专利名称：可表达外源性基因的人神经干细胞及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种人神经干细胞和基因治疗相结合的方法，具体涉及人神经干细胞的分离和克隆及外源性基因转移入神经干细胞的方法。
神经干细胞是具有自身更新和多潜能分化能力的一类神经细胞，它对治疗脑、脊髓损伤，脑中风和神经变性性疾病如帕金森氏病等具有潜在的治疗价值。神经干细胞分布于胚胎发育中的神经系统，并定点存在于成年哺乳类动物的脑神经组织中。神经干细胞亦可从胚胎干细胞(ES Cells)或非神经组织诱导培养。神经干细胞研究不仅可为临床多种神经系统疾病的治疗提供新的途径，而且还可推动人们对细胞跨系分化(trans-differetiation)的发育调控和脑学习记忆功能的细胞分子基础等生物学研究进行新的探索。目前神经干细胞或神经祖细胞的分离方法有下列几种1、从畸胎瘤和神经肿瘤的细胞中分离，如NTERA-2细胞系；2、用永生化基因转化神经细胞，常用V-myc基因；3、用b-FGF、EGF和LIF(白血病抑制因子)等生长因子作为刺激分裂因子维持神经干细胞生存；4、用β-微管蛋白启动子和神经巢蛋白启动子基因操作标记分离人神经干细胞。上述方法中存在致癌的危险因素或分离克隆成功率低。
本发明的目的是提供一种可表达外源性基因的人神经干细胞及其制备方法。
本发明采用Hoechst33342四步骤法分离和克隆人胚神经干细胞FZ-B9和FZ-B7。为了使神经干细胞能表达外源性基因，采用重组腺病毒相关病毒载体(rAAV)为载体将标记性基因LacZ基因(市售)和治疗性基因胶质细胞起源的神经营养因子(GDNF)基因(U.S.A GeneBank)转移入神经干细胞。从而将干细胞治疗和基因治疗相结合。
本发明制备方法包括下述步骤一、神经干细胞的产生和培养本发明遵守医学伦理原则。使用中国人胎龄为7周和9周的流产胚胎组织在无菌条件下收集并保存在4℃磷酸氢钠缓冲液(PBS Ph7.4)中。分离出前脑组织，并制备成细胞悬液和细胞团块的半混合状态加入到用多聚赖胺酸(PLL)预制表面的培养板(Costar)中，使用DMEM/F12/N2培养液(GibcoBRL)，其中含有人胰岛素25ng/ml，人转铁蛋白100μg/ml，人前列腺素20nM，谷胺酰氨2nM，葡萄糖6％，丁二胺60μM，氯化硒30nM，碳酸氢钠3mM，HEPES 5mM，肝素2μg/ml。9周胚胎细胞原代培养液加有10％胎牛血清(FCS)，原代细胞培养12小时后贴壁，部分细胞形成神经球体样。第三天后原代培养换为无血清培养液。7周胚胎细胞开始即为无血清培养，呈半悬浮状态生长。在含有bFGF和EGF的无血清条件下培养10-14天后，部分细胞死亡，部分球体样细胞生长旺盛，用吸管吹打分散后可传代培养。
二、神经干细胞的分离和克隆(1)将培养板中形成球体样形态的细胞在倒置显微镜下用微量吸管分离出来至上述培养液中，其中多富含干细胞成份；(2)从原代细胞开始在培养液中加入人碱性纤维母细胞生长因子(bFGF)20ng/ml(R&D Systems,USA)和人表皮生长因子(EGF)20ng/ml(R&D)，促进细胞分裂增殖；(3)使用Hoechst33342进行荧光流式细胞分离(FACS)。因Hoechst33342荧光物质可结合到富含C-G碱基的细胞DNA上，干细胞具有将这种Hoechst33342泵出细胞的能力，从而可分离出SP细胞(Side population，边际细胞)。在细胞培养液中加入5ng/ml荧光染料Hoechst33342(Sigma)和2％FCS以及HEPES 1mM，37℃温育1.5小时后保存在冰中。然后使用FACS流式细胞分离仪(Bector Dickinson,San Jose.CA)。Hoechst33342的激发光波长为350nm，使用450Bp20和675EFLP两个波长的滤光器分离微量而均匀的SP细胞。分离后的SP细胞放入12孔培养板中，加入含有bFGF和EGF的培养液继续培养。
(4)单细胞克隆化采用有限稀释法在96孔板上进行。细胞克隆增殖后移至24孔板内继续扩增。SP细胞克隆化成功率为1/32，而未进行FACS的细胞克隆化率为1/384)。单克隆化有助于鉴别干细胞分化潜力是自于单一克隆细胞还是由于多克隆混合培养的结果。
