专利名称：植物悬浮培养细胞生产雷公藤总生物碱的方法
技术领域：
本申请涉及由悬浮法培养雷公藤植物细胞而生产雷公藤总生物碱的方法。
背景技术：
中药雷公藤(Tripterygium wilfordii HOOK.f.)取自卫矛科植物雷公藤的根，是治疗风湿性和风湿性类关节炎的传统药物。近年来的大量研究表明具有重要的多种抗癌药物成份，主要成分为生物碱及卫茅醇、南蛇藤醇等。在自然界，从一颗雷公藤种子萌发到长成药材，大约12-15年。传统用药方式以雷公藤的根皮部入药，可利用部分少，加上一次性采挖，不利于资源的可持续利用。
尹作鸿等人从雷公藤的茎、叶诱导出愈伤组织，并进行了固体组织培养，从中分离得到雷公藤甲素、雷公藤乙素等二萜内酯化合物。夏志林等从雷公藤组织细胞悬浮培养物中分离出25个化合物，其中经组织培养产生的雷公藤内酯二醇比原植物含量高36倍。
用悬浮法培养雷公藤植物细胞而生产雷公藤总生物碱的方法未见报道。悬浮法细胞培养与固体培养法相比更适于大规模工业化生产，但需要克服更多技术上的困难，不是所有细胞都能进行悬浮法组织培养。
本专利申请者从1972年开始从事植物生物技术研究。利用高等植物细胞悬浮培养技术，可以产生原生植物的全部药用有效成份。这是因为1964年印度科学家在曼陀罗花药培养中，获得第一株单倍体完整植株后，实验证明了植物细胞的全能性。迄今为止，大量研究成果及我们的研究证明，植物细胞离体培养具有全能合成原生植株的药用有效成份的特性。这是本专利的实验基础和理论基础。
发明内容
为保护雷公藤的自然资源，建立可持续开发利用资源的生产程序，采用雷公藤植物细胞的悬浮法组织培养，工业化生产雷公藤总生物碱，利用现代技术使雷公藤的药物成份从原始的自然界生长的原生植物中获得，转化为从工业化生产的雷公藤高产细胞株中获得，是本专利的目的。
一、原生植株来源本专利涉及的药用原生植物为卫茅科植物雷公藤Tripterygium wilfordii HOOK.f.，由自安徽省歙县杞梓里镇水竹坑药农柯尚永采挖提供。
二、生产细胞株的培养参见说明书附
图1
1、取正季生长的原生植物嫩叶茎或当年成熟、饱满的种子，作为诱导愈伤组织的外植体。取外植体后，注意保鲜和清洁。
2、表面灭菌外植体放在150ml的三角瓶中，放2-3克洗衣粉或2-3滴吐温-60。放在自来水龙头上，小水流冲洗2-3小时。然后在超净台上小心地用灭菌过的镊子夹到另一灭菌过的(120℃、20分钟蒸汽灭菌)150ml三角瓶中，倒入75％酒精，放置60秒(干种子90秒)，然后到掉酒精。倒入0.1％HgCl灭菌保持12-15分钟，倒出HgCl液后，用无菌水(120℃、20分钟蒸汽灭菌)冲洗3次，最后一次在无菌水中停留3-4分钟。然后用灭菌过的镊子夹到吸水纸上吸干。用灭菌刀片把取自茎或叶的外植体切成0.5公分大小或长短的切片或切段。将每粒种子作为一个单独的外植体。
3、诱导愈伤组织MS基本培养基加肌醇100mg/L、VB10.5-1.0mg/L、VB60.5-1.0mg/L、NA 0.5-1.5mg/L、甘氨酸2-10mg/L、蔗糖30-45g/L、2.4-D 1-2mg/L、NAA 0.2-1.0mg/L、琼脂6g/L，PH5.8。然后经120℃、20分钟蒸汽灭菌，把上述切好的取自茎或叶的外植体接种到培养基上。培养基分装在150ml三角瓶中，每瓶装40ml，置于温度为27℃±2℃、暗培养的条件下诱导愈伤组织。种子在光培养条件下发芽，然后，按上、下胚轴、子叶分别接种在上述培养基上，在暗培养条件下诱导愈伤组织。20天后，长出愈伤组织。
4、继代培养在上述条件下获得的愈伤组织，转移到上述相同的培养基上，每三角瓶中移入5-7块初始愈伤组织，在光培养条件下(1500LUX日光灯)，每35-45天继代一次。
