重组dna序列,编码的免疫融合蛋白及表达方法

专利名称：重组dna序列,编码的免疫融合蛋白及表达方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，尤指以基因重组技术得到的重组DNA序列(DNAs)，以及与之相对应的编码的免疫融合蛋白及其表达方法。
包括细胞因子在内的很多具有药用意义的生物因子，只在体内产生瞬间及局部的生物作用，所以其循环周期相对很短。例如，人血清中的干扰素的半衰期就只有2-8小时(Roche labs.Referon A.Schering Intron A.Physicians’desk Referece，47thedition，pp.2006-2008，2194-2201)。为使这些生物因子产生一种有效的系统治疗效果，患者需要接受相对大的剂量和高频率的给药。这样的给药十分不方便，也会使患者承受很多疼痛之苦，同时也会增加药物的毒副作用。为了克服这些缺点，就需要修饰该药物分子，使其在不减少药物效力的前提下增加它在血液中的循环周期时间。
人体免疫球蛋白IgG是血液中富含的一种蛋白，其典型的半衰期可长达21天。利用IgG分子的绞链和Fc区与其他蛋白的功能区所构建的融合蛋白已有文献报道(Mordenti J.et al.，Nature，1989，337525-31；Capon DJ and Lasky LA，US pat.No.5,116,964；Kurschner C.et al.，J.Immunol.1992，1494096-4100；Chang TW and Yu L，US pat.No.5,723,125；Lo KM et al.，US pat.No.5,541,087；Gillies SD et al.，PNAS USA，1992，891428-1432；Capon DJ et al.，Nature，1989，337525-31；Gillies SD et al.，Bioconjugate Chemistry，1992，4230-235)。很多可溶性蛋白都通过这种方式成功地进行了修饰，比如细胞因子(如IL-2，IL-10等)，酶(如尿激酶等)，以及细胞表面受体的胞外结构域。这种融合蛋白的构型是一个同型二聚体，结构类似于一个没有CH1结构域和轻链的IgG分子，它通过IgG绞链区里面的半胱氨酸残基通过二硫键连接起来。由于具有结构同源性，Fc融合蛋白在体内表现出来的药代动力学性质与相似种型的人源化单克隆抗体相同(Capon DJ et al.，Nature，1989，337525-31；Chaudhary et al.，Nature，1989，339394)。
内部核糖体进入位点(IRES)允许在一个mRNA分子上进行2个开放阅读框的翻译(Rees s.et al.1996，BioTechniques 2012-104；Jackson RJ et al.1990，TrendsBiochem.Sci.15477-483；Jang SK et al.1988，J.Virol.622636-2643)。当融合蛋白编码序列通过内核糖体进入位点连接到选择性标记蛋白的N端时，双顺反子mRNAs则被作为融合蛋白和选择标记蛋白的双重翻译模板。因为内部核糖体进入位点(IRES)的翻译效率较低，所以在IRES下游区域放置选择性标记位点就增加了它的选择性压力。在加入适当试剂的选择后，几乎所有幸存的克隆都会稳定地表达感兴趣的融合蛋白，从而减少了为寻找高产功能克隆株而需筛选的克隆株的数量。
为达上述目的，本发明采用的技术方案如下本发明涉及到的免疫融合蛋白的重组DNA序列，依次为编码分泌信号肽、免疫球蛋白Fc区、免疫惰性肽连接链、以及哺乳类目的蛋白的DNA序列，以上各部份编码序列均位于同一翻译框架。
本发明所涉及的免疫融合蛋白的重组DNA序列，也可以是另一种结构，依次为编码分泌信号肽、哺乳类目的蛋白、免疫惰性肽连接链、以及免疫球蛋白Fc区的DNA序列，以上各部份编码序列均位于同一翻译框架。
本发明的一个特征是上述的免疫融合蛋白也包括在编码框内或者编码框外的其他多肽链序列，比如选择性标记蛋白，蛋白酶识别位点(如特殊蛋白裂解酶位点)，多肽表面抗原的序列(如可以通过蛋白识别位点被裂解掉从而便于纯化的表面抗原)。
