专利名称：具有生物活性的重组中国人白细胞介素－12及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种具有生物活性的重组中国人白细胞介素-12及其制备方法，属于基因生物技术。
本发明还涉及该重组中国人白细胞介素-12的制备方法。
本发明的目的是通过下列技术方案实现的
一种具有生物活性的重组中国人白细胞介素-12，其特征在于该蛋白基因表达所采用的IL-12 P35和P40两个亚基cDNA基因是从中国人外周血细胞中克隆的，所克隆两个亚基基因采用内部核糖体切入位点(IRES)连接，中国人白细胞介素-12P35cDNA的核苷酸及推导的氨基酸序列
中国人白细胞介素-12P40cDNA的核苷酸及推导的氨基酸序列 注方格内碱基为基因突变点重组中国人白细胞介素-12的制备方法，其特征在于它按下列步骤进行a)首先从中国人的外周血按常规方法分离出单核细胞，用TRIZOL法提取细胞中的RNA，用RT-nest-PCR扩增法，在基因外侧分别设计的两对引物得到IL-12P35和P40基因片段插入pGEM-T Easy载体克隆，获得IL-12P35和P40基因；b)再次通过PCR方法从已克隆质粒上获得真核表达载体构建所需P35、P40 cDNA片段，引物设计时在起始点前加入SalI和NotI，XhoI和MluI及有利于真核细胞转录翻译的Kozak序列CCACC，然后通过相应的酶切点XhoI/MIuI，SalI/NotI将IL-12P35和P40亚基分别克隆到pIRES的多克隆位点MCSA和MCSB上，两个所克隆位点框架通过IRES相连，构建pIRES P35-P40双亚基单链质粒，XhoI和NotI酶切pIRES P35P40，将酶切片段P35-IRES-P40读码框架克隆到相应酶切的pCI-dhfr-载体，构建在CHO-dhfr缺陷细胞中表达的双顺反子共表达载体；c)宿主细胞的转染按照脂质体转染方法，转染细胞在选择培养基中经过稀传2-3周后，可见明显的细胞克隆形成，将单克隆细胞消化后，通过有限稀释法将细胞接种到96孔板中，细胞在培养基中生长初步筛选抗性克隆细胞最后采用双抗夹心ELISA法检测，获得7株分泌表达hIL-12P70的阳性克隆细胞，从96孔板中逐渐转移到24孔板、六孔板，最后转到大方瓶中，并继续培养使细胞生长稳定再加压筛选，在细胞培养液中加入二氢叶酸还原酶竞争抑制剂MTX，初始浓度为10-2μM，等细胞长成片时，至少1∶10比例稀传，抗性细胞有效的筛选IL-12基因得到有效扩增，同时获得生长良好的细胞株，每一浓度维持三代，经过20代的传代，MTX的浓度达到了5mM，细胞株表达产量不再明显的升高，最终获得稳定分泌表达rHuIL-12的基因工程细胞株；d)将获得的基因工程细胞株经过常规培养，每隔三天收获一次，细胞培养上清液经过初步纯化获得重组中国人白细胞介素-12。
本发明所获得的基因工程细胞株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏分类命名具有表达中国人白细胞介素-12的工程细胞系。
保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 。
地址中国.北京.中关村邮政编码100080保藏日期2001年12月12日保藏编号CGMCC-NO0663由于采取上述技术方案使本发明技术具有如下优点及效果a)本发明的技术是首次从中国人外周血细胞中克隆hIL-12两亚基cDNA基因同国外序列相比在核苷酸和氨基酸的序列不完全相同，从而更适合中国人的感染性疾病和肿瘤的治疗；b)采用内部核糖体切入位点，将IL-12P35P40两亚基基因相连构成单链读码框架，使其表达处于同一水平，不但有利于下游蛋白的纯化，而且能提高其生物活性，並将其应用于高表达CHO dhfr缺陷细胞系，使hIL-12表达水平得到提高；c)本发明所得到的重组中国人白细胞介素-12具有广泛的抗肿瘤、抗病毒、抗真菌、抗寄生虫等生物活性，特别是能增强机体细胞免疫活性，可在感染性疾病的治疗方面发挥作用，它具有强大的广泛抵抗感染性病原体的能力，为感染性疾病及肿瘤的治疗提供了有效的候选药物。