5、挑选细胞株经3-4次继代培养后的愈伤组织，用灭菌注射针头小心地挑选出生长旺盛、颗粒状的愈伤组织。
6、固体继代保存步骤5挑选得到的生长旺盛、颗粒状的愈伤组织，一半进入步骤6，在上述相同的固体培养基和光培养条件下继代保存。需要时，可省去步骤1-5，直接从本步骤继代培养的愈伤组织中挑选出生长旺盛、颗粒状的愈伤组织，进入到步骤7。
7、悬浮培养步骤5挑选出的另一半愈伤组织，进入步骤7。用上述固体培养基去掉琼脂成分形成的液体培养基，每150ml三角瓶中装75ml液体培养液，每瓶接种1-1.5g鲜重的愈伤组织，放到往复式80-90转/分的摇床上培养，1500 LUX光照、27℃±2℃。接种后第十天，作第一次继代，以后每7天继代一次。每次倒掉3/4-4/5培养液和细胞，然后加入新鲜的相同培养基到原液面，进行下一次继代。
8、返回固体培养基经5-7次继代的悬浮细胞系，在无菌条件下，用150目不锈钢网筛过滤，分离出直径大于5mm的大块愈伤组织，滤液再用400目不锈钢网过滤，滤取悬浮细胞，小心地用接种针或铲，每个150ml三角瓶接种0.5g左右的悬浮细胞到上述固体培养基上，放置黑暗条件下，27℃±2℃，培养三周，进入步骤11。
9、分离大块愈伤组织从步骤8用150目筛网分离挑选出的直径大于5mm的大块愈伤组织，放到上述相同的固体培养基上，进入步骤10的继代保存。
10、大块愈伤组织的保存将步骤9挑选出的大块、不分散的愈伤组织，在上述相同的固体培养基上继代保存备用。
11、分离出分散性好、颗粒状细胞系步骤8的悬浮细胞，经过三周的固体暗培养后，用100目的筛网分离得到细胞团，为生长快速、颗粒细小的3-8个细胞组成的细胞团。然后进入到步骤12的细胞系悬浮培养。
12、细胞系悬浮培养步骤11的挑选得到的分散性好、颗粒状细胞系按上述步骤7的悬浮培养条件，继代培养扩样本，形成高等植物的细胞悬浮系。
13、步骤12的悬浮培养细胞系经扩样本后，在20L-40L磁力搅拌反应器(每分钟120转、磁力转子长8cm，直径0.8-1.2cm)中继代，第7天加入步骤10的大块愈伤组织，每瓶悬浮培养物中加入4-5g鲜重的大块愈伤组织，共同培养72小时。
14、提取总生物碱将步骤13的悬浮细胞过滤，细胞在45℃±1℃烘干，过滤液在冰冻条件下抽真空浓缩至原液量的10％左右，按雷公藤总生物碱提取方法，如《中国药房》1995，6(4)12-13记载的方法，提取总生物碱，结果，液体中总生物碱含量占51％，细胞中总生物碱约占49％。
15、总生物碱与原生植物药材作对照，定性、定量测定采用文献记载的方法，与原生药材含量比较，用悬浮培养细胞生产的雷公藤总生物碱，是原生药材的2.9倍。
三、挑选细胞株保持生产细胞株的遗传稳定性高等植物悬浮细胞系的遗传稳定性是阻碍植物细胞工程生产原生植物药用有效成份的主要障碍。挑选细胞株保持其稳定性是技术关键。根据高等植物细胞“全能性”理论，利用其胚性细胞特性，可以相对地保持细胞株的遗传稳定性。其工艺过程如下1、生产细胞株经过上述生产细胞株的培养工艺的挑选方法和悬浮培养过程，从步骤13得到的悬浮系，一旦进入对数生长速率后，及时地挑选出一小部分悬浮细胞，移到以下步骤2所述的固体培养基上。
2、将从1中挑选的悬浮细胞转移到有MS+2.4D 0.5mg/L+BA或KT 0.1-0.2mg/L、肌醇100mg/L、VB10.5-1.0mg/L、VB60.5-1.0mg/L、NA 0.5-1.5mg/L、CH 500-1000mg/L、蔗糖30-45g/L、琼脂6g/L的150ml三角瓶固体培养基上，每35-45天(优选45天)继代一次，在1500 LUX光照12小时，27℃±2℃条件下生长保存。
