一种抗生素及其制备方法和应用的制作方法

专利名称：一种抗生素及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，更具体地说是通过培养具有保藏号为CGMCC NO.0703的不吸水链霉菌，得到一种新的抗生素及其应用。
本发明的主要技术方案通过培养不吸水链霉菌(Streptomycesahygroscopicus)。再从其发酵液中分离、纯化提取物，得到具有侧链为-C4H9O9的氮取代胞苷的抗生素。
本发明的抗生素具有侧链为-C4H9O9的氮取代胞苷、分子式为C13H21N3O14分子量为443的化合物，其结构式为 通过红外光谱、碳谱、氢谱测得具体侧链为 的分子结构式 本发明的抗生素的制备方法，包括以下过程(1)抗生素生物发酵培养将有机碳源、有机氮源、速效碳源、无机氮源、无机盐以及水和不吸水链霉菌加入到容器中，培养不吸水链霉菌，在20-34℃下进行一级发酵、两级发酵或三级发酵，一级发酵时间45-100小时，两级发酵时间分别为16-45小时、30-80小时，三级发酵时间分别为16-45小时、16-45小时、30-80小时，得到抗生素含量为1000-3500微克/毫升的培养物培养方法采用转速为90-300转/分的摇床震荡培养或者采用液体深层发酵培养罐压维持0.02-0.10MPa、风量比为1∶0.15-1∶1，搅拌转速为50-300转/分钟接种量为2-15％(V/V)，所述的有机碳源为1-5％、有机氮源为0.2-5％、速效碳源0.5-4％、无机氮源0.2-1.5％、无机盐0.01-1.0％，以上百分数以水的重量为100计。
(2)抗生素的分离将步骤(1)收集的含抗生素的培养物，用草酸酸化到pH值为2.0，搅拌后静置12-24小时后过滤，滤液经颗粒活性炭粒脱色，活性炭柱流出液再用732#阳离子树脂吸附，先用水先脱，再用0.5N氨水洗脱，流速0.5-3ml/分钟，当流出液pH值大于7.0后开始接收，浓缩接收液至，原体积的1/10-1/20再经中性氧化铝柱脱色，先用水洗脱，再用氨水洗脱，收集活性高的流出液浓缩至干，干粉用1-5毫升水溶解后上LH-20葡聚糖凝胶柱，用蒸馏水洗脱，流速0.5-1.5ml/分钟，收集活性高的流出液浓缩至干，即得到抗生素含量为30-45％的粗制品。
(3)抗生素的纯化将步骤(2)得到的粗制品经葡聚糖凝胶G-25柱层析，水洗脱，流速为0.5-1.5ml/分钟，经高压液相色谱(HPLC)检查后将主要成份量在75％以上部分合并，然后冷冻干燥，再经HPLC半制备柱进行制备，得到抗生素含量达70-86％精制品。
步骤(1)所述的不吸水链霉菌包括不吸水链霉菌黄山变种。不吸水链霉菌黄山变种是从安徽省黄山土壤中分离得到的一株编号为2-16的能产生有生物活性物质的链霉菌，经分离鉴定，将该链霉菌定名为不吸水链霉菌黄山变种(Streptomyces ahygroscopicus var.huangsanensis)(石义萍等，微生物学报，3984-86，1999)。该菌株已交中国科学院微生物所菌种保藏中心保藏，保藏号为CGMCC NO.0703。该菌株的传代培养采用高氏合成一号琼脂培养基(中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)编菌种目录，第三版，中国农业科技出版社，1997年)步骤(1)所述的有机碳源包括玉米粉、糊精、山芋淀粉，可溶性沉粉、小麦粉；所述的有机氮源包括黄豆粉、花生饼粉、棉籽饼粉、菜籽饼粉、黄豆饼粉、蚕蛹粉、酵母粉、酵母膏、鱼粉、蛋白胨，所述速效碳源包括麦芽糖、葡萄糖、蔗糖，所述的无机氮源包括硝酸铵、硫酸胺、氯化铵、硝酸钠、硝酸钾，所述的无机盐包括硫酸镁、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、碳酸钙、氯化钠。