本发明的一个特征是免疫融合蛋白的重组DNA还包括其他序列，比如载体、启动子、调控序列(比如5’和3’序列)以及核糖体结合位点，比如IRES。
本发明的另一个特征是免疫融合蛋白以及相应的重组DNA序列，按5’-3’方向顺序，依次编码分泌信号肽序列，免疫球蛋白Fc区(或者哺乳类目的蛋白编码序列)，免疫惰性多肽连接链序列，哺乳类目的蛋白编码序列(或者免疫球蛋白Fc区)，在理想的情况下，选择性标记蛋白可通过IRES连接到融合蛋白的下游，从而提高选择压力。这种融合蛋白表达质粒的结构使得哺乳类目的蛋白的表达比现有的技术更为优越。另外，表达质粒调控序列可以优化，哺乳类目的蛋白编码序列可以是任何目的基因，因此，本发明适用于构建及表达多种融合蛋白。
本发明的另一个特征在于采用基因重组方法构建DNA表达载体，并使其在哺乳动物细胞中高效表达，从而产生具有实用价值的免疫融合蛋白。使用本发明涉及的重组DNA序列及其生产哺乳类目的蛋白方法，在充分保留哺乳类目的蛋白生物活性的前提下，免疫融合蛋白的产量可高达每升100-300毫克。原因为1)将哺乳类目的蛋白编码序列免疫球蛋白Fc区的N端或C端连接，并在真核宿主细胞，特别是哺乳动物细胞中表达，使哺乳类目的蛋白的生成过程简单化。未成熟融合蛋白的信号肽在细胞内被完全切去以后，成熟融合蛋白被分泌到培养液中，有利于产品的收集；2)蛋白的天然构型及其立体灵活性与生物活性关系密切。当被融合的两段蛋白之间被引入一个连接体，则有利于保留各自的天然构型及其立体灵活性，从而保留其生物活性；3)通常情况下，在融合位点上产生的新抗原可以通过加入一段免疫惰性肽段的方法来消除；4)将选择性标记与免疫融合蛋白编码序列通过IRES连接，提高了免疫融合蛋白高产株筛选效率。另外，免疫融合蛋白的Fc区多肽链使其分离纯化效率大幅提高。
本发明特别提到的免疫融合蛋白系指包含哺乳类目的蛋白，免疫球蛋白Fc区及免疫惰性肽连接链的融合蛋白。
本发明的优点是无论将哺乳类目的蛋白与免疫球蛋白Fc区的C端或者N端连接，免疫融合蛋白都能在宿主细胞中产生高水平表达，并延长哺乳类目的蛋白在人体内的半衰期。免疫惰性肽链连接体可提高相融合蛋白链的灵活性，从而保持他们天然的生物活性，并消除了融合位点产生新抗体的可能。另外，融合产物的Fc区可以通过与蛋白A，蛋白G，以及其他类似物特异性结合，使融合蛋白的纯化及制备简单而高效。
本发明重组DAN序列编码的免疫融合蛋白可以作为制备药物或药物的组成成分应用。
为了进一步理解本发明的实质，下面结合附图和具体实施方式
对本发明做进一步详细说明。


图1-B重组DNA序列所编码的融合蛋白结构2。
图2狒狒体内血药浓度-注射后时间曲线。
图3狒狒体内不同给入方式IFN-α2b-Fc的药时对比。
本发明所涉及的重组DNA以及由其编码的免疫融合蛋白结构可参见图1-A和图1-B。以双顺反子形式编码免疫融合蛋白及选择性标记蛋白的重组DNA序列示于相应的起始和终止符号之间。启动子，增强子，Kozak序列等上游的调控序列，以及聚腺苷酸化信号等3’调控序列为已知的基因表达必需的调控因子，所以未在图中表示。总之，除所示序列外，本发明中的多核苷酸结构可以包括任何使融合蛋白在宿主细胞中有效表达的调控及非调控序列。
在包括了所有必要的5’(包括启动子，增强子，Kozak序列等)和3’(聚腺苷酸化信号序列)调控序列的前提下，本发明所涉及的多核苷酸包括6个不同的部分。1)信号肽编码序列；2)哺乳类目的基因序列；3)免疫惰性肽连接体序列；4)Fc编码序列；5)IRES序列；6)选择性标记序列。图1-A和1-B中除了哺乳类目的基因序列和Fc编码序列在位置上相互交换，其它完全相同。所以，免疫惰性连接肽既可以和哺乳类目的蛋白的N端也可以与其C端连接。在图1-A中，Fc的天然终止密码子以及哺乳类目的蛋白的天然信号肽序列被去除了；而哺乳类目的基因的终止密码子仍保持不变。在图1-B中，目的基因的终止密码子被去除，而Fc的终止密码子被保留。
免疫融合蛋白的编码序列可以是基因组DNA或者cDNA构型。因此，此编码序列可以包含或不包含内含子(天然的或者非天然的)。有实例证明，在某些条件下，编码序列中包含内含子可以提高蛋白表达量。其他未在图中表示的序列，包括但不限制于稳定mRNAs的人工内含子，可视需要附加。
