胚胎造血干、祖细胞悬液及其制备方法和应用的制作方法

专利名称：胚胎造血干、祖细胞悬液及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明胚胎造血干、祖细胞悬液及其制备方法和应用，涉及的是利用现代生物技术分离提取制备胚胎优质超剂量造血干、祖细胞及其方法，它可应用于临床造血干、祖细胞移植，治疗相关的血液病、遗传病肿瘤以及放化疗引起的免疫功能损伤等的一种生物制品。
胚胎发育的早期，胎骨髓尚无造血功能，在胚胎发育过程中逐渐形成造血功能，并逐渐增强最终代替肝脏造血，胎龄在22周前胎骨髓造血干、祖细胞的相对总数较少，其临床意义不大，22周后随着胎龄的增加，胎骨髓中造血干、祖细胞相对总数和胎肝中的造血干、祖细胞数都相应的增加。脾脏相对于肝脏而言重量较轻，体积较小，造血干、祖细胞相对总数较少，可分离提取，亦可忽略不记。
胚胎造血干、祖细胞悬液是由胎龄为22周以上的胎骨髓造血干、祖细胞悬液和胎肝造血干、祖细胞悬液两部分构成。
胚胎造血干、祖细胞制备方法将孕妇水囊引产自愿捐赠并经公证的死胎娩出后，置于0°-10℃保存；1-16h内送至实验室；在无菌条件下先从胎心中抗凝抽取胎血标本，供血型和HLA抗原检测，然后分别解剖取出相关胎骨(股、肱、胫、腓、桡、尺等骨)、胎肝，置于培养液中，0-10℃保存。
A、胎骨髓造血干、祖细胞悬液的制备(1)用骨钳、骨剪和解剖刀剪将胎骨去骨膜和两端的软骨；(2)用吸有抗凝剂的培养液注射器，将针头分别插入两端的骨疏松质中，加压将骨髓冲至收集瓶中；(3)用骨剪从长骨的中段剪断，并将注射器针头插至骨髓腔中反向加压冲洗，直至骨质中的骨髓细胞基本冲出为止，冲洗培养液约为20-80ml，视其胎龄大小而定；(4)将收集瓶中的骨髓细胞悬液，经300-500目筛网过滤；
(5)计量骨髓细胞悬液原液；(6)取上述适量骨髓细胞原液，经红细胞裂解在显微镜下统计有核细胞相对总数；(7)经苔酚蓝染色统计死活细胞比例；(8)将等量淋巴细胞分离液置于试管下层，等量胎骨髓细胞原液置于淋巴细胞分离液上层；(9)将上述试管置于离心机中进行密度梯度离心；(10)将试管界面层的单个核细胞(MNC)吸至另一试管中，力求吸尽为宜；(11)向试管中加培养液稀释吹吸混匀；(12)经1000-1500r/15-10min离心，弃上清液收集细胞；(13)吹散细胞并加培养液稀释混匀，重复上述过程，洗涤2-3次；(14)将全部细胞收集于一个试管中，制成浓缩的单个核细胞悬液；(15)取适量上述悬液，经梯度稀释和红细胞裂解，计算单个核细胞总数和死细胞百分率；(16)取适量单个核细胞置于培养液中，0-10℃保存，作CD34+CD38+和CD34+CD38-抗原检测；(17)取适量细胞悬液作生物污染检测；(18)其余细胞根据临床需要取出所需数量的细胞悬液置于细胞培养液中供临床造血干、祖细胞移植；(19)剩余细胞悬液以适当体积浓度的细胞冻存液，混匀装入冷冻管中；(20)以每分钟下降2-3℃的速率将冻存管最终置于液氮中保存。为了避免造血干、祖细胞在制备单个核细胞悬液过程中的丢失，胎骨髓细胞悬液，可将红细胞裂解后直接供临床细胞移植使用或按上述比例进行液氮保存。
B、胎肝造血干、祖细胞悬液的制备(1)用解剖剪去除胎肝系膜组织和胆囊及大血管；(2)将胎肝置于200-300目不锈钢滤网上，用机械解离法通过边挤压边加培养液冲冼，将解离的细胞收集在烧杯中，胎肝和稀释冲冼培养液重量之比要适当。