本发明的抗生素的生物活性检测以巨大芽孢杆菌ACCC10008(Bacillus megatherium)(中国普通微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心编中国农业菌种目录，中国农业科技出版社，1991年)为检测菌，马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA培养基20％土豆汁，2％葡萄糖，0.8％琼脂)为检测培养基，采用管碟法检测抗生素的生物活性。
本发明的抗生素的应用方法含抗生素的发酵培养物、粗制品或精制品均可用于防治农作物真菌病害，可直接使用或添加助剂或与其它农药混合使用，直接使用时通常用水稀释至使用浓度为25-200微克/毫升。对于含抗生素为1000-3500微克/毫升的不吸水链霉菌的发酵培养物，在田间使用时，将发酵培养物经过滤得到的滤液经减压浓缩至原液的1/8-1/3倍，浓缩温度40-70℃，制得浓缩液，或者通过喷雾干燥方法制得粉剂，浓缩液或粉剂可直接使用，也可添加助剂或与适当的化学农药或生物农药混合使用，对于不同的农作物、不同部位发病部位采用不同方法和不同浓度对叶、茎部病害，常对浓缩液加水稀释使用，用稀释100-400倍的药液喷雾，蔬菜病害一般喷2-3次，间隔期7-10天；对种传病害常进行种子消毒，一般用50-100倍水稀释后的药液浸种1-24小时；对苗床、营养钵，可采用100-250倍水稀释后的药液进行土壤消毒，对土传病害以药液灌根；对果树茎部病害可直接用浓缩液对患部进行涂抹。本发明的抗生素用于防治真菌病害效果较好，对各种作物真菌病害防治效果有一定差异，一般在60-99％之间。
本发明的抗生素切忌与强酸、强碱混用。喷施抗生素的时间以晴天、阴天为宜，不要在大雨前后或露水未干以及阳光强烈的中午喷药。贮存地点应选择在通风、干燥、阳光不直接照射的地方，在低温条件下贮存，可大大延长贮存期。
本发明的优点和效果本发明的抗生素是一种结构不同于已知的任何核苷类抗生素一种新的抗生素，用于防治农作物真菌病害效果较好，一般防治效果为60-99％。例如防治黄瓜白粉病，防治效果为91％以上，防治番茄叶霉病可达86.93％，而且与化学农药相比，产品无毒，不污染环境，是一种无公害的生物农药。综上所述，本发明提供了一种自行开发研究的具有高效、广谱、低毒特性的用于防治农作物病害的新的抗生素，对于保护生态环境，促进农业持续发展有着重要意义。
实例中附图简要说明

图1是本发明抗生素(a)以及杀稻瘟菌素S(b)、多氧霉素(c)的化学结构式；图2是本发明抗生素的质谱图；图3是本发明抗生素的红外吸收光谱；图4是本发明抗生素的碳谱图(13C-NMR)；图5是本发明抗生素的碳谱图(DEPT)；图6是本发明抗生素的氢谱图(DMSO)；图7是本发明抗生素的氢谱图(D2O交换)。
实例1本实例采用摇床震荡方法进行抗生素生物发酵培养。
在含黄豆粉2％，葡萄糖3％，可溶性淀粉1％，酵母膏0.2％，MgSO4·7H2O0.05％、CaCO30.7％的培养基中接种保藏号为CGMCC NO.0703的不吸水链霉菌，24℃摇床震荡培养，转速为220转/分钟，先培养45小时，再按10％的接种量接种到相同的培养基中再培养80小时。