本发明中的信号肽序列为编码未成熟蛋白上转移小肽的多核苷酸序列，转移小肽可引导未成熟蛋白分子在细胞内跨越内质网膜，并经过修饰后，分泌至胞外。有关信号肽的结构与功能的研究已很成熟，典型的序列含有16-30个氨基酸残基，但有些序列的氨基酸残基可少于16或多于30个。一个典型的信号肽包括三个区碱性N末端，中间疏水区和极性C末端。中间的疏水区包括4-12个疏水氨基酸残基，其作用是使新生的多肽链在运输中把信号肽停留在膜脂双层中间。接下来，信号肽通常在内质网的内腔中被信号肽酶切掉。通常的信号肽切割遵循“(-3，-1)原则”，因而典型的信号肽通常在-1，-3位置上含中性小分子氨基酸，并且，此区域不存在脯氨酸残基。信号肽酶通常在-1到+1位置将信号肽切除，本发明倾向于使用切除位点在0位的信号肽序列，包括N端融合伙伴的天然信号肽，以及人工合成或源于不同分泌型蛋白的信号肽序列。来源于不同蛋白的信号肽可以通过基因重组技术相互置换，成熟蛋白的结构与功能不会因此有任何变化。适应于特定融合蛋白分泌表达的信号肽序列可通过一些常规试验加以选择，这些实验包括测定所选信号肽的分泌效率，如融合蛋白的分泌产量及生物活性。此外，信号肽还可以依以上原则人工合成。本发明所指的信号肽序列也可以被称为“信号肽”，“先导序列”，或“先导肽”，在这里它们都和信号肽序列是同义关系。本发明中提到的信号肽包括但并不限于1)抗体轻链信号肽序列，例如，小鼠IgG Kapa链的先导序列(Technical bulletin，Invitrogen)；2)抗体重链先导序列，如MOPC141抗体重链信号序列(Sakano et al.，1980，Nature 2865774)；3)哺乳类目的蛋白的天然信号肽序列；4)以及任何众所周知的其他信号序列。
免疫球蛋白的Fc区为免疫球蛋白重链C末端不变区的氨基酸序列。Fc区在决定免疫球蛋白的生物学性质上起着重要的作用。众所周知，免疫球蛋白的重链包括4个或者5个区域IgM和IgE的重链包括5个区域，而IgA，IgD和IgG的重链有4个区域。IgA，IgD及IgG的Fc区是绞链-CH2-CH3双体；IgM和IgE中，Fc区则是绞链-CH2-CH3-CH4域的双体。几乎所有已知的Fc区都可以作为本发明所涉及的免疫融合蛋白的一部分。本发明首选的免疫球蛋白Fc区来自人免疫球蛋白gamma-4(IgG4)，其优点为1)在人体血液中很稳定；2)在很多细胞类型中都可高效分泌表达；3)其生物特性已知；4)可以避免诸如补体反应及ADCC等需要避免的第二生物学特性。本发明首选的gamma-4 Fc区至少会包含绞链，CH2和CH3三个区域。如前所述，IgA，IgD，IgE，IgM和IgG1-3的Fc亦可作为免疫融合蛋白的Fc部份，同样，经过分子修饰(如，删除)的Fc段也可以被用于本发明。分子修饰所用的分子生物学方法已成常规，在此不再赘述。
本发明所涉及的免疫惰性肽连接链可增加融合伙伴(如目标蛋白和Fc区)的灵活性，从而有助于保留蛋白的天然构型和生物活性。虽然本发明所涉及免疫融合蛋白的Fc区和目标蛋白均源自相应宿主，单独使用不会使宿主产生免疫反应，但将二者融合后，可能会在融合位点产生新的免疫表面抗原。所以，本发明中的连接肽的另一优点就在于降低了融合位点的免疫原性。免疫惰性肽连接体的序列可以是不在宿主中引起免疫反应的任何肽链，长度不限，其作用表现为降低免疫原性和提高Fc与目标蛋白的生物活性。本发明首选的肽连接链来自人T细胞免疫惰性肽链，其结构包括甘氨酸-甘氨酸-丝氨酸和/或甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-丝氨酸的重复序列。连接肽的长度没有特别的限制，可以是几个氨基酸也可以是几十个氨基酸。“免疫惰性”这个词，意味着所涉及的肽连接链在特定宿主(比如人)中不引起免疫反应。
本发明所涉及哺乳类目的蛋白的种类没有限制。实际上，本发明旨在提供一个广义的，适用于任何哺乳类目的蛋白的多核苷酸及其编码的免疫融合蛋白的结构及生产方法。在这里，“哺乳类目的蛋白”这个词，是指可利用本发明进行修饰和生产的任何有实用价值的蛋白。哺乳类目的蛋白可以是酶、激素、趋化因子、细胞因子、凝血因子等等，包括但不限于生长激素、细胞介素(例如白介素-2、白介素-6、白介素-10)、干扰素、第八因子、成形因子、红细胞生成素等。哺乳类目的蛋白还可以是嵌合体、突变体、多形核蛋白体等。