3、将步骤2生长45天的愈伤组织转一小部分到MS+BA 0.5mg/L+KT 0.05mg/L+步骤2的其它相同成份的分化培养基上，测定其再生植株的分化频率。
4、筛选总生物碱产量的高产细胞株重复1、2、3步骤，不断筛选出高产细胞株。
高等植物细胞具有再生植株的“全能性”和合成药用有效成份的“全能性”；而前一个“全能性”只有“具胚性”的细胞才能有这种能力。因此，测定其胚性能力就可保证其遗传稳定性。有了遗传上的稳定性，才能有后一个“全能性”。实验证明，我们在步骤3筛选出的“具胚性”悬浮细胞系，可以连续150代(次)以上，能保持3年以上的再分化能力。
本专利涉及的培养基是“MS”加所述的附加成分。
本专利具有以下特点(1)生产条件不受地域、季节、气候、水质等自然环境的影响。
(2)生产周期短，仅需十几天。
(3)药物成份含量高，是原生植株的数倍。
(4)生产过程不产生大量废渣废水，防止了环境污染。
(5)具有很高的经济效益和社会效益。
具体实施例方式
1、取成熟饱满的种子作为外植体。
2、将种子置于150ml的三角瓶中，放3克洗衣粉，在自来水龙头上，小水流冲洗2-3小时。然后在超净台上小心地用灭菌过的镊子夹到另一灭菌过的(120℃、20分钟蒸汽灭菌)150ml三角瓶中，倒入75％酒精，放置90秒，然后到掉酒精。倒入0.1％HgCl灭菌保持15分钟，倒出HgCl液后，用无菌水冲洗3次，最后一次无菌水中停留3-4分钟。然后用灭菌过的镊子夹到吸水纸上吸干后，每个三角瓶中接种1-3粒种子。
3、诱导愈伤组织MS基本培养基加肌醇100mg/L、VB10.5mg/L、VB60.5mg/L、NA 0.5mg/L、甘氨酸2mg/L、蔗糖30g/L、2.4-D 1mg/L、NAA 0.2mg/L、琼脂6g/L，PH5.8。然后经120℃、20分钟蒸汽灭菌，培养基分装在150ml三角瓶中，每瓶装40ml，放在27℃±2℃的暗培养条件下。种子在光培养下发芽，然后，按上、下胚轴、子叶分别接种在上述培养基上，暗培养诱导愈伤组织。20天后，长出愈伤组织。
4、继代培养在上述条件下获得的愈伤组织，转移到上述相同的培养基上，每三角瓶中移入5-7块初始愈伤组织，在光培养条件下(1500LUX日光灯)，每35-45天继代一次。
5、挑选细胞株经3-4次继代培养后的愈伤组织，用灭菌注射针头小心地挑选出生长旺盛、颗粒状的愈伤组织。
6、固体继代保存步骤5挑选得到的生长旺盛、颗粒状的愈伤组织，一半进入步骤6，在上述相同的固体培养基和光培养条件下继代保存。需要时，可省去步骤1-5，直接从本步骤继代培养的愈伤组织中挑选出生长旺盛、颗粒状的愈伤组织，进入到步骤7。
7、悬浮培养将步骤5挑出的生长快速、颗粒状的、鲜亮的愈伤组织，另一半进入步骤7。用上述固体培养基去掉琼脂成分形成的液体培养基，每150ml三角瓶中装75ml液体培养液，每瓶接种1.5g鲜重的愈伤组织，放到往复式80-90转/分的摇床上培养，1500 LUX光照、27℃±2℃。接种后第十天，作第一次继代，以后每7天继代一次。每次倒掉3/4-4/5培养液和细胞，然后加入新鲜的相同培养基到原液面，进行下一次继代。
8、返回固体培养基步骤7经过悬浮培养的细胞系，在无菌条件下，用150目不锈钢网筛过滤，分离出直径大于5mm的大块愈伤组织，滤液再用400目不锈钢网过滤，滤取悬浮细胞，小心地用接种针或铲，每个150ml三角瓶接种0.5g左右的悬浮细胞到上述固体培养基上，放置黑暗条件下，27℃±2℃，培养三周，进入步骤11。