按
图1所示构建图进行，图中pIRES是质粒，为一双顺反子表达载体，大小为6.1kb，CMV为强启动子，MCSA和MCSB为两个多克隆位点，IRES为病毒内部核糖体切入位点，Amp氨苄青霉素抗性基因，Neo新霉素基因，SV40Poly(A)是加尾信号，XhoI是限制性内切酶，将含有识别序列的核酸切割为C TCGAGGAGCT C，MluI是限制性内切酶，将含有识别序列的核酸切割为A CGGCTTGCCG A，SalI是限制性内切酶，将含有识别序列的核酸切割为G TC GACCAGCT G，NotI是限制性内切酶，将含有识别序列的核酸切割为GC GGCCGCCGCCGG CG，P35和P40分别为IL-12两个亚基基因，pIRE SP35重组质粒，大小6.8kb，pIRES P35P40重组质粒，大小8.7kb，pCI-dhfr为真核表达载体，含二氢叶酸还原酶基因，DHFR为二氢叶酸还原酶基因，CMV IE早期启动子，Intron为真核细胞的内含子序列，pCIdhfrP35P40双亚基表达载体，大小7.0kb-先通过PCR方法从已克隆质粒上获得载体构建所需P35、P40cDNA片段，引物设计为
IL-12P40亚基40F 5’GTCGACCCACC ATG TGT CAC CAG CAG T 3’SalI Kozak40R 5’ATGCGGCCGC TTA CTA ACT GCA GGG CAC A 3’NotIIL-12 P35亚基35F 5’CCGCTCGAG CCACC ATG TGT CCA GCG CGC AGC C 3’XhoI Kozak35R 5’CGACGCGT CTA TTA GGA AGC ATTCAG ATA G 3’MluI在起始点前加入SalI和NotI，XhoI和MluI及有利于真核细胞转录翻译的Kozak序列CCACC，然后通过相应的酶切点XhoI/MluI，SalI/NotI将IL-12P35和P40亚基分别克隆到PIRES的多克隆位点MCSA和MCSB上，两个所克隆位点框架通过IRES相连，构建PIRES P35-P40双亚基单链质粒，XhoI和NotI酶切PIRESP35P40，将酶切片段P35-IRES-P40读码框架克隆到相应酶切的pCI-dhfr-载体，构建在CHO-dhfr-细胞中表达的双顺反子共表达载体；转染按照脂质体转染方法转染宿主细胞，转染细胞经稀传2-3周后，可见明显的细胞克隆形成，将单克隆细胞消化后，通过有限稀释法将细胞接种到96孔板中，细胞在选择培养基中生长，初步筛选抗性克隆细胞，最后采用双抗夹心ELISA法检测，获得7株分泌表达hIL-12P70的阳性克隆细胞，从96孔板中逐渐转移到24孔板、六孔板，最后转到大方瓶中，并继续培养使细胞生长稳定再加压筛选，在细胞培养液中加入二氢叶酸还原酶竞争抑制剂MTX，初始浓度为10-2μM，等细胞长成片时，至少1∶10比例稀传，通过抗性细胞的有效的筛选IL-12基因得到有效扩增，同时获得生长良好的细胞株，每一浓度维持三代，经过20代的传代，MTX的浓度达到了5mM，细胞株表达产量不再明显的升高，最终获得稳定分泌表达rHuIL-12的基因工程细胞株；再经过常规培养，每隔三天收获一次，细胞培养上清液经过纯化获得重组中国人白细胞介素-12。
IL-12最显著的生物学作用是刺激PHA活化的T淋巴细胞增殖和诱导T淋巴细胞产生γ干扰素。利用上述生物学作用我们对基因工程重组hIL-12的生物活性进行了鉴定。
