一种半夏凝集素蛋白及其编码序列的制作方法

专利名称：：一种半夏凝集素蛋白及其编码序列的制作方法
技术领域：
：本发明涉及分子生物学、酶学、生理学以及基因工程等领域。具体地，本发明涉及一种在半夏中表达的p-Lectin蛋白(半夏凝集素蛋白，Pinelliaternataagglutinin,PTA)及其核酸序列。本发明还涉及该蛋白和核酸序列的制备方法和用途。近20年来凝集素在生物学方面的应用研究发展迅速，它最大的特点在于其能够识别糖和糖类，每一种凝集素具有对某一种特殊的碳水化合物有专一结合的能力(AnnBiochem,1981,50:207～231)。某些凝集素基因则具有较强的抗同翅目类昆虫包括蚜虫和飞虱功能(EntomolExpAppl,1993,66:119～126；TransgenicRes,1995,4:18～25；EntomolExpAppl,1995,75:51～59)。本发明中，我们在天南星科(Araceae)植物半夏(Pinelliaternata)中克隆到雪花莲g-Lectin凝集素(GNA)基因的同源基因p-Lectin。在本发明被公布之前，尚未有任何公开或报道过本专利申请中提及的半夏p-Lectin蛋白序列及其核酸序列。本发明的第一目的就是提供一种新的半夏基因p-Lectin，该基因是一个半夏p-Lectin蛋白基因。本发明的第二目的是提供一种新的半夏蛋白p-Lectin。本发明的第三目的是提供一种利用重组技术生产上述新的半夏p-Lectin蛋白和核酸序列的方法。本发明还提供了这种半夏p-Lectin蛋白多肽和编码序列的应用。在本发明的一个方面，提供了一种分离出的DNA分子，该分子包括编码具有半夏p-Lectin蛋白质活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQIDNO.3中从核苷酸第39-848位DNA分子的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严紧条件下与SEQIDNO.3中从核苷酸第39-848位的核苷酸序列杂交。较佳地，所述的序列编码具有SEQIDNO.4所示的氨基酸序列的多肽。更佳地，所述的序列具有SEQIDNO.3中从核苷酸第39-848位的核苷酸序列。在本发明的另一方面，提供了一种分离出的半夏p-Lectin蛋白质多肽，它包括具有SEQIDNO.4氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQIDNO.4序列的多肽。在本发明的另一方面，还提供了一种载体，它包含上述的DNA分子。在本发明的另一方面，还提供了一种用上述载体转化的宿主细胞。在实例中该宿主细胞是烟草。在本发明的另一方面，还提供了一种产生具有半夏p-Lectin蛋白质活性的多肽的方法，其步骤如下(1)将编码具有半夏p-Lectin蛋白活性多肽的纯化的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成半夏p-Lectin蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQIDNO.3中从核苷酸第39-848位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(2)将步骤(1)中的表达载体转入宿主细胞，形成半夏p-Lectin蛋白的重组细胞；(3)在适合表达半夏p-Lectin蛋白多肽的条件下，培养步骤(2)中的重组细胞；(4)分离出具有半夏p-Lectin蛋白活性的基本纯的多肽。较佳地，在该方法中使用的核酸序列具有SEQIDNO.3中第39-848位的序列。本发明还提供了与p-Lectin蛋白多肽特异性结合的抗体，它包括多克隆抗体和单克隆抗体。在本发明中，“分离的”、“纯化的”或“基本纯的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组份分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。在本发明中，术语“半夏p-Lectin蛋白(或多肽)编码序列”指编码具有半夏p-Lectin蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQIDNO.3中第39-848位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQIDNO.3序列的编码框第39-848位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQIDNO.3中第39-848位核苷酸序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出SEQIDNO.4所述的序列。