9、分离大块愈伤组织从步骤8用150目筛网分离挑选出的直径大于5mm的大块愈伤组织，放到上述相同的固体培养基上，进入步骤10的继代保存。
10、大块愈伤组织的保存将步骤9挑选出的大块、不分散的愈伤组织，在上述相同的固体培养基上继代保存备用。
11、分离出分散性好、颗粒状细胞系步骤8的悬浮细胞，经过三周的固体暗培养后，用100目的筛网分离得到细胞团，为生长快速、颗粒细小的3-8个细胞组成的细胞团。然后进入到步骤12的细胞系悬浮培养。
12、细胞系悬浮培养步骤11的挑选得到的分散性好、颗粒状细胞系按上述步骤7的悬浮培养条件，继代培养扩样本，形成高等植物的细胞悬浮系。
13、步骤12的悬浮培养细胞系经扩样本后，在20L-40L磁力搅拌反应器(每分钟120转、磁力转子长8cm，直径0.8-1.2cm)中继代，第7天加入步骤10的大块愈伤组织，每瓶悬浮培养物中加入4-5g鲜重的大块愈伤组织，共同培养72小时，即获得可以用于工业化提取雷公藤总生物碱的组织培养产物。
权利要求
1.一种通过悬浮培养植物细胞生产雷公藤总生物碱的方法，其特征在于包括以下步骤(1)、取正季生长的原生植物嫩叶、茎或当年成熟、饱满的种子，作为诱导愈伤组织的外植体；(2)、表面灭菌用常规方法灭菌，之后把茎或叶切成0.5公分大小或长短的切片或段，干种子按每颗为单独外植体；(3)、诱导愈伤组织MS基本培养基加肌醇100mg/L、VB10.5-1.0mg/L、VB60.5-1.0mg/L、NA 0.5-1.5mg/L、甘氨酸2-10mg/L、蔗糖30-45g/L、2.4-D 1-2mg/L、NAA 0.2-1.0mg/L、琼脂6g/L，PH5.8，灭菌后，把上述切好的外植体接种到培养基上，置于温度为27℃±2℃、暗培养的条件下诱导愈伤组织，种子在光培养条件下发芽，然后，按上、下胚轴、子叶分别接种在上述培养基上，在暗培养条件下诱导愈伤组织；(4)、继代培养在上述条件下获得的愈伤组织，转移到上述相同的培养基上，在光培养条件下，每35-45天继代一次；(5)、挑选细胞株从经过3-4次继代培养后的愈伤组织中，挑选出生长旺盛、颗粒状的愈伤组织；(6)、固体继代保存步骤(5)挑选得到的生长旺盛、颗粒状的愈伤组织，部分在上述相同的固体培养基和光培养条件下继代保存，需要时，可省去步骤(1)-(5)，直接从本步骤继代培养的愈伤组织中挑选出生长旺盛、颗粒状的愈伤组织，进入到步骤(7)；(7)、悬浮培养步骤(5)经挑选出的愈伤组织，另一部分进入本步骤，接种在用上述固体培养基去掉琼脂成分形成的液体培养基中，1500 LUX光照、27℃±2℃的条件下培养，接种后第十天，作第一次继代，以后每7天继代一次，每次倒掉3/4-4/5培养液和细胞，然后加入新鲜的相同培养基到原液面，进行下一次继代；(8)、返回固体培养基经5-7次继代的悬浮细胞系，在无菌条件下，用150目不锈钢网筛过滤，去掉大块的愈伤组织，滤液用400目筛网过滤，留取悬浮细胞，将悬浮细胞接种到上述固体培养基上，放置黑暗条件下，27℃±2℃，培养三周；(9)、分离大块愈伤组织从步骤(8)用150目筛网分离挑选出的大块、不分散的愈伤组织，放到上述相同的固体培养基上，进入步骤(10)的继代保存；(10)、大块愈伤组织的保存将步骤(9)挑选的大块、不分散的愈伤组织，在上述相同的固体培养基上继代保存备用；(11)、分离出分散性好、颗粒状细胞系步骤8的悬浮细胞，经过三周的固体暗培养后，用100目的筛网分离得到细胞团，为生长快速、颗粒细小的3-8个细胞组成的细胞团。然后进入到步骤12的细胞系悬浮培养(12)、细胞系悬浮培养步骤(11)的挑选得到的分散性好、颗粒状细胞系按上述步骤(7)的悬浮培养条件继代培养，形成高等植物的细胞悬浮系；(13)、步骤(12)的悬浮培养细胞系经扩样本后，在磁力搅拌反应器中继代后，第7天加入大块愈伤组织，共同培养72小时，所得到的悬浮细胞和悬浮液中即含有雷公藤总生物碱。