(3)将解离过滤的细胞悬液再经300-500目不锈钢过滤网过滤；(4)将上述细胞悬液按等量淋巴细胞分离液置于试管下层，等量上述胎肝细胞悬液，小心轻放置于淋巴细胞分离液上层；(5)将上述试管置于离心机中进行密度梯度离心；(6)将经密度梯度离心试管中的单个核细胞层中细胞吸移至另一试管里混匀；(7)向试管中加培养液稀释吹吸混匀；(8)经1000-1500r/15-10min离心弃上清液收集细胞制成悬液并向试管中加培养液稀释，离心洗涤2-3次；(9)将全部细胞收集于一个试管中计算体积，制成浓缩的单个核细胞悬液；(10)取适量上述细胞悬液，经梯度稀释和红细胞裂解，计算单个核细胞总数和死细胞百分率；(11)取适量单个核细胞置于培养液中，0-10℃保存，作CD34+CD38+和CD34+CD38-抗原检测；(12)取适量细胞悬液作生物污染检测；(13)其余细胞与适当体积浓度的细胞冻存液混匀，装入冷冻管中；(14)以每分钟下降2-3℃的速率将冻存管最终置于液氮中保存。
本发明与现有技术相比具有的有益效果和优点(1)从发育分化的概念上相比，本发明所提供的优质超剂量造血干、祖细胞处于成骨髓、成外周血和脐血的前期，所以抗原分化较弱，因此移植排斥反应较轻；(2)以CD34+CD38-在CD34+细胞中的比例为造血干、祖细胞的质量标准，从表1可以看出，胚胎中的造血干、祖细胞质量最高；(3)以1000ml中的脐血中的造血干、祖细胞数为比较标准，从表2可以看出，22周后的胚胎中的造血干、祖细胞数量是相当巨大的；(4)近年许多研究表明CD34-细胞较CD34+细胞具有更强大的长期造血能力，可能为CD34+细胞的前体细胞，通过红细胞裂解后的胎骨髓有核细胞(NC)悬液，能将胎骨髓中的CD34-保存下来，从分化发育的角度分析，胎骨髓中CD34-细胞数远高于成骨髓、成外周血、或脐血中的CD34-
细胞数；(5)据报道，作为造血干细胞临床移植物决非越纯越好，近乎天然骨髓中各类造血和间质细胞可能是最佳的移植物，所以，本发现提供的22周以上胎骨髓，造血干、祖细胞及其它细胞易于在受体骨髓中归巢，因为造血干细胞的生存必须依赖其周围的祖细胞、淋巴、巨噬细胞、成纤维细胞、内皮细胞和其它各种间质细胞构成的微环境，胎骨髓的微环境与受体骨髓的微境相近；(6)胚胎骨髓细胞悬液中含有骨髓间质干细胞，间质干细胞具有多向分化潜能，它不仅具有向造血干细胞分化的潜能，而且还具有向神经、骨骼、肌肉等系统分化的潜能。
(7)通过胎骨髓造血干、祖细胞移植为先导，受体对供体的细胞产生一定的耐受以后，相继进行多次胎肝同基因的造血干、祖细胞移植，当受体对供体移植耐受诱导完成后，供体造血干细胞具有强力骨髓清扫作用，最终有可能使受体转为完全供者型造血嵌合体；(8)从可行性上相比，本发明提供的成品，所化费用最少，方法最易，成效最大。
A、胎骨髓造血干、祖细胞悬液的分离和制备(1)用骨钳、骨剪和解剖刀剪将胎骨去骨膜和两端的软骨；(2)用吸有抗凝剂的培养液注射器，将针头分别插入两端的骨疏松质中，加压将骨髓冲至收集瓶中；(3)用骨剪从长骨的中段剪断，并将注射器针头插至骨髓腔中反向加压冲洗，直至骨质中的骨髓细胞基本冲出为止，冲洗培养液约为20-80ml，视其胎龄大小而定；(4)将收集瓶中的骨髓细胞悬液，经300目筛网过滤；(5)计量骨髓细胞悬液原液；(6)取适量骨髓细胞原液，经红细胞裂解，在显微镜下统计有核细胞相对总数；(7)经苔酚蓝染色统计死活细胞比例；(8)将等量淋巴细胞分离液置于试管下层，等量胎骨髓细胞原液置于淋巴细胞分离液上层；(9)将上述试管置离心机中2500r/30min密度梯度离心；(10)将试管中界面层的单个核细胞(MNC)吸至另一试管中，力求吸尽；(11)向试管中加培养液稀释吹吸混匀；(12)经1500r/10min离心弃上清液收集细胞；(13)吹散细胞并加培养液稀释混匀重复上述过程洗涤3次；