该术语还包括能在中度严紧条件下，更佳的在高度严紧条件下与SEQIDNO.3中从核苷酸第39-848位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。该术语还包括与SEQIDNO.3中从核苷酸第39-848位的核苷酸序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列。该术语还包括能编码具有与天然的半夏p-Lectin相同功能的蛋白的SEQIDNO.3中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。在本发明中，“基本纯的”蛋白质或多肽是指其至少占样品总物质的至少20％，较佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按干重或湿重计)。纯度可以用任何合适的方法进行测量，如用柱层析、PAGE或HPLC法测量多肽的纯度。基本纯的多肽基本上不含天然状态下的伴随其的组分。在本发明中，术语“半夏p-Lectin蛋白或多肽”指具有半夏p-Lectin蛋白活性的SEQIDNO.4序列的多肽。该术语还包括具有与天然半夏p-Lectin相同功能的、SEQIDNO.4序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括半夏p-Lectin蛋白的活性片段和活性衍生物。本发明的半夏p-Lectin多肽的变异形式包括同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与半夏p-LectinDNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗半夏p-Lectin多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含半夏p-Lectin多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括半夏p-Lectin多肽的可溶性片段。通常，该片段具有半夏p-Lectin多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。在本发明中，“半夏p-Lectin保守性变异多肽”指与SEQIDNO.4的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行替换而产生。表1<tablesid="table1"num="001"><table>最初的残基代表性的取代优选的取代Ala(A)Val；Leu；IleValArg(R)Lys；Gln；AsnLysAsn(N)Gln；His；Lys；ArgGlnAsp(D)GluGluCys(C)SerSer</table></tables>发明还包括半夏p-Lectin蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然半夏p-Lectin多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒，粘粒等。在生产本发明的半夏p-Lectin多肽时，可以将半夏p-Lectin编码序列可操作地连于表达调控序列，从而形成半夏p-Lectin蛋白表达载体。如本文所用，“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。在本发明中，术语“宿主细胞”为真核细胞。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、烟草细胞和其它植物细胞。还可用Nothem印迹法技术分析半夏p-Lectin基因产物的表达，即分析半夏p-Lectin的RNA转录物在细胞中的存在与否和数量。半夏p-LectinRNA的Nothem印迹分析和半夏p-Lectin特异抗体的Western印迹分析可以联合使用，以证实半夏p-Lectin在生物样本中的表达。此外，本发明还提供了一种可用作探针的核酸分子，该分子通常具有半夏p-Lectin核苷酸编码序列的8-100个连续核苷酸，较佳地具有15-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码半夏p-Lectin的核酸分子。本发明还提供了检测样品中是否存在半夏p-Lectin核苷酸序列的方法，它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。较佳地，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于半夏p-Lectin核苷酸编码序列，并可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为15-50个核苷酸。