2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(3)诱导愈伤组织的培养基的成分为MS基本培养基加肌醇100mg/L、VB10.5mg/L、VB60.5、NA 0.5mg/L、甘氨酸2mg/L、蔗糖30g/L、2.4-D 1mg/L、NAA 0.2mg/L、琼脂6g/L，PH5.8。
3.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(2)的灭菌方法为外植体放在150ml的三角瓶中，放2-3克洗衣粉或2-3滴吐温-60，放在自来水龙头上，小水流冲洗2-3小时，然后移入另一灭菌过的三角瓶中，倒入75％酒精，放置60秒，对于干种子放置90秒，然后到掉酒精，倒入0.1％HgCl灭菌保持12-15分钟，倒出HgCl液后，用无菌水冲洗3次，最后一次在无菌水中停留3-4分钟，然后吸干。
4.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(13)所述的磁力搅拌器的运转条件为每分钟120转，磁力转子长8cm，直径0.8-1.2cm。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(7)的液体培养条件为每150ml三角瓶中装75ml液体培养液，每瓶接种1-1.5g鲜重的愈伤组织，放到往复式80-90转/分的摇床上培养。
6.根据权利要求1-5中任一权利要求所述的方法，还进一步包括挑选高产细胞株的步骤(1)、生产细胞株从权利要求1-5中的任一权利要求的步骤(13)得到的悬浮系，进入对数生长速率后，及时地挑选出部分悬浮细胞，移到以下步骤(2)所述的固体培养基上；(2)、将从(1)中挑选的悬浮细胞转移到含有MS+2.4D 0.5mg/L+BA或KT 0.1-0.2mg/L、肌醇100mg/L、VB10.5-1.0mg/L、VB60.5-1.0mg/L、NA 0.5-1.5mg/L、CH 500-1000mg/L、蔗糖30-45g/L、琼脂6g/L的固体培养基上，每35-45天继代一次，在1500 LUX光照12小时，27℃±2℃条件下生长保存；(3)、将步骤(2)继代一次的愈伤组织转一部分到MS+BA 0.5mg/L+KT 0.05mg/L+步骤(2)的其它相同成份的分化培养基上，测定其再生植株的分化频率；(4)、筛选高产细胞株重复(1)、(2)、(3)步骤，不断筛选出高产细胞株。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于步骤(2)继代一次所用时间为45天。
全文摘要
本发明涉及一种植物悬浮培养细胞生产雷公藤总生物碱的方法，包括选取外植体、表面灭菌、诱导愈伤组织、继代培养、挑选细胞株、固体继代、悬浮培养、分离大块愈伤组织、大块愈伤组织保存、分离分散性好、颗粒状细胞系、细胞系悬浮培养、悬浮培养细胞系与大块愈伤组织混合共培养、提取总生物碱等步骤。本方法得到的产物所含雷公藤总生物碱的量为植物体的2.9倍，并且具有细胞系稳定性强，生产周期短，药物成份含量高，生产过程不污染环境等优点，并有利于保持自然界雷公藤资源的可持续生长。
文档编号C12N5/04GK1434123SQ0210077
公开日2003年8月6日 申请日期2002年1月25日 优先权日2002年1月25日
发明者曹华兴, 胡凡 申请人:北京达科豪科技有限公司, 曹华兴, 胡凡