a)T淋巴细胞增殖活性用MTS显色法检测，随着重组hIL-12浓度提高，OD490吸光度值也随之增高，具有明显的剂量依赖关系，说明重组hIL-12能够刺激PHA活化的T淋巴细胞增殖反应；b)诱导淋巴细胞产生γ干扰素表达上清具有明显的刺激淋巴细胞产生γ干扰素的能力，并且与样品浓度成一定比例关系，加入中和抗体后，其刺激诱导能力被完全抑制，进一步说明诱导γ干扰素是特异的，排除了其他可能存在因素的刺激作用。
权利要求
1.一种具有生物活性的重组中国人白细胞介素-12，其特征在于该蛋白基因表达所采用IL-12P35和P40两个亚基cDNA基因是从中国人外周血细胞克隆的，所克隆两个亚基基因采用内部核糖体切入位点(IRES)连接，克隆的中国人白细胞介素-12P35CDNA的核苷酸及推导的氨基酸序列为， 中国人白细胞介素-12P40cDNA的核苷酸及推导的氨基酸序列 注方格内碱基为基因突变点
2.如权利要求1所述的重组中国人白细胞介素-12的制备方法，其特征在于它按下列步骤进行a)首先从中国人的外周血中按常规方法分离出单核细胞，用TRIZOL法提取细胞中的RNA，用RT-nest-PCR扩增法，在基因外侧分别设计的两对引物得到IL-12P35和P40基因片段后，将其插入pGEM-T Easy载体，获得含有IL-12P35和P40的基因克隆；b)通过PCR方法从已克隆质粒上获得真核表达载体构建所需P35、P40 cDNA片段，引物设计时在起始点前加入SalI和NotI，XhoI和MluI及有利于真核细胞转录翻译的Kozak序列CCACC，然后通过相应的酶切点XhoI/MluI，SalI/NotI将IL-12P35和P40亚基分别克隆到pIRES的多克隆位点MCSA和MCSB上，两个所克隆位点框架通过IRES相连，构建pIRES P35-P40双亚基单链质粒，XhoI和NotI酶切pIRES P35-P40，将酶切片段P35-IRES-P40读码框架克隆到相应酶切的pCI-dhfr-载体，构建在CHO-dhfr缺陷细胞中表达的双顺反子共表达载体；c)宿主细胞的转染按照脂质体转染方法，转染细胞经过稀传2-3周后，可见明显的细胞克隆形成，将单克隆细胞消化后，通过有限稀释法将细胞接种到96孔板中，细胞在选择培养基中生长筛选抗性克隆细胞，最后采用双抗夹心ELISA法检测，获得7株分泌表达hIL-12P70的阳性克隆细胞，从96孔板中逐渐转移到24孔板、六孔板，最后转到大方瓶中，并继续培养使细胞生长稳定后再加压筛选，在细胞培养液中加入二氢叶酸还原酶竞争抑制剂MTX，初始浓度为10-2μM，等细胞长成片时，至少1∶10比例稀传，抗性细胞有效的筛选IL-12基因得到有效扩增，同时获得生长良好的细胞株，每一浓度维持三代，经过20代的传代，MTX的浓度达到5mM，细胞株表达产量不再明显的升高，最终获得稳定分泌表达rHuIL-12的基因工程细胞株；d)将获得的基因工程细胞株经过常规培养，每隔三天收获一次，细胞培养上清液经过纯化获得重组中国人白细胞介素-12。
全文摘要
本发明涉及一种具有生物活性的重组中国人白细胞介素－12及其制备方法,其特征在于该蛋白基因表达所采用IL－12P35和P40两个亚基cDNA基因是从中国人外周血细胞克隆的,所克隆两个亚基基因采用内部核糖体切入位点(IRES)连接,其方法是包括基因的克隆,真核表达载体的构建,宿主细胞转染,细胞株的培养及其表达产物的纯化,该产品具有广泛的抗肿瘤,抗病毒,抗真菌,抗寄生虫等生物活性,为感染性疾病及肿瘤的治疗提供了有效的候选药物。
文档编号C12N15/19GK1373221SQ0210086
公开日2002年10月9日 申请日期2002年2月4日 优先权日2002年2月4日
发明者焦宏远, 詹美云 申请人:中国预防医学科学院病毒学研究所