三、神经干细胞的冻存和复苏。冻存方法通过低速离心〔800g〕收集细胞。用新鲜生长培养液洗涤一遍后，将细胞悬浮在神经干细胞冻存液中(冻存液成份为1％二甲亚砜，40％FCS，50％MEF/F12/N2培养液)，用吸管将细胞转移到2ml细胞冻存管中。在冰水中放置15分钟后，放入细胞冻存用梯度温度降低盒中(Cryo 1 FreezingContainer，Nalgene Co.USA，Cat.No.5100-0001)，以每分钟下降1℃的速度缓慢降至-80℃，然后保存在液氮中。低温复苏方法冻存管快速在37℃水浴箱中复温后，将细胞小心悬浮在12ml生长培养液中。用同样培养液洗涤两遍后置入培养板中进行细胞培养。神经干细胞的冻存复苏率为62-85％。
四、细胞分化实验在用PLL预制表面的8孔玻片上进行。培养液中去除生长因子并加入10％FCS进行细胞培养。BrdU掺入法用于检测细胞增殖。神经干细胞培养在含有BrdU 20uM的培养液中48小时，然后进行细胞免疫化学染色。
克隆后FZ-B9的增殖速度快于FZ-B7。它们均表达神经祖细胞标记神经巢蛋白(nestin)，Vemintin也为阳性。虽然我们在单细胞克隆化过程中使用了bFGF和EGF，但克隆建株后的神经干细胞的生长对bFGF和EGF对这两种生长因子的依赖性不同。在培养中去除bFGF仅用EGF的神经干细胞增殖速度显著降低，并难以维持生长。然而仅用bFGF不用EGF，细胞生长速度有所减慢，但维持增殖状态。生长因子对FZ-B9和FZ-B7的作用相似。说明克隆化后细胞培养密度增加，这二株的神经干细胞对EGF依赖性降低，仅用bFGF也可维持其生长。
将神经干细胞分散后加入10％FCS到培养液中，这些细胞逐渐伸出突起，形态多样，免疫细胞组化染色表现为神经元细胞标记物β-微管蛋白Ⅲ和神经丝蛋白(NF)阳性。一部分细胞CNPase阳性表明已分化成少枝胶质细胞。星形胶质细胞标记物GFAP也为阳性。使用BrdU标记细胞，约40-50％为阳性。这说明这些细胞不但具有向多种神经细胞分化的能力，同时仍然自身更新，不断增殖。
五、重组腺病毒相关病毒(AAV)介导的基因转移。
为了使神经干细胞能表达外源性基因，本发明采用rAAV为载体将LacZ基因和胶质细胞起源的神经营养因子(GDNF)基因转移入神经干细胞。GDNF已在基因治疗的实验中显示有促进多巴胺能神经元存活和生长从而治疗帕金森氏病的作用。rAAV载体由HEK293细胞(ATCC，美国组织细胞库)生产。将HEK293细胞同时转染pAd/AAV辅助质粒和载体质粒。载体质粒中LacZ基因和GDNF基因均在人巨细胞病毒(CMV)启动子控制下。rAAV载体病毒的纯化采用两次氯化铯梯度离心法。3×105细胞培养在6孔板，加入rAAV载体，载体和细胞的比例(MOD)为500。感染12小时后，换为新的培养液。细胞表达LacZ基因产物β-半乳糖苷酶(β-gal)用X-gal染色测定。GDNF在培养上清中的表达用抗GDNF单克隆抗体进行ELASA(固相酶联免疫吸附法)测定。AAV介导的LacZ基因转移到神经干细胞后，用X-gal染色显示98-100％细胞转移效率。在AAV-GDNF基因转导后3天，细胞培养上清中GDNF表达浓度为800pg/ml。
本发明经动物脑内移植实验证实神经干细胞在体内移植后经过迁移、融合到脑实质中，能发育成熟分化为神经元或胶质细胞，并且稳定地表达转基因蛋白。
动物脑内移植实验如下新生后24小时的CD-1小鼠被进行侧脑室神经干细胞移植。小鼠在0℃条件下冻冷麻醉2分钟，使用纤维光源头部透射显示两侧侧脑室，使用微玻璃纤维注射管将2微升神经干细胞悬液(6×104cell/ul)注入侧脑室内，在电热毯上复温苏醒后，幼鼠被放入母鼠笼中接受哺育。动物每天腹腔注射免疫抑制剂环胞霉素-A(10mg/kg)。细胞移植后2、18、21天分别麻醉处死动物取脑组织切片后进行免疫组织化学染色。把神经干细胞注入到新生小鼠的侧脑室内，这些细胞在48小时内移行进入脑室下增殖区(SVZ)。然后随着脑的发育信号，向脑内多方向迁徙移并融合到宿主的脑实质中去。这些移植的神经干细胞表达LacZ基因，X-gal染色后，切片上可见清晰的蓝色细胞。部分细胞沿着头侧移行流(RMS)迁移到嗅球区，18-21天后在那儿分化成神经元细胞，在脑嗅球区的切片上用β-半乳糖苷酶的抗体和抗神经核抗原(NeuN)抗体进行免疫荧光染色可见很多双标记的供体起源的神经元。另一部分细胞从SVZ向两侧皮层下区迁移，在白质纤维束处它们表现为CNPase标记阳性的少枝胶质细胞。并可见A2B5抗体阳性的双潜能胶质细胞。在皮层下区和皮层，神经干细胞可分化成星形胶质细胞，GFAP为阳性。