实例2
本实例采用液体深层发酵方法进行抗生素生物发酵培养。
在含黄豆饼粉5％、葡萄糖1％，可溶性淀粉2％，蛋白胨0.2％，NaCl0.2％，(NH4)2SO4·7H2O 0.25％，MgSO4·7H2O 0.05％、K2HPO40.02％、CaCO30.8％的培养基中接种保藏号为CGMCC NO.0703的不吸水链霉菌，34℃液体深层发酵培养，搅拌转速为220转/分钟，通气1∶0.9，罐压0.10Mpa，培养45小时。
实例3本实例是对抗生素的生物活性检测将3ml PDA固体培养基置于15×150mm试管中，灭菌后摆放成3.5cm长的斜面；于斜面上接种巨大芽孢杆菌ACCC10008，28℃培养1天，用50ml带玻璃珠的无菌水将斜而上的菌体洗下，并将菌体打散混匀，制成菌悬液，按1-5％的加量将菌悬液加至PDA培养基中，于直径15厘米的培养皿中倒入该PDA菌液60-100毫升，同时，用滤纸过滤实例1或实例2的培养液，收集滤液用于测定，待含有ACCC10008的PDA平板凝同后，用管碟法测定样品的抑菌活性。
实例4本实例是抗生素的分离和纯化。
从实例1和实例2收集的发酵培养物，分别用0.5-1％草酸酸化到pH2.5，搅拌后静置过夜，过滤；滤液经颗粒活性炭柱脱色，活性碳流出液用732#阳离子树脂柱吸附，先用水洗脱，再用0.5N氨水洗脱，流速2ml/分钟，当流出液pH值大于7.0后开始接收，浓缩接收液到原体积的1/10-1/20(30-50ml)；再过中性氧化铝柱脱色，先用水洗脱，再用3％氨水洗脱，收集活性高的流出液深缩至干；干粉用少量水(1-5毫升)溶解，上LH-20葡聚糖凝胶柱，用蒸馏水洗脱，流速1ml/分钟，收集活性高的流出液浓缩到干，即得粗品；粗品经葡聚糖凝柱G-25柱层析，水洗脱，洗脱速度1ml/分钟，经HPLC检测后将主要成分含量在75％以上部分合并，冷冻干燥后再经HPLC半制备柱进行制备，制备后可得到含抗生素86％的精制品。经常规分析，本发明的抗生素的理化性质冷干物为微黄色粉末，易吸潮，熔点239℃(碳化)，极易溶于水，微溶于甲醇，不溶于丙酮、氯仿、吡啶等有机溶剂。
实例5本实例是对本发明的抗生素的结构鉴定。
根据高分辨质谱，确定抗生素的分子量为443(见图2)，元素分析表明，本发明抗生素分子中含有C，H，N及O原子(C31.94％，H4.73％，N11.7％)，根据氮规则，推算其分式为C13H21N3O14紫外吸收光谱显示出典型的核苷类抗生素的特征吸收峰(单峰)λmax(H2O)269.4nm，λmax(0.1NNaOH)265.8nm，λmax(0.1N HCL)275.0nm。经过各种光谱的综合分析，比较本发明的抗生素和胞苷碳原子化学位移后，确定本发明抗生素的化学结构为具有一含过氧键侧链的氮取代胞苷，本发明抗生素与胞苷碳原子化学位移对照如下


本发明抗生素 胞苷

红外光谱3350cm-1处非平滑的宽峰说明本发明抗生素A中除存在-NH-外，还有羟基存在(图3)。本发明抗生素的分子式为C13H21N3O14，不饱和度为5，故-NH-上所连-C4H9O9为饱和侧链。从碳谱(图4、5)中可得出该侧链上的碳原子信息，其化学位移(ppm)分别为58.3(-CH-)，55.9(-CH-)，52.1(-CH2-)，35.5(-CH3-)，根据氢谱(图6DMSO，图7 D2O交换)可得出活泼氢的信息，低场9ppm处为过氧键上所连氢(C-O-O-H)的化学位移，而红外光谱中839cm-1、1134cm-1两个吸收峰也提示有过氧键的存在。综合以上信息，得出侧链的结构为