如上所述，本发明所涉及的信号肽序列、哺乳类目的蛋白序列、惰性肽连接链序列和Fc区需相互融合在同一翻译框架中以表达所需融合蛋白。“框架”系指一段连续的没有终止密码子的开放阅读框序列。将不同编码序列通过基因重组构建在同一翻译框架中的方法已为常规。在此结构中，有必要根据所涉及基因在免疫融合蛋白中的位置和分子牛物学基本原理对启始密码子、终止密码子及信号肽序列进行必要的取舍。例如，位于免疫融合蛋白N端的基因，就不可含有终止密码子子；而位于C端的基因，其启始密码子或天然信号肽序列就必须删除。
本发明所涉及的重组DNA序列还可进一步包括其他可提高蛋白表达量、保留生物活性、以及降低筛选及纯化难度等的多核苷酸编码序列。例如，本发明可包括的一个连接免疫融合蛋白和下游选择性标记的内部核糖体进入位点(IRES)，从而产生一个可同时翻译出免疫融合蛋白和选择性标记的双顺反子mRNA。IRES允许核糖体从同一个mRNA分子上翻译2个开放阅读框(Rees s.et al.1996，BioTechniques 20102-104；Jackson RJ et al.1990，Trends Biochem.Sci.15477-483；Jang SK et al.1988，J.Virol.622636-2643)。当免疫融合蛋白的编码基因通过IRES被连接到选择性标记基因时，双顺反子mRNAs作为模板，既可翻译出融合蛋白，也可翻译出选择性标记蛋白，而且，由于IRES的翻译效率较低，所以选择性标记的表达就会低于其上游的免疫融合蛋白，从而显著提高了高产株筛选过程中的选择性压力和效果。另外，由于免疫融合蛋白基因和选择性标记基因的转录受控于同一个启动子，于是几乎所有经筛选幸存的转染体都会包含正确的融合基因，及高效表达所需的免疫融合蛋白，从而减少了筛选大量克隆来获得高产珠的周期和工作量。本发明首选的IRES来自脑心肌炎病毒(ECMV)，富含ATG三核苷酸。据推测，IRES中ATG三核苷酸促进了核糖体的进入，从而使其下游基因得以顺利翻译。虽然脑心肌炎病毒(ECMV)中分离出的IRES的作用机制还不十分清楚，但是仍有可能使用现有的分子生物学方法来进行人工改造(如删除、突变、插入等)。经修饰的任何有功能的IRES变异体都可用于本发明。
本发明可以使用不同的选择性标记。选择性标记可赋予所需转染体一个可识别和选择的表型特征，从而使在宿主基因组中含有免疫融合蛋白重组DNA的细胞很容易被分离及克隆。本发明可用的选择性标记包括，但并不限制于如下二氢叶酸还原酶(DHFR)、新链丝菌素(Neomycin)等。
本发明重组DNA基因序列可以被克隆到一个表达载体中。因此，本发明中提到的重组DNA基因结构还进一步包括位于相应载体上的核苷酸序列，这些序列均属常规分子克隆技术范畴，在此不一一列举。所选择的载体类型应与所选表达宿主细胞相匹配，例如使用酵母细胞、哺乳动物细胞或细菌等作为宿主，则需选择可在相应细胞中正常表达的载体。为方便不同目的基因的融合修饰及表达，可以构建一个基本的表达载体，此载体应包括除去本发明重组DNA序列中目的基因以外的其他各部分基因，并应在此基本表达载体上目的基因的插入位点引入限制性内切点。最终的表达载体可被用来转染任何适当的表达宿主细胞。DNA的操纵，扩增以及重组过程为分子生物技术常规，所以不做详述。如何选择及克隆适用于本发明并有实用价值的目的基因，目前已有成熟的方法。总之，本发明所涉及的DNA重组结构，均可以通过已知的DNA重组技术来实现，如限制性内切酶的使用，DNA的连接，cDNA合成，聚合酶链反应等等。另外，诸如启动子等用于表达调控的DNA序列也已为众所周知。适用于本发明的载体类型可包括，但不限于质粒和病毒(包括动物病毒)。
本发明也涉及到免疫融合蛋白的表达方法，包括由本发明描述的重组DNA转染而有效表达免疫融合蛋白的宿主细胞的培养方法和条件。任何宿主细胞都可以用于表达免疫融合蛋白，包括但并不限制于如下酵母细胞、哺乳动物细胞(包括人、大鼠、小鼠、猴子等)和昆虫细胞等。本发明所用的哺乳动物宿主细胞系包括，但并不限于CHO、BHK、NS/0、293等。这些细胞可以生长(如“培养”)在各种不同的有利于融合蛋白表达的条件下。这里“表达”这个词，指的是多核苷酸链被转录以及翻译成蛋白质的过程。细胞的培养条件包括但不限于培养基、空气中氧气和二氧化碳浓度、温度、pH值、缓冲液等等，这些条件的选择亦属常规。