此外，根据本发明的半夏p-Lectin核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表达蛋白质的同源性基础上，筛选半夏p-Lectin同源基因或同源蛋白。为了得到与半夏p-Lectin基因相关的半夏cDNAs的点阵，可以用DNA探针筛选半夏cDNA文库，这些探针是在低严紧条件下，用32P对半夏p-Lectin的全部或部分做放射活性标记而得的。最适合于筛选的cDNA文库是来自半夏的文库。构建来自感兴趣的细胞或者组织的cDNA文库的方法是分子生物学领域众所周知的。另外，许多这样的cDNA文库也可以购买到，例如购自Clontech,Stratagene,PaloAlto,Cal.。这种筛选方法可以识别与半夏p-Lectin相关的基因家族的核苷酸序列。本发明的半夏p-Lectin核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员己知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。此外，还可用人工化学合成的方法来合成有关序列。在本申请之前，现有技术已完全可以通过先合成多个多核苷酸小片段，然后再进行连接而获得编码本发明半夏p-Lectin蛋白的核酸序列。然后，可将该核酸序列引入本领域中各种现有的DNA分子(如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。除了用重组法产生之外，本发明蛋白的片段还可用固相技术，通过直接合成肽而加以生产(Stewart等人，(1969)Solid-PhasePeptideSynthesis,WHFreemanCo.,SanFrancisco;MerrifieldJ.(1963)J.AmChem.Soc85:2149-2154)。在体外合成蛋白质可以用手工或自动进行。例如，可以用AppliedBiosystems的43lA型肽合成仪(FosterCity,CA)来自动合成肽。可以分别化学合成本发明蛋白的各片段，然后用化学方法加以连接以产生全长的分子。利用本发明的半夏p-Lectin蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与半夏p-Lectin发生相互作用的物质，或者受体、抑制剂或拮抗剂等。表2为本发明的半夏p-Lectin蛋白与石蒜科植物雪花莲g-Lectin凝集素(GNA)蛋白的核苷酸序列(GenBankAccessionNo.M55556)的同源比较(GAP)表。表3为本发明的半夏p-Lectin蛋白与石蒜科植物雪花莲g-Lectin凝集素(GNA)蛋白的氨基酸序列(GenPeptAccessionNo.AAA33346)的同源比较(FASTA)表。其中，相同的氨基酸在两个序列之间用氨基酸单字符标出，相似的氨基酸用“+”标出。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1半夏p-Lectin基因的克隆1．组织分离(isolation)半夏花序来源于上海中医药大学，采取材料后，立即置于液氮中冷冻保存。2．mRNA的分离(mRNAisolation)取部分组织，用研钵研碎，加入盛有裂解液的50ml管，充分振荡后，再移入玻璃匀浆器内。匀浆后移至50ml新管，抽提总RNA(TRIzolReagents,Gibco,NY,USA)。用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量。3．基因的全长克隆(CloningofFull-lengthcDNA)根据雪花莲和其它天南星科凝集素氨基酸保守序列，设计简并引物，利用同源性基因克隆原理，采用RACE方法(GibcoBRL试剂盒)进行cDNA全长克隆，分三个阶段进行(1)3′---RACEPCR(AP+99011PXF2)得到99011PX3′(0.6kb)，回收，连接到T-Easy载体上，用SP6或T7作为通用引物，采用终止物荧光标记(Big-Dye,Perkin-Elmer,USA)的方法，在ABI377测序仪(Perkin-Elmer,USA)上进行测序。测序结果用GCG软件包(Wisconsingroup,USA)中的BLAST和FASTA软件搜索已有的数据库(Genebank+EMBL)，知其核酸序列及编码蛋白与已知石蒜科植物如雪花莲(Galanthusnivalis)和天南星科植物如芋头(Colocasiaesculenta)、疆南星(Arummaculatum)的凝集素基因的同源性很高，故初步认为它是一个凝集素基因。(2)．5′-RACE第一轮PCR(AAP+99011PXR2)第二轮PCR(AUAP+99011PXR3)得到99011PX5′(0.6kb)(过程同(1))(3)．