综合以上结论，本发明抗生素的结构式如附图1(a)。图1(b)为杀稻菌素S(Blasticidin S)结构。图1(c)为多氧霉素(Polyoxins)结构图。其中多氧霉素结构图中的R1、R2、R3数值见下表PolyoxinR1R2R3A CH2OH OHB CH2OH OHOHD COOH OHOHE COOH OHHF COOHOHG CH2OH OHHH CH3OHJ CH3OHOHK H OHL HOHOHM HOHH实例6本实例是本发明抗生素的毒性试验。
将含量为10000微克/毫升的本发明抗生素的浓缩液用于进行毒性试验，根据天津市化学品毒性检定所的试验结果，本发明的抗生素对大鼠急性经口毒性最大耐受量，LD50＞5000mg/kg，属低毒；对大鼠急性经皮毒性最大耐受量LD50＞2000mg/kg，属低毒；对家兔眼刺激试验，其眼刺激强度无刺激性级，对家兔急性皮肤试验，其皮肤刺激强度属无剌激性级。安全可靠。
实例7本实例为本发明的田间农作物应用实施例。
将实例1收集的发酵培养物经过滤得到滤液，减压浓缩至原液的1′5倍，浓缩温度为65℃，浓缩液本发明抗生素为含量10000微克/毫升，用于防治黄瓜白粉病、番茄叶霉病、油菜菌核病和草霉灰霉菌。
(1)防治黄瓜的白粉病黄瓜白粉病(Spharotheca fuliginea)是黄瓜主要病害之一，一般造成减产10-20％，严重的达50％以上。浓缩液用150倍的水稀释喷雾，每亩喷200斤水，防治效果为91.46％，同时使用的化学农药粉锈宁稀释500倍，防治效果96.36％。
(2)防治番茄叶霉病番茄叶霉病(Cladosporium fulvum)是番茄主要病害之一。浓缩液分别用200倍、250倍的水稀释后喷雾，每亩喷200斤水，防治效果分别为86.93％、83.07％，使用的对照农药为75％代森锰锌用300倍水稀释，防治效果63.41％。
(3)防治油菜菌核病油菜菌核病(Sclerotinia sclerotiorum)是油菜最主要病害，一般造成减产11-73％，含油量降低1-5％。将浓缩液用水稀释100倍、150倍、200倍，在油菜盛花期喷雾防治油菜菌核病，喷药1次，每亩喷150斤水，防治效果分别为82.6％、78.1％、69.8％；同时使用的化学农药36％粉霉灵悬浮剂100ml/667m2、40％治萎灵可湿性粉剂60g/667m2，防治效果分别为94.4％和66.1％。
(4)防治草莓灰霉病草莓灰霉病是草莓主要病害之一。用浓缩液稀释100倍防治草莓灰霉病，在草莓发病初期喷药，每亩喷100斤水，防治效果为65.37％。
权利要求
1.一种抗生素，其特征在于具有-C4H9O9侧链的氮取代胞苷、分子式为C13H21N3O14的抗生素，其分子结构式为
2.按照权利要求1所述的抗生素，其特征在于分子结构为