宿主细胞需经本发明中涉及的多核苷酸转染并筛选后而成为免疫融合蛋白的表达株。细胞转化可使用，但不限制于磷酸钙法、电穿孔法、病毒、脂质体等，总之，任何能使多核苷酸进入细胞的方法都可以被使用。进入宿主细胞的多核苷酸可以被瞬时表达，也可以整合到基因组DNA上稳定表达。
本发明重组DNA序列表达的免疫融合蛋白包含哺乳类目的蛋白，免疫球蛋白Fc区及连接它们的免疫惰性肽连接链。
使用常规的商业试剂盒(Promega)可分离出VLN3G2人杂交瘤的总RNA。将3’引物(SEQ ID NO2)加入到含有1μg总RNA、逆转录酶(RT)、dNTP和缓冲液的反应液中，于42℃温育30分钟，再于80℃温育30分钟使逆转录酶失活。以此合成的cDNA单链可用乙醇沉淀，再置于标准的PCR反应液(包括引物，dNTPs，1x含Mg离子的反应缓冲液和Taq聚合酶)中进行30个扩增循环。PCR产物在经EcoR I和BamH I消化30分钟后，用琼脂糖电泳及GeneClean II(Bio 101)显现和纯化。经酶消化及纯化后的PCR产物可克隆到经EcoR I和BamH I消化的哺乳动物表达载体pIRES-DHFR上。pIRES-DHFR系由购自Clontech公司的pIRES-NEO载体修饰而来，该载体在其多克隆位点依次含EcoR I，BamH I和Not I酶切位点(5’-3’方向)，以及下游的IRES序列和DHFR基因。构建好的基本表达载体均通过DNA测序加以验证。
如把Fc作为C末端的融合部分时，IFN 2b基因可用SEQ ID NO8和SEQ IDNO9为引物通过PCR获得。SEQ ID NO8(5’引物)包括一个EcoR I酶切位点，随后是IFN 2b前导序列的前24个核甘酸；SEQ ID NO9(3’引物)包括SEQ ID NO3序列4-18位核苷酸的互补序列(含有BamH I位点)和IFN 2b最3’端的21个核苷酸互补序列(不含终止密码子)。PCR产物经过EcoR I和BamH I酶切之后，可克隆到实施例2中描述的表达载体的相应酶切位点中。所得DNA转染到合适的宿主体系中，即可得到IFN 2b-Fc融合蛋白。在此，免疫惰性连接肽的长度为15个氨基酸残基。
如把Fc作为C末端的融合部分时，HuGH基因可用SEQ ID NO12和SEQ IDNO13为引物通过P℃R获得。SEQ ID NO12(5’引物)包括一个EcoR I酶切位点，随后是HuGHb前导序列；SEQ ID NO13(3’引物)包括SEQ ID NO3序列1-18位核苷酸的互补序列(含有BamH I位点)和HuGH基因最3’端的21个互补核苷酸序列(不含终止密码子)。PCR产物经过EcoR I和BamH I酶切之后，可克隆到实施例2中描述的表达载体的相应酶切位点中。所得DNA转染到合适的宿主体系中，即可得到HuGH-Fc融合蛋白。实施例5Fc-IL2和IL2-Fc融合蛋白的表达载体的构建人白细胞介素2(IL2)的基因系通过RT-PCR从一个经Con A激活的Jurkat T细胞cDNA文库中分离得到。将Fc融合到N末端和C末端所使用的引物不同。
当Fc作为N末端的融合部分时，使用引物SEQ ID NO14(5’引物)和SEQ IDNO15(3’引物)进行PCR扩增。依5’-3’顺序，SEQ ID NO14包括SEQ ID NO3序列中13-48的核苷酸序列和位于IL2基因信号肽之后最5’端成熟编码序列；SEQID NO15包括Not I酶切位点和IL2最3’端的互补编码序列(包括天然的终止密码子TAG)。PCR产物经过凝胶分离纯化之后，进一步使用BamH I和Not I酶切消化。经再次凝胶纯化，PCR产物可被克隆到经BamH I和Not I消化的基本载体中(见实施例1)。将得到的DNA转染到一个适合的宿主体系中即可以表达出所需的Fc-IL2融合蛋白。