PCR扩增99011PX编码区(99011PXFI+R1)得到99011PX编码区(0.8kb)(过程同(1))。BLAST的结果证明从半夏中新得到的基因确为一个植物凝集素基因。由于已知的同源凝集素如雪花莲凝集素(GNA)基因具有较强的抗同翅目类昆虫包括蚜虫和飞虱功能(Hilder等，1994；Powell等，1993,1995)，故推测此基因具有相同的功能。通过组合使用上述3种方法，获得了候选的半夏p-Lectin蛋白的全长编码序列。在拼接得到全长(至少包含完整的开放读框)的基础上，进一步设计引物R1:5′-ATTCAGTAGCCAGCCAGCAG-3′(SEQIDNO.1)为正向引物，寡核苷酸R2:5′-ACCAGCAGAAGCCAGACCTA-3′(SEQIDNO.2)为反向引物，以的总RNA为模板，进行RT-PCR扩增，R1/R2的PCR条件为94℃5分钟，随之以94℃30秒、59℃30秒和72℃1分钟进行35个循环，最后以72℃延伸5分钟。电泳检测PCR扩增产物，获得扩增片段长度为1099bp。然后按常规方法以PCR扩增产物进行克隆、测序，获得SEQIDNO.3所示的序列。实施例2半夏p-Lectin基因的序列信息与同源性分析本发明新的半夏p-Lectin全长cDNA的长度为1099bp，详细序列见SEQIDNO.3，其中开放读框位于39-848位核苷酸。根据全长cDNA推导出半夏p-Lectin的氨基酸序列，共269个氨基酸残基，分子量29396.48,pI为6.58。详细序列见SEQIDNO.4。将p-Lectin的全长cDNA序列及其编码蛋白质用BLAST程序在Non-redundantGenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundantGenBankCDStranslations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR数据库中进行核苷酸和蛋白质同源性检索，结果发现它与雪花莲的g-Lectin(GNA)基因存在一定的同源性。在核苷酸水平上，它与雪花莲g-Lectin基因的mRNA全编码序列(GenBankAccessionNo.M55556)有54.2％的相同性(附表2)，在氨基酸水平上，它与雪花莲g-Lectin蛋白(GenPeptAccessionNo.AAA33346)的第1-269位氨基酸残基有37.7％的相同性和64.4％的相似性(附表3)。由上可见，p-Lectin基因与雪花莲g-Lectin(GNA′)基因无论从核酸还是蛋白水平上都存在较高的同源性，可以认为两者在功能上也有很高相似性。实施例3半夏p-Lectin蛋白的结构和功能研究1．半夏p-Lectin蛋白的氨基酸序列blocks分析。将半夏p-Lectin蛋白的氨基酸序列在blocks数据库(网址为http:∥www.blocks.fhcrc.org)中检索结构域，得到以下结果(1)在氨基酸序列中，存在以下结构域区加框区(146-171,185-219,223-242):Lectin蛋白功能模块(Lectin)。(2)功能分析在该基因氨基酸序列中存在Lectin蛋白功能模块，因而可预见其的确具有相应功能。2．半夏凝集素(PTA)的分离纯化。取来自于第二军医大学药学院药用植物园的100克新鲜半夏块茎用1×PBS冰上研磨，5000rpm离心，上清液经0％-85％硫酸铵分级纯化后，收集65％-86％饱和硫酸铵沉淀PTA，活性组分分次经PHE-SepharoseFF(26/26)疏水柱层析，0.8mol/L(NH4)2SO4线形梯度洗脱可得两峰(同时收集其它各峰)，合并主峰后部收集液直接上Q-SepharoseFF(26/13)离子交换柱，收集0.1-0.30mol/LNaCl梯度洗脱下的活性部分，合并后脱盐，冻干，得蛋白样品(PTA)。将PTA上分子筛色谱柱SephadexG-150或Superose12(HR10/30)上呈单一峰，测定表观分子量约为40ku，用Weber和Osborn方法(JBiolChem1969,244:4406-4412)在SDS-PAGE(梯度8％-18％)凝胶上呈现1条带，测得PTA成熟亚基单体分子量约为12kDa(与GNA和君子兰凝集素成熟蛋白大小相似，见图1)。图1．SDS-PAGE垂直蛋白电泳结果。M蛋白大小标准；a半夏p-Lectin蛋白。3．半夏p-Lectin蛋白的专一结合糖基化分析。通过对半夏p-Lectin蛋白同其它植物凝集素蛋白如雪花莲凝集素(GNA)、君子兰凝集素、水仙凝集素等的专一结合糖基化分析，发现半夏p-Lectin蛋白同大多数甘露糖专一结合的凝集素如雪花莲凝集素(GNA)、君子兰凝集素、水仙凝集素等一样，具有3个典型的甘露糖专一结合位点盒(QDNY)，见下图(图中甘露糖专一结合位点盒QDNY用方框框住)。