(14)将全部细胞收集于一个试管中制成浓缩的单个核细胞悬液；(15)取上述适量悬液经梯度稀释和红细胞裂解，计算单个核细胞总数和死细胞百分率；(16)取适量单个核细胞悬液置于培养液中4℃保存，作CD34+CD38+和CD34+CD38-抗原检测；(17)取适量细胞悬液作生物污染检测；(18)其余细胞根据临床需要取出所需数量的细胞悬液置于细胞培养液中供临床造血干、祖细胞移植；(19)剩余细胞悬液与等体积细胞冻存液混匀，装入冷冻管中；(冻存液配方羟乙基淀粉12％，二甲亚砜10％，O型脐血血清16％)(20)以每分钟下降3℃的速率将冻存管的细胞最终置于液氮中保存，为了避免造血干、祖细胞在制备MNC悬液过程中的丢失，胎骨髓细胞悬液，可将红细胞裂解后直接供临床细胞移植使用或液氮保存。
B、胎肝造血干、祖细胞悬液的分离和制备(1)用解剖剪钳去除胎肝系膜组织和胆囊及大血管；(2)将胎肝置于300目不锈钢滤网上，用机械解离法通过边挤压边加培养液冲冼，将解离过滤的细胞收集在烧杯中，胎肝和稀释冲冼培养液重量之比为1∶4；(3)将解离过滤的细胞悬液再经500目不锈钢过滤网过滤；(4)将上述细胞悬液按等量淋巴细胞分离液置于试管下层，等量上述胎肝细胞悬液小心轻放置于淋巴细胞分离液上层；
(5)将上述试管置于离心机中2500r/30min密度梯度离心；(6)将经密度梯度离心试管中的单个核细胞层中的细胞吸移至另一试管里混匀；(7)向试管中加培养液稀释吹吸混匀；(8)经1200r/15min离心，弃上清液，收集细胞制成悬液，并向试管中加培养液稀释离心洗涤3次；(9)将全部细胞收集于一个试管中计算体积，制成浓缩的单个核细胞悬液；(10)取适量上述细胞悬液经梯度稀释和红细胞裂解计算单个核细胞总数和死细胞百分率；(11)取适量MNC置于培养液中4℃保存，作CD34+CD38+和CD34+CD38-抗原检测；(12)取适量细胞悬液作生物污染检测；(13)其余细胞悬液与等体积细胞冻存液混匀，装入冷冻管中；(冻存液配方羟乙基淀粉12％，二甲亚砜10％，O型脐血血清16％)(14)以每分钟下降3℃的速率将冻存管的细胞最终置于液氮中保存。
采用本发明上述胚胎造血干、祖细胞制备方法从胎肝和四肢长骨中分离制备的造血干、祖细胞，其中CD34+细胞总数相当于5700ml脐血中的细胞总数，CD34+CD38-即造血干细胞总数相当于30000ml中的细胞总数。若以2×105/kg受体造血干、祖细胞移植量计算可供285kg受体需要。
实施例二胎重1601kg(胎肝重70g，脾重约5.4g)将胎龄在22周以上经水囊引产的死胎娩出后置于10℃保存，3h内送至实验室，在无菌条件和20℃室温中，先从胎心中抗凝抽取胎血标本供血型和HLA抗原检测，然后分别解剖取出相关胎骨、胎肝、置于培养液中，4℃保存。
A、胎骨髓造血干、祖细胞悬液的分离和制备(1)用骨钳、骨剪和解剖刀剪将胎骨去骨膜和两端的软骨；(2)用吸有抗凝剂的培养液注射器，将针头分别插入两端的骨疏松质中，加压将骨髓冲至收集瓶中；(3)用骨剪从长骨的中段剪断，并将注射器针头插至骨髓腔中反向加压冲洗，直至骨质中的骨髓细胞基本冲出为止，冲洗培养液约为50ml，视其胎龄大小而定；(4)将收集瓶中的骨髓细胞悬液，经300目筛网过滤；(5)计量骨髓细胞悬液原液；(6)取适量骨髓细胞原液，经红细胞裂解，在显微镜下统计有核细胞相对总数；(7)经苔酚蓝染色统计死活细胞比例；(8)将等量淋巴细胞分离液置于试管下层，等量胎骨髓细胞原液置于淋巴细胞分离液上层；(9)将上述试管置离心机中2500r/30min密度梯度离心；(10)将试管中界面层的单个核细胞(MNC)吸至另一试管中，力求吸尽；