本发明所选用rAAV进行神经干细胞基因转导有5个优点1、AAV是一种人类单链DNA病毒，从未发现可引起任何人类疾病，临床应用安全。2、AAV对神经干细胞有很高的转移效率，实验中LacZ基因转移率为98-100％。3、重组AAV病毒载体去除全部病毒编码基因，不产生病毒编码蛋白，不引起T细胞介导的细胞免疫反应，这对神经干细胞的存活具有重要意义。4、AAV可长期稳定表达转基因。5、AAV可将转基因定向嵌入到19号染色体，减少因随机插入有触发致癌的顾虑。
本发明从人胚脑组织中分离出神经干细胞，在体外培养中显示有自身更新和向三种神经细胞分化的能力，在移植入发育状态的动物脑内后能随着受体脑发育信息进行迁移、融合和分化成神经元、少枝胶质细胞和星形胶质细胞。并且经rAAV介导基因转移，神经干细胞可在体外、体内表达转基因蛋白。为进一步神经疾病的治疗和应用提供了新用途。
图1为bFGF和EGF对FZ-B9神经干细胞的体外培养作用。联合使用bFGF和EGF，神经干细胞呈现快速增殖状态。仅用EGF，细胞增殖速度显著降低，细胞生长难以维持。单用bFGF生长速度有所减慢，但仍然维持增殖性生长状态。
图2为神经干细胞FZ-B9体内移植后，在小鼠脑内迁移和转基因表达。FZ-B9LacZ细胞移植到发育中的CD-1小鼠侧脑室内，21天后脑组织切片X-gal组织化学染色，细胞表达LacZ基因产物β-半乳糖苷酶呈现蓝色。冠状切片显示很多神经干细胞从侧脑室(LV)迁移到皮质下区域(短箭头显示)，融合在宿主脑组织中。尚有小部分细胞仍停留在脑室下区(长箭头显示)。
权利要求
1.一种可表达外源性基因的人神经干细胞，其特征在于由人胚神经细胞为原始细胞分离克隆出人神经干细胞；采重组腺病毒相关病毒为载体，将外源性基因转移入内制成。
2.按权利要求1所述的可表达外源性基因的人神经干细胞，其特征在于所述的分离克隆出的人神经干细胞为FZ-B9和FZ-B7。
3.按权利要求1所述的可表达外源性基因的人神经干细胞，其特征在于所述的外源性基因为标记性基因LacZ基因和治疗性基因胶质细胞起源的神经营养因子基因。
4.一种可表达外源性基因的人神经干细胞的制备方法，包括下述步骤(1)产生和培养神经干细胞取7周和9周的流产胚胎组织，无菌收集，分离前脑组织，制备细胞混合液，加入DMEM/F12/N2培养液；(2)Hoechst33342四步骤法分离和克隆A.分离球体样形态细胞至DMEM/F12/N2培养液中；B.加碱性纤维母细胞生长因子和人表皮生长因子入培养液；C.使用Hoechst33342进行荧光流式细胞分离边际细胞；D.采用有限稀释单细胞克隆化；(3)重组腺病毒相关病毒介导基因转移。
5.按权利要求4所述的可表达外源性基因的人神经干细胞的制备方法，其特征在于所述的DMEM/F12/N2培养液含如下成分人胰岛素25ng/ml人转铁蛋白100μg/ml人前列腺素20nM谷氨酰胺2nM葡萄糖6％丁二胺60μM氯化硒30nM碳酸氢钠3μMHEPES 5mM肝素2μg/ml
全文摘要
本发明涉及一种人神经干细胞和基因治疗相结合的办法,具体涉及人神经干细胞的分离、克隆及外源性基因转移入神经干细胞的方法。本发明分离出的神经干细胞,在体外培养中显示有自身更新和向三种神经细胞分化的能力,经外源性基因转移后,可在体内、体外表达转基因蛋白,为进一步神经疾病的治疗提供新途径。
文档编号C12N5/10GK1299867SQ00127979
公开日2001年6月20日 申请日期2000年12月22日 优先权日2000年12月22日
发明者朱剑虹 申请人:复旦大学医学院附属华山医院