因此证明半夏p-Lectin蛋白也同雪花莲凝集素(GNA)、君子兰凝集素等一样，为甘露糖专一结合的凝集素蛋白。实施例4半夏p-Lectin多肽的制备和提纯在该实施例中，将全长的半夏p-Lectin编码序列或片段构建入酵母蛋白质真核表达载体之中，以表达和提纯目的蛋白。酵母表达载体的构建，以及转化酵母感受态细胞根据半夏p-Lectin的全长编码序列(SEQIDNO.3)，设计扩增出完整编码阅读框的引物(分别对应于编码序列5’和3’端的约20个以上核苷酸)，并在正反引物上分别引入限制性内切酶位点(这根据选用的酵母表达质粒pHIL-S1而定)，以便构建表达载体。以实施例1中获得的扩增产物为模板，经PCR扩增后，将半夏p-Lectin基因在保证阅读框正确的前提下克隆至酵母表达质粒pHIL-S1(Clontech)。用合适的内切酶将质粒线性化。测定A280/A260的比值，确定质粒的纯度和浓度。将线性化的克隆质粒，在1.2kV，20μF的条件下电转化到PichiapastorisGS115(His-)酵母感受态中。全部涂于MD平板上，30℃培养2～3d。表达半夏p-Lectin蛋白的酵母阳性克隆的筛选、鉴定随机挑取MD平板上的酵母菌落，点种于硝酸纤维素膜上，铺于YPD平板上30℃培养2d。同时点种未转化的酵母菌作阴性对照，长出菌落后，进行原位杂交。挑取原位杂交阳性的菌落，悬浮于10μl无菌水中，加入30u的裂解酶，25℃作用30min。在液氮中冻融3次。然后煮沸10min。12000r/min离心5min，取上清为模板。使用半夏p-Lectin的引物进行PCR扩增反应。同时以未转化的空载酵母作对照。观察重组子中能否扩增出半夏p-Lectin的基因片段。将PCR阳性的重组酵母接种于5ml的BMGY培养基中，30℃振荡培养(250r/min)48h。2000r/min离心5min。酵母菌沉淀用5mlBMMY培养基悬浮，30℃继续振荡培养4d。每隔24h补加5％的甲醇0.25ml。离心收集上清。SDS-PAGE检测表达产物。半夏p-Lectin融合蛋白的提取纯化按上述方法大量表达半夏p-Lectin蛋白，收集上清加入一定体积的NTA-琼脂糖(Qiagen,Germany)，4℃吸附1小时。而后用含100nM咪唑的His缓冲液洗涤两次，用含20mMN,N’-二哌嗪，500mMNaCl,300mM咪唑的缓冲液洗脱以得到纯化的蛋白。洗脱液保存于4℃，并进行SDS-PAGE变性蛋白电泳，检测提取的半夏p-Lectin蛋白的纯度。在12kDa处的蛋白质条带即为半夏p-Lectin成熟蛋白。实施例5半夏p-Lectin蛋白或多肽在烟草细胞中进行真核细胞表达含目的基因(半夏p-Lectin基因)表达载体的构建根据半夏p-Lectin的全长编码序列(SEQIDNO.3)，设计扩增出完整编码阅读框的引物，并在正反引物上分别引入限制性内切酶位点(这可视选用的载体而定)，以便构建表达载体。以实施例1中获得的扩增产物为模板，经PCR扩增后，将半夏p-LectincDNA克隆至中间载体(如pBluescript)，进一步克隆到双元表达载体(如pBI121)，在保证阅读框架的前提下鉴定好的表达载体，再将其转入农杆菌中，利用叶盘法技术转化模式植物烟草。利用叶盘法转化烟草1．用无菌牙签挑取YEB选择平板上的阳性菌落，接种于2mlYEB液体(Sm+,Kan+),28度，200rpm振荡培养24-36小时；2．室温下4,000g离心10min；3．弃上清，菌体用1/2MS液体培养基悬浮，稀释到原体积的5-20倍，使菌液的OD600=0.5左右；4．取生长两周左右的烟草的无菌叶片，去掉其主叶脉，将其剪成约1平方厘米见方的小叶片；5．将叶片放入制备好的菌液中，浸泡2-5min，在无菌滤纸上吸干菌液；6．把经侵染的叶片放于MS培养基上，28℃暗培养48小时；7．将叶片转到愈伤培养基(MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+Kan50mg/L+cb250mg/L)上，25-28℃光照下培养，7-15天可见愈伤组织的形成；8．约20天后可见分化芽长出，待芽长大后，切下，置于生根培养基(1/2MS+NAA0.5mg/L+Kan25mg/L)上进行生根培养，2-7天左右生根；9．等根系发达后，将植株取出，用无菌水洗净附着的固体培养基，移入土壤中，刚开始用玻璃罩罩几天，待植株健壮后再取下玻璃罩，温室中培养。利用westernblot检测GNA蛋白在转基因烟草植株中的表达1．蛋白的提取a)取50mg叶片，加入100ul1*PBS(KH2PO40.2g/l,Na2HPO41.15dg/l,KCl0.2g/l,NaCl8g/l)于1.5mleppondorf管中研磨；b)13000,4℃离心10分钟；c)取上清，备用。注以上过程于冰上进行。2．蛋白的定量参考Bradford法(Bradford,1976)。