(11)向试管中加培养液稀释吹吸混匀；(12)经1000r/15min离心弃上清液收集细胞；(13)吹散细胞并加培养液稀释混匀重复上述过程并洗涤3次；(14)将全部细胞收集于一个试管中制成浓缩的单个核细胞悬液；(15)取上述适量悬液经梯度稀释和红细胞裂解，计算单个核细胞总数和死细胞百分率；(16)取适量单个核细胞悬液置于培养液中0-℃保存，作CD34+CD38+和CD34+CD38-抗原检测；(17)取适量细胞悬液作生物污染检测；(18)其余细胞根据临床需要取出所需数量的细胞悬液置于细胞培养液中供临床造血干、祖细胞移植；(19)剩余细胞悬液与等体积细胞冻存液混匀，装入冷冻管中；(冻存液配方羟乙基淀粉12％，二甲亚砜10％，O型脐血血清16％)(20)以每分钟下3℃的速率将冻存管的细胞最终置于液氮中保存，为了避免造血干、祖细胞在制备MNC悬液过程中的丢失，胎骨髓细胞悬液，可将红细胞裂解后直接供临床细胞移植使用或液氮保存。
B、胎肝造血干、祖细胞悬液的分离和制备(1)用解剖剪钳去除胎肝系膜组织和胆囊及大血管；(2)将胎肝置于200目不锈钢滤网上，用机械解离法通过边挤压边加培养液冲冼，将解离过滤的细胞收集在烧杯中，胎肝和稀释冲冼培养液重量之比要适当；
(3)将解离过滤的细胞悬液再经500目不锈钢过滤网过滤；(4)将上述细胞悬液按等量淋巴细胞分离液置于试管下层，等量上述胎肝细胞悬液小心轻放置于淋巴细胞分离液上层；(5)将上述试管置于离心机中2500r/30min密度梯度离心；(6)将经密度梯度离心试管中的单个核细胞层中的细胞吸移至另一试管里混匀；(7)向试管中加培养液稀释吹吸混匀；(8)经1500r/10min离心，弃上清液，收集细胞制成悬液，并向试管中加培养液稀释离心洗涤3次；(9)将全部细胞收集于一个试管中计算体积，制成浓缩的单个核细胞悬液；(10)取适量上述细胞悬液经梯度稀释和红细胞裂解计算单个核细胞总数和死细胞百分率；(11)取适量MNC置于培养液中10℃保存，作CD34+CD38+和CD34+CD38-抗原检测；(12)取适量细胞悬液作生物污染检测；(13)其余细胞悬液与等体积细胞冻存液混匀，装入冷冻管中；(冻存液配方羟乙基淀粉12％，二甲亚砜10％，O型脐血血清16％)(14)以每分钟下降2℃的速率将冻存管的细胞最终置于液氮中保存。
采用本发明上述胚胎造血干、祖细胞制备方法从胎肝和四肢长骨中分离制备的造血干、祖细胞其中，CD34+细胞总数相当于6900ml脐血中的细胞总数，CD34+CD38-即造血干细胞总数相当于11000ml中的细胞总数。若以2×105/kg受体造血干、祖细胞移植量计算可供345kg受体需要。
表一胚胎造血干、祖细胞质量分析比较

*.引自中华血液学杂志1996 vol 17 P17表二胚胎造血干、祖细胞数量分析比较

*脐血1000ml中CD34-总细胞数为1×107CD34+38-总细胞数为1×106引自现代血液病输血疗法 上海医科大学出版社2000P27权利要求
1.一种胚胎造血干、祖细胞悬液，其特征是一种胎龄为22周以上含有优质超剂量的胚胎造血干、祖细胞，胚胎造血干、祖细胞悬液包括胎骨髓造血干、祖细胞悬液和胎肝造血干、祖细胞悬液。
2.一种胚胎造血干、祖细胞悬液的制备方法，其特征是将胎龄在22周以上经水囊引产的死胎娩出后置于0-10℃保存，1-16h内送至实验室，在无菌条件和10-20℃室温中，先从胎心中抗凝抽取胎血样本供血型和HLA抗原检测，然后分别解剖取出相关胎骨、胎肝、置于培养液中，0-10℃保存。