如把Fc作为C末端的融合部分时，IL2基因可用SEQ ID NO16和SEQ IDNO17为引物通过PCR获得。SEQ ID NO16(5’引物)包括一个EcoR I酶切位点，随后是IL2基因前导序列的前23个核苷酸；SEQ ID NO17(3’引物)包括SEQ ID NO3序列1-18位核苷酸的互补序列(含有BamHI位点)和IL2基因最3’端的互补核苷酸序列(不含终止密码子)。PCR产物经过EcoR I和BamH I酶切之后，可克隆到实施例2中描述的表达载体的相应酶切位点中。所得DNA转染到合适的宿主体系中，即可得到IL2-Fc融合蛋白。
当Fc作为N末端的融合部分时，使用引物SEQ ID NO18(5’引物)和SEQ IDNO19(3’引物)进行PCR扩增。依5’-3’顺序，SEQ ID NO18包括SEQ ID NO3序列中13-48的核苷酸序列和位于IL10基因信号肽之后最5’端成熟编码序列；SEQID NO19包括Not I酶切位点和IL10最3’端的互补编码序列(包括天然的终止密码子TAG)。PCR产物经过凝胶分离纯化之后，进一步使用BamH I和Not I酶切消化。经再次凝胶纯化，PCR产物可被克隆到经BamH I和Not I消化的基本载体中(见实施例1)。将得到的DNA转染到一个适合的宿主体系中即可以表达出所需的Fc-IL10融合蛋白。
如把Fc作为C末端的融合部分时，IL10基因可用SEQ ID NO20和SEQ IDNO21为引物通过PCR获得。SEQ ID NO20(5’引物)包括一个EcoRI酶切位点，随后是IL10基因前导序列；SEQ ID NO21(3’引物)包括SEQ ID NO3序列1-18位核苷酸的互补序列(含有BamH I位点)和IL10基因最3’端的21个互补核苷酸序列(不含终止密码子)。PCR产物经过EcoR I和BamH I酶切之后，可克隆到实施例2中描述的表达载体的相应酶切位点中。所得DNA转染到合适的宿主体系中，即可得到IL10-Fc融合蛋白。
实例3-6所述免疫融合蛋白的瞬表达可在NS/0或者293细胞进行。107个宿主细胞被1-5微克经磷酸钙沉淀处理的线性质粒DNA转染后，经过48小时的培养后，收集含免疫融合蛋白的细胞培养液。
为了建立稳定及高效表达实例3-6所涉及的免疫融合蛋白，线性化表达载体DNA被用于转染CHO(dhfr-)细胞。转染后的细胞在含100nM MTX的培养基中培养48小时。在其后的4到5周内，逐步将MTX浓度增加至5-10μM。选择后的细胞可通过限定稀释成为克隆株。通过用ELISA法测定不同克隆株上清液中的免疫融合蛋白含量，选择产量较高的克隆株进行进一步筛选及克隆。最高分泌量的克隆株将被适应培养于特殊制作的悬浮培养基中，从而建成可悬浮生长的高产细胞株。
除磷酸钙沉淀法外，其他方法如脂质体转染和电转染等均适用于此实施例的细胞转染。这些转染方法的具体描述可详见Sambrool et al.(1989)MolecularCloning-A Laboratory Manual，Cold Spring Harber，NY。
实施例8免疫融合蛋白的分析与纯化当利用常规凝胶电泳对免疫融合蛋白进行分析时，培养液中的免疫融合蛋白先被结合于蛋白A琼脂糖(Repligen，Cambridge，Mass)上，层析柱经PBS清洗后，被结合的免疫融合蛋白用50mM(pH2.8)甘氨酸从蛋白A洗脱，并经冻干法浓缩，进而用还原和非还原SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。
免疫融合蛋白的大规模制备，需将培养液上清通过以PBS平衡的蛋白A琼脂糖层析柱。与蛋白A结合的免疫融合蛋白经醋酸钠缓冲液(100mM，pH4)洗脱，且经冻干浓缩。经此步纯化之后的免疫融合蛋白，其纯度可达90％以上，更高的纯度可通过1-2次凝胶过滤柱层析达到。免疫融合蛋白的纯度可以用SDS-PAGE和Western印记法(Western blot)加以验证，检测结果应只显示一条蛋白带。使用非还原凝胶电泳得到的免疫融合蛋白的分子量是使用还原凝胶电泳法的2倍，提示免疫融合蛋白为二聚体构型。