取2ul蛋白样品，加入1mlBradford试剂，混匀后，分光光度计测OD595；蛋白含量计算1OD595=28.57μg。3．SDS-PAGE分离蛋白SDS-PAGE的制备参考《分子克隆》(Sambrook等，1989)；a)加样前，将样品置于含50mmol/LDTT的加样缓冲液(2*加样缓冲液甘油2.4g,1MTris-HClpH6.81ml；溴酚兰0.01％，H2O定容至20ml)，煮沸10分钟；b)室温100V电压下聚丙烯酰胺凝胶电泳，直到指示剂(溴酚兰)前沿达到凝胶底部。4．蛋白质向硝酸纤维膜上转移a)转移之前，用转移缓冲液(39mmol甘氨酸，48mmolTrisBase,0.037％SDS,20％甲醇)平衡凝胶和硝酸纤维膜30分钟；b)室温下用半干式电转仪转移1h，凝胶两侧各垫3层Whatman滤纸；5．膜上蛋白的检测a)将硝酸纤维膜浸在封闭液中，37℃缓慢摇动、封闭60分钟(封闭液取5g脱脂奶粉溶于100ml1*PBS(含0.5g叠氮钠))；b)再将滤膜浸泡在洗涤缓冲液中，37℃洗涤两次，每次15分钟；c)加入第一抗体(抗半夏p-Lectin的抗体)，37℃温育30分钟；同步骤b)，洗涤三次；d)加入第二抗体(亲和素-碱性磷酸酶复合物)，37℃温育30分钟；同步骤b)，洗涤两次；e)加入底物显色观察蛋白条带。本发明涉及的序列及记号分列如下(1)SEQIDNO.1的信息(ⅰ)序列特征(A)长度20bp(B)类型核苷酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)．分子类型寡核苷酸(ⅲ)．序列描述SEQIDNO.1ATTCAGTAGCCAGCCAGCAG20(2)SEQIDNO.2的信息(ⅰ)序列特征(A)长度20bp(B)类型核苷酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)．分子类型寡核苷酸(ⅲ)．序列描述SEQIDNO.2ACCAGCAGAAGCCAGACCTA20(3)SEQIDNO.3的信息(ⅰ)序列特征(A)长度1099bp(B)类型核苷酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)．分子类型核苷酸(ⅲ)．序列描述SEQIDNO.31ATTCAGTAGCCAGCCAGCAGCAACCCGGCTCTTTCCTCATGGCCTCCAAG-51CTCCTCCTCTTCCTCCTCCCGGCCATCCTCGGCCTCATCATCCCGCGGCC101AGCCGTGGCGGTGGGCACCAACTACCTACTGTCCGGCGAAACCCTAGACA151CGGACGGCCATCTGAAGAATGGCGACTTCGACTTTATCATGCAGGAAGAC201TGCAACGCCGTCCTGTACAACGGCAACTGGCAGTCCAACACGGCCAACAA251AGGACGAGACTGCAAGCTCACCCTCACCGACCGCGGCGAGCTCGTCATCA301ACAACGGCGAGGGATCCGCCGTCTGGAGGAGCGGCTCCCAGTCCGCGAAG351GGCAACTACGCCGCCGTCCTCCATCCGGAGGGGAAACTGGTCATCTACGG401CCCATCCGTCTTCAAGATCAACCCTTGGGTCCCCGGCCTCAACAGCCTGC451GGCTCGGCAACGTCCCTTTCACGTGCAACATGCTCTTCTCCGGCCAGGTC501CTCTACGGCGACGGCAAGATCACTGCGAGGAACCACATGCTGGTCATGCA551GGGCGACTGCAACCTGGTCCTGTACGGCGGGAAGTGCGACTGGCAGTCCA601ACACCCACGGCAACGGCGAGCACTGCTTCCTCCGGCTGAACCACAAGGGC651GAGCTCATCATCAAGGATGACGACTTCAAGAGCATCTGGAGCAGCCAGTC701CAGCTCCAAGCAGGGTGACTACGTCTTCATCCTCCAGGACAACGGCTACG751GCGTCATCTACGGCCCTGCCATCTGGGCGACCAGCTCGAAGCGCTCCGTT801GCTGCTCAGGAGACGATGATCGGCATGGTGACGGAGAAGGTGAATTAATA851AGCGAAATGATCGAAGTTGGATACTATATATCTTCCGCCTCCACTGGAAG901ATATATAAATGAGCACATGACATGTTATCCTAGCTAGCTACTTTATGGAC951AGACCGTAGAATAATCGTGTGTAGTAGCAGTATAGTACGTACGTGCGGAT1001TATATTCCCTGTTGCGGTCTGTCTTCGTCGCTGTGTCTTGTTAAAAGGCG1051TTGTTCATCAGCCTTTGCCTTCGTAGCCATAGGTCTGGCTTCTGCTGGT(4)SEQIDNO.4的信息(ⅰ)序列特征(A)长度269氨基酸(B)类型氨基酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)．