A、胎骨髓造血干、祖细胞悬液的分离和制备(1)用骨钳、骨剪和解剖刀剪将胎骨去骨膜和两端的软骨；(2)用吸有抗凝剂的培养液注射器，将针头分别插入两端的骨疏松质中，加压将骨髓冲至收集瓶中；(3)用骨剪从长骨的中段剪断，并将注射器针头插至骨髓腔中反向加压冲洗，直至骨质中的骨髓细胞基本冲出为止，冲洗培养液约为20-80ml，视其胎龄大小而定；(4)将收集瓶中的骨髓细胞悬液，经300-500目筛网过滤；(5)计量骨髓细胞悬液原液；(6)取适量骨髓细胞原液，经红细胞裂解，在显微镜下统计有核细胞相对总数；(7)经苔酚蓝染色统计死活细胞比例；(8)将等量淋巴细胞分离液置于试管下层，等量胎骨髓细胞原液置于淋巴细胞分离液上层；(9)将上述试管置离心机中进行密度梯度离心；(10)将试管中界面层的单个核细胞(MNC)吸至另一试管中，力求吸尽；(11)向试管中加培养液稀释吹吸混匀；(12)经1000-1500r/15-10min离心弃上清液收集细胞；(13)吹散细胞并加培养液稀释混匀重复上述过程洗涤2-3次；(14)将全部细胞收集于一个试管中制成浓缩的单个核细胞悬液；(15)取上述适量悬液经梯度稀释和红细胞裂解，计算单个核细胞总数和死细胞百分率；(16)取适量单个核细胞悬液置于培养液中0-10℃保存，作CD34+CD38+和CD34+CD38-抗原检测；(17)取适量细胞悬液作生物污染检测；(18)其余细胞根据临床需要取出所需数量的细胞悬液置于细胞培养液中供临床造血干、祖细胞移植；(19)剩余细胞悬液与适当浓度细胞冻存液混匀，装入冷冻管中；(20)以每分钟下降2-3℃的速率将冻存管的细胞最终置于液氮中保存，为了避免造血干、祖细胞在制备MNC悬液过程中的丢失，胎骨髓细胞悬液，可将红细胞裂解后直接供临床细胞移植使用或液氮保存。B、胎肝造血干、祖细胞悬液的分离和制备(1)用解剖剪钳去除胎肝系膜组织和胆囊及大血管；(2)将胎肝置于200-300目不锈钢滤网上，用机械解离法通过边挤压边加培养液冲冼，将解离过滤的细胞收集在烧杯中，胎肝和稀释冲冼培养液重量之比要适当；(3)将解离过滤的细胞悬液再经300-500目不锈钢过滤网过滤；(4)将上述细胞悬液按等量淋巴细胞分离液置于试管下层，等量上述胎肝细胞悬液小心轻放置于淋巴细胞分离液上层；(5)将上述试管置于离心机中进行密度梯度离心；(6)将经密度梯度离心试管中的单个核细胞层中的细胞吸移至另一试管里混匀；(7)向试管中加培养液稀释吹吸混匀；(8)经1000-1500r/15-10min离心，弃上清液，收集细胞制成悬液，并向试管中加培养液稀释离心洗涤2-3次；(9)将全部细胞收集于一个试管中计算体积，制成浓缩的单个核细胞悬液；(10)取适量上述细胞悬液经梯度稀释和红细胞裂解计算单个核细胞总数和死细胞百分率；(11)取适量MNC置于培养液中0-10℃保存，作CD34+CD38+和CD34+CD38-抗原检测；(12)取适量细胞悬液作生物污染检测；(13)其余细胞以适当浓度与细胞冻存液混匀，装入冷冻管中；(14)以每分钟下降2-3℃的速率将冻存管的细胞最终置于液氮中保存。
3.根据权利要求1和2所述的胚胎造血干、祖细胞悬液在制备临床造血干、祖细胞移植，治疗相关的血液病、遗传病、肿瘤以及放化疗引起的免疫功能损伤生物制品中的应用。
全文摘要
本发明胚胎造血干、祖细胞悬液及其制备方法和应用,涉及的是利用现代生物技术分离提取制备胚胎优质超剂量造血干、祖细胞悬液及其制备方法,它可应用于临床造血干、祖细胞移植,治疗相关的疾病和损伤。该生物制品是从健康孕妇自愿捐赠并经公证,胎龄在22周以上水囊引产的的死胎中分离提取的,它由胎骨髓造血干祖细胞悬液和胎肝造血干、祖细胞悬液两部分构成,死胎娩出后,置于0－10℃环境中保存,在1－16内通过无菌操作,先从胎儿心脏中抽取胎血,供相关检测,然后解剖取其胎骨和胎肝,分别置于0－10℃的培养液中保存,在1－12h内分别从中分离提取含有胚胎造血干祖细胞的悬液,调整细胞浓度,分别供相关检测和临床造血干祖细胞移植,其余,冻存备用。
文档编号C12Q1/02GK1364874SQ0211266
公开日2002年8月21日 申请日期2002年2月9日 优先权日2002年2月9日
发明者黄斌, 黄宁, 黄裕权, 付中苓, 潘欣, 彭蕾, 孙俊 申请人:黄斌, 黄宁, 黄裕权