％或0.25％胰蛋白酶+0.01％EDTA；所述的中止消化的培养基为DMEM/F12+10-20V％胎牛血清、DMEM+10-20V％胎牛血清中的一种，培养基的用量为25-70ml；优选采用DMEM/F12+10-20V％胎牛血清；所述的体外培养的培养基为下述组合物(1)N2添加剂， 0-1ml N2/100ml培养基或B27添加剂，0-1ml B27/100ml培养基DMEM/F12 8-20mg/ml(2)bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)10-20ng/ml(3)EGF(表皮生长因子)10-20ng/ml(4)transferring(转铁蛋白) 0.05-0.5mg/ml(5)Sodium Selenite(硒酸钠)2-10ng/ml(6)Putresine(腐胺)5-10μg/ml(7)Insulin(胰岛素)0.01-0.05mg/ml(8)L-Glutamine(谷氨酸胺)0.1-0.5mg/ml(9)Progerterone(孕酮) 5.0-10ng/ml(10)抗生素庆大霉素 800-1300U/ml。
4.根据权利要求2所述的一种神经干细胞制剂，其特征在于所述的中止消化的培养基为含有添加剂N2或B27的DMEM/F12。
5.根据权利要求2所述的一种神经干细胞制剂，其特征在于所述的培养条件为每3-5天换一次培养基，在5％CO2，37℃下继续培养传至第3-6代。
6.根据权利要求1所述的一种神经干细胞制剂，其特征在于所述人胚胎脑组织可以为室管膜下区、海马、中脑组织或视网膜。
7.一种神经干细胞制剂的制备方法，其特征在于采用从人胚胎脑组织中分离培养的神经干细胞，在体外传3-6代，并在传代过程中纯化神经干细胞，得到的神经干细胞制剂。
8.根据权利要求7所述的一种神经干细胞制剂的制备方法，其特征在于人胚胎脑组织用消化液消化后加入培养基中止消化，离心后加入培养基机械吹打为单细胞悬液，在CO2、37℃下经过体外培养，筛选出神经干细胞球，即得到神经干细胞。
9.根据权利要求8所述的一种神经干细胞制剂的制备方法，其特征在于所述所述的消化液可以采用的胰蛋白酶+的EDTA、胰蛋白酶或胶原酶中的一种；其中胰蛋白酶用量为0.1wt％-0.5wt％、胶原酶150u/ml-250u/ml，EDTA的用量为0.005-0.02wt％；优选消化液为胰蛋白酶0.25％或0.25％胰蛋白酶+0.01％EDTA；所述的中止消化的培养基为DMEM/F12+10-20V％胎牛血清、DMEM+10-20V％胎牛血清中的一种，培养基的用量为25-70ml；优选采用DMEM/F12+10-20V％胎牛血清；所述的体外培养的培养基为下述组合物(1)N2添加剂，0-1ml N2/100ml培养基或B27添加剂， 0-1ml B27/100ml培养基DMEM/F128-20mg/ml(2)bFGF(碱性成纤维细胞生长因子) 10-20ng/ml(3)EGF(表皮生长因子) 10-20ng/ml(4)transferring(转铁蛋白)0.05-0.5mg/ml(5)Sodium Selenite(硒酸钠) 2-10ng/ml(6)Putresine(腐胺) 5-10μg/ml(7)Insulin(胰岛素) 0.01-0.05mg/ml(8)L-Glutamine(谷氨酸胺) 0.1-0.5mg/ml(9)Progerterone(孕酮)5.0-10ng/ml(10)抗生素庆大霉素800-1300U/ml。
10.权利要求1-6任何一项所述的一种神经干细胞制剂，作为药物在治疗脊髓损伤上的用途。
全文摘要
本发明公开了一种神经干细胞制剂及其制备方法，是采用人胚胎脑组织用消化液消化后加入培养基中止消化，离心后机械吹打为单细胞悬液，加入培养基，在CO
文档编号C12N5/0797GK1435187SQ02100859
公开日2003年8月13日 申请日期2002年2月1日 优先权日2002年2月1日
发明者沈丽, 李凌松, 张浣清, 李肖霞 申请人:北京科宇联合干细胞生物技术有限公司