3.权利要求1所述的抗生素的制备方法，包括以下步骤(1)抗生素生物发酵培养将有机碳源、有机氮源、速效碳源、无机氮源、无机盐以及水和不吸水链霉菌加入到容器中，培养不吸水链霉菌，在20-34℃下进行一级发酵、两级发酵或三级发酵，一级发酵时间45-100小时，两级发酵时间分别为16-45小时、30-80小时，三级发酵时间分别为16-45小时、16-45小时、30-80小时，得到抗生素含量为1000-3500微克/毫升的培养物；培养方法采用转速为90-300转/分的摇床震荡培养或者采用液体深层发酵培养罐压维持0.02-0.10MPa、风量比为1∶0.15-1∶1，搅拌转速为50-300转/分钟；接种量为2-15％(V/V)，所述的有机碳源为1-5％、有机氮源为0.2-5％、速效碳源0.5-4％、无机氮源0.2-1.5％、无机盐0.01-1.0％，以上百分数以水的重量为100计。(2)抗生素的分离将步骤(i)收集的含抗生素的培养物，用草酸酸化到pH值为2.0，搅拌后静置12-24小时后过滤，滤液经颗粒活性炭粒脱色，活性炭柱流出液再用732#阳离子树脂吸附，先用水先脱，再用0.5N氨水洗脱，流速0.5-3ml/分钟，当流出液pH值大于7.0后开始接收，浓缩接收液至原体积的1/10-1/20，再经中性氧化铝柱脱色，先用水洗脱，再用氨水洗脱，收集活性高的流出液浓缩至干，干粉用1-5毫升水溶解后上LH-20葡聚糖凝胶柱，用蒸馏水洗脱，流速0.5-1.5ml/分钟，收集活性高的流出液浓缩至干，即得到抗生素含量为30-45％的粗制品。(3)抗生素的纯化将步骤(2)得到的粗制品经葡聚糖凝胶G-25柱层析，水洗脱，流速为0.5-1.5ml/分钟，经高压液相色谱(HPLC)检查后将主要成份量在75％以上部分合并，然后冷冻干燥，再经HPLC半制备柱进行制备，得到抗生素含量达70-86％精制品。
4.按照权利要求3所述的方法，其特征在于步骤(1)所述的不吸水链霉菌包括不吸水链霉菌黄山变种(Streptomyces ahygroscopicus var.huangsanensis)。
5.按照权利要求3所述的方法，其特征在于步骤(1)所述的有机碳源包括玉米粉、糊精、山芋淀粉，可溶性淀粉、小麦粉；所述的有机氮源包括黄豆粉、花生饼粉、棉籽饼粉、菜籽饼粉、黄豆饼粉、蚕蛹粉、酵母粉、酵母膏、鱼粉、蛋白胨，所述的速效碳源包括麦芽糖、葡萄糖、蔗糖，所述的无机氮源包括硝酸铵、硫酸铵、氯化铵、硝酸钠、硝酸钾，所述的无机盐包括硫酸镁、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、碳酸钙、氯化钠。
6.权利要求1所述的抗生素应用方法，其特征在于含抗生素的不吸水链霉菌的发酵培养物、粗制品或精制品，用于防治农作物真菌病害可直接使用或添加助剂或与其它农药混合使用，使用时用水稀释至使用浓度为25-200微克/毫升。
7.按照权利要求6所述的应用方法，其特征在于含抗生素为1000-3500微克/毫升的不吸水霉菌的发酵培养物，田间应用时，发酵培养物要经过滤且在40-70℃下减压浓缩得到浓缩液或喷雾干燥制成干粉，对叶、茎病害，用浓缩液重量的100-400倍的水稀释浓缩液，得到的药液进行喷雾，蔬菜病害喷2-3次，间隔期7-10天；对种传病害，用50-100倍水稀释后的药液浸种1-24小时；对苗床、营养钵，用100-250倍水稀释后的药液进行土壤消毒；对土传病毒，用100-250倍水稀释的药液灌根；对果树茎部病害直接用浓缩液对患部进行涂抹。
全文摘要
本发明是一种抗生素，其特点是通过培养不吸水链霉菌(Streptomyces ahygroscopicus)，再从其发酵液中分离、纯化提取物，得到具有－C
文档编号C12P19/38GK1436787SQ0210087
公开日2003年8月20日 申请日期2002年2月4日 优先权日2002年2月4日
发明者曾洪梅, 石义萍, 张克诚, 张震霖, 林德炘, 刘泽银 申请人:中国农业科学院植物保护研究所