分子类型多肽(ⅲ)．序列描述SEQIDNO.41MASKLLLFLLPAILGLIIPRPAVAVGTNYLLSGETLDTDGHLKNGDFDFI51MQEDCNAVLYNGNWQSNTANKGRDCKLTLTDRGELVINNGEGSAVWRSGS101QSAKGNYAAVLHPEGKLVIYGPSVFKINPWVPGLNSLRLGNVPFTCNMLF151SGQVLYG2GKITARNHMLVMQGDCNLVLYGGKCDWQSNTHGNGEHCFLRL201NHKGELIIKDDDFKSIWSSQSSSKQGDYVFILQDNGYGVIYGPAIWATSS251KRSVAAQETMIGMVTEKVN表2PercentIdentity:54.189％inntoverlap上列半夏p-Lectin蛋白的核酸序列下列雪花莲g-Lectin蛋白的核酸序列(GenBankAccessionNo.M55556)表337.7％identityin146aaoverlap,64.4％similarityin146aaoverlapp.pep半夏p-Lectin蛋白氨基酸序列g.pep雪花莲g-Lectin蛋白氨基酸序列(GenBankAccessionNo.AAA33346)权利要求1．一种分离出的DNA分子，其特征在于，它包括编码具有半夏p-Lectin蛋白质活性的多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列与SEQIDNO.3中从核苷酸第39-848位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严紧条件下与SEQIDNO.3中从核苷酸第39-848位的核苷酸序列杂交。2．如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列编码具有SEQIDNO.4所示的氨基酸序列的多肽。3．如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，该序列具有SEQIDNO.3中从核苷酸第39-848位的核苷酸序列。4．一种分离出的半夏p-Lectin蛋白多肽，其特征在于，它包括具有SEQIDNO.4氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。5．如权利要求4所述的多肽，其特征在于，该多肽是具有SEQIDNO.4序列的多肽。6．一种载体，其特征在于，它包含权利要求1所述的DNA。7．一种用权利要求6所述载体转化的宿主细胞，其特征在于它是真核细胞。8．一种产生具有半夏p-Lectin蛋白质活性的多肽的方法，特征在于其步骤如下(1)将编码具有半夏p-Lectin蛋白活性的多肽的纯化的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成半夏p-Lectin蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQIDNO.3中从核苷酸第39-848位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(2)将步骤(1)中的表达载体转入宿主细胞，形成半夏p-Lectin蛋白的重组细胞；(3)在适合表达半夏p-Lectin蛋白多肽的条件下，培养步骤(2)中的重组细胞；(4)分离出具有半夏p-Lectin蛋白活性的基本纯的多肽。9．一种能与权利要求7所述的半夏p-Lectin蛋白多肽特异性结合的抗体，其特征在于它包括多克隆抗体和单克隆抗体。10．一种核酸分子，其特征在于，它包含权利要求1所述的DNA分子中8-100个连续核苷酸。11．一种用于检测样品中是否存在半夏p-Lectin核苷酸序列的方法，其特征在于它包括用权利要求10所述探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于半夏p-Lectin核苷酸编码序列，并可位于该编码序列的两侧或中间，引物长度为15～50个核苷酸。全文摘要本发明提供了一种在半夏中表达的新的p－Lectin蛋白及其编码序列,本发明还提供了该蛋白和核酸序列的制备方法,以及在样品中检测半夏p－Lectin核酸序列和多肽的方法。文档编号C12Q1/68GK1300851SQ0012798公开日2001年6月27日申请日期2000年12月22日优先权日2000年12月22日发明者唐克轩,姚剑虹,孙小芬申请人:复旦大学