序列表<110>北京正青星光生物医学科技有限公司<120>重组DNA序列，编码的免疫融合蛋白及表达方法<130>PI010725/43<160>21<210>1<211>111<212>DNA<213>人工序列<400>1tcgaattccc caagctggct agccaccatg gagacagaca cactcctgct atgggtactg 60ctgctctggg ttccaggttc cactggtgac gagtccaaat atggtccccca 111<210>2<211>47<212>DNA<213>人工序列<400>2cccaaaggat ccacctgagc caccttacc cagagacagg gagaggc 47<210>3<211>48<212>DNA<213>人工序列<400>3ggtggctag gtggatccgg tggaggcgga agcggcggtg gaggatca 48<210>4<211>60<212>DNA<213>人工序列<400>4ggtggatccg gtggaggcgg aagcggcggt ggaggatcag agtccaaata tggtccccca 60<210>5<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>5gcgcggccgc tatttaccca gagacaggga 30<210>6<211>69<212>DNA<213>人工序列<400>6tcaggtggat ccggtggagg cggaagcggc ggtggtggag gatcatgtga tctgcctcaa 60<210>7<211>29<212>DNA<213>人工序列<400>7gcgcggccgc actttcctta cttcttaaa 29<210>8<211>51<212>DNA<213>人工序列<400>8tcgaattccc caagctggct agccaccatg gccttgacct ttgctttactg 51<210>9<211>42<212>DNA<213>人工序列<400>9cccaaaggat ccacctgagc cttccttact tcttaaactttc 42<210>10<211>60<212>DNA<213>人工序列<400>10ggtggatccg gtggaggcgg aagcggcggt ggaggatcat tcccaaccat tcccttatcc 60<210>11<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>11gcgcggccgc ctagaagcca cagctgccct 30<210>12<211>48<212>DNA<213>人工序列<400>12tcgaattccc caagctggct agccaccatg gctacaggct cccggacg 48<210>13<211>41<212>DNA<213>人工序列<400>13aaggatccac ctgagccacc gaagccacag ctgccctcca c 41<210>14<211>59<212>DNA<213>人工序列<400>14ggtggatccg gtggaggcgg aagcggcggt ggaggatcag cacctacttc aagttctac 59<210>15<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>15gcgcggccgc tcaagttagt gttgagatga 30<210>16<211>50<212>DNA<213>人工序列<400>16tcgaattccc caagctggct agccaccatg tacaggatgc aactcctgtc 50<210>17<211>44<212>DNA<213>人工序列<400>17aaggatccac ctgagccacc agttagtgtt gagatgatgc tttg 44<210>18<211>60<212>DNA<213>人工序列<400>18ggtggatccg gtggaggcgg aagcggcggt ggaggatcaa gcccaggcca gggcacccag 60<210>19<211>31<212>DNA<213>人工序列<400>19gcgcggccgc tcagtttcgt atcttcattg t 31<210>20<211>48<212>DNA<213>人工序列<400>20tcgaattccc caagctggct agccaccatg cacagctcag cactgctc 48<210>21<211>41<212>DNA<213>人工序列<400>21aaggatccac ctgagccacc gtttcgtatc ttcattgtca t 4权利要求
1.一种重组DNA序列，其特征在于依5’-3’顺序，依次为编码分泌信号肽、免疫球蛋白Fc区、免疫惰性肽连接链、以及哺乳类目的蛋白的DNA序列，以上各部份编码序列均位于同一翻译框架。
2.根据权利要求1所述的重组DNA序列，其特征在于其中编码的哺乳类目的蛋白DNA序列源于人类。
3.根据权利要求2所述的编码哺乳类目的蛋白序列为编码干扰素、白细胞介素2、白细胞介素10、及生长激素的DNA序列。
4.根据权利要求1所述的重组DNA序列，其特征在于其中的分泌信号肽序列为鼠kappa链V-J2-C信号肽序列。
5.根据权利要求1所述的重组DNA序列，其特征在于其中的免疫惰性肽连接链序列为T细胞免疫惰性肽序列(SEQ ID3)。
6.根据权利要求1所述的重组DNA序列，其特征在于其中的免疫球蛋白Fc区为人gamma-4。
7.根据权利要求1所述的重组DNA序列，其特征在于其中还包含一个位于分泌信号肽上游，并可使此重组DNA在哺乳细胞中有效表达的启动子序列。
8.根据权利要求1所述的重组DNA序列，其特征在于其中还包含位于其编码的免疫融合蛋白下游的IRES序列。
9.根据权利要求1所述的重组DNA序列，其特征在于其中包含选择标记序列。
10.一种重组DNA序列，其特征在于依5’-3’顺序，依次为编码分泌信号肽、哺乳类目的蛋白、免疫惰性肽连接链、以及免疫球蛋白Fc区的DNA序列，以上各部份编码序列均位于同一翻译框架。
11.根据权利要求10所述的重组DNA序列，其特征在于其中编码的哺乳类目的蛋白序列源于人类。
12.根据权利要求11所述哺乳类目的蛋白序列为编码干扰素、白细胞介素2、白细胞介素10、及生长激素的DNA序列。
13.根据权利要求10所述的重组DNA序列，其特征在于其中的分泌信号肽序列为鼠kappa链V-J2-C信号肽。
14.根据权利要求10所述的重组DNA序列，其特征在于其中的免疫惰性肽连接链序列为T细胞免疫惰性肽序列(SEQ ID3)。
15.根据权利要求10所述的重组DNA序列，其特征在于其中的免疫球蛋白Fc区为人gamma-4。
16.根据权利要求10所述的重组DNA序列，其特征在于其中还包含一个位于分泌信号肽上游，并可使此重组DNA在哺乳细胞中有效表达的启动子序列。
17.根据权利要求10所述的重组DNA序列，其特征在于其中还包含位于其编码的免疫融合蛋白下游的IRES序列。
18.根据权利要求10所述的重组DNA序列，其特征在于其中包含选择标记序列。
19.一种表达融合蛋白的方法，其特征在于用权利要求1-18中所述的任一重组DNA转染的宿主细胞快速生长及高效表达免疫融合体的方法。
20.根据权利要求19所述的重组DNA转染的宿主细胞是真核宿主细胞。
21.一种免疫融合蛋白，其特征在于它包含哺乳类目的蛋白，免疫球蛋白的Fc区及连接它们的惰性肽。
22.根据权利要求21所述的一种免疫融合蛋白，其特征在于其中的哺乳类目的蛋白源于人类。
23.根据权利要求22所述的一种免疫融合蛋白，其特征在于其中的哺乳类目的蛋白为干扰素、白细胞介素2、白细胞介素10及生长激素。
全文摘要
本发明涉及以基因重组技术得到的DNA序列，其编码的免疫融合蛋白及表达方法。本发明重组DNA还可通过加入一个连接免疫融合蛋白编码序列及其下游选择性标记序列的核糖体内起始位点(IRES)，以提高高产表达株的筛选效率。将重组的DNAs转染到宿主细胞中，可表达出本发明所涉及的免疫融合蛋白。该免疫融合蛋白可成为在血液循环中具有较长半衰期的新型生物制品，因而可以作为制备药物或药物的组成成分应用。
文档编号C12N15/11GK1435485SQ0210085
公开日2003年8月13日 申请日期2002年2月1日 优先权日2002年2月1日
发明者颜林 申请人:北京正